Del 1: Echinacoside øker sædmengden hos rotter ved å målrette den hypothalamus androgenreseptoren
Mar 05, 2022
Ansvarlig: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2
Pls klikk her til del 2
Mannlig infertilitet er et stort helseproblem med en estimert utbredelse på 4,2% av mannlig infertilitet over hele verden. Vårt tidlige arbeid viste atCistanche ekstrakterbeskytte mot sædskader hos mus, og atechinacoside(ECH) er en av de viktigste aktive komponentene. Her rapporterer vi en viktig rolle for ECH, et naturlig produkt som reverserer eller beskytter mot oligoasthenospermia hos rotter. ECH ble analysert av HPLC, mengden og kvaliteten på sæden ble evaluert og hormonnivået ble bestemt av radioimmunosorbentanalyse. ECH reduserte nivåene av androgenreseptor (AR) og viktige steroidogene relaterte gener som bestemt av vestlig blolot- og qPCR-analyse. Samspillet mellom ECH og AR ble evaluert ved indirekte ELISA og molekylær dokking. Resultatene viser at ECH kombinert med hypothalamus AR i lommen på Met-894 og Val-713 for å hemme overføringen av AR fra cytoplasma til kjerner i hypothalamus. Mens negativ tilbakemelding av kjønnshormon regulering ble hemmet, positive tilbakemeldinger ble stimulert for å øke sekresjonen av luteiniserende hormon og testosteron senere forbedre mengden sperm. Samlet viser disse dataene at ECH blokkerer AR-aktivitet i hypothalamus for å øke mengden sæd og beskytte mot oligoasthenospermia hos rotter.
Produksjonen av testosteron i testikkelceller er sterkt regulert av hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen (HPG) ved å danne en homeostatisk feedback loop1. Gonadotrophin-frigjørende hormon (GnRH), utskilt av hypothalamus, kan stimulere sekresjonen av luteiniserende hormon (LH) fra hypofysen, som ytterligere stimulerer testosteron produksjon i testikulære Leydig celler. Testosteron er biosyntetisert av en rekke steroidogene enzymer. Som en av de viktigste veiene, steroidogen akutt regulatorisk (StAR) protein kan transportere kolesterol fra intracellulære kilder inn i mitokondriene2 hvor det er utsatt for kolesterol side-kjeden spalting enzym (CYP11A1), 3β-hydroksysteroid dehydrogenase (HSD3β), 17α-hydroksylase (CYP17A1) og 17β-hydroksysteroid dehydrogenase (HSD 17β) som katalyserer konverteringen av kolesterol til testosteron3,4. Testosteron deretter negativt strømmer tilbake til HPG-elementet for å ned-regulere ytterligere LH sekresjon på en doseavhengig måte.
Effekten av testosteron på HPG-aksen feedback loop oppstår ved binding til androgen reseptoren (AR), funnet i både hypothalamus og hypofysen 5. I musene fører ablasjon av AR og minimal testosteronproduksjon til at nivåene av LH og follikkelstimulerende hormon (FSH) øker6, noe som tyder på at AR deltar i reguleringen av den negative fôrsløyfen. Den klassiske genomiske mekanismen for testosteron signalering oppstår når testosteron diffuserer inn i cellen og binder seg til AR. Dette ligand-reseptorkomplekset translokaliserer deretter til kjernen der det binder seg til androgenresponselementer (AREer) i reguleringsregionene av testosteron-responsive gener for å endre translokasjonen. Testosteron induserer også den ikke-klassiske banen av steroidhormon handling, preget av raske hendelser som fører til aktivering av cytosoliske signalering kaskader normalt utløst av vekstfaktorer7,8. Klassiske og ikke-klassiske testosteron veier begge bidra til å opprettholde spermatogenese og fruktbarhet. Imidlertid er funksjonen til AR viktigere i den klassiske banen som testosteron virker for å øke sædkvaliteten.
Echinacoside(ECH) er en av de bioaktive komponentene som er avledet fra den medisinske plantearten av Echinacea9 ogCistanche10. Med et bredt spekter av farmakologiske aktiviteter er ekstrakter av Echinacea 1Research Center of Modern Biotechnology, School of Biotechnology and Food Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Kina. 2College of Veterinary Medicine, Northwest A &F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Kina. 3Department av biomedisinske vitenskaper, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada. Korrespondanse og forespørsler om materialer skal rettes til X.Z
en av de mest populære urte kosttilskudd i Europa og USA hovedsakelig på grunn av deres antioksidantegenskaper11 og deres evne til å forhindre forkjølelse12. InteressantCistanche ekstrakter og ECH har tradisjonelt blitt brukt som et tonic middel for å kurere reproduktiv dysfunksjon og for å øke mannlig seksuell aktivitet i tradisjonell kinesisk medisin10. Noen OTC-produkter avCistanche utvinning har blitt utviklet som nærende kosttilskudd og blir stadig mer populært i helsekostmarkedene i Kina og noen andre asiatiske land (China Food and Drug Administration)13. De underliggende mekanismene for ECH-tiltak er imidlertid fortsatt uklare.
Mannlig infertilitet er et stort helseproblem med en estimert utbredelse på 4,2% av mannlig infertilitet over hele verden14. Diagnosen mannlig infertilitet er for tiden basert på studiet av sædkvalitet, inkludert analyse av sædparametere som sædkonsentrasjon, motilitet og morfologi15. Østrogen-etterligne Bisphenol A (BPA) er en utbredt miljøgift som har blitt studert for sin innvirkning på mannlig fruktbarhet hos flere dyrearter og mennesker16. BPA forstyrrer hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen, hemmer uttrykk for testikulære steroidogene enzymer og syntesen av testosteron i hann valper17, forårsaker en tilstand av hypogonadotrop hypogonadisme18. I denne studien undersøker vi effekten av ECH på sædkvalitet og hormonnivåer. I tillegg ble BPA valgt som et sædskademodellmiddel for å studere den beskyttende effekten av ECH mot dårlig sædkvalitet.
Cistanche ekstrakter
Resultater
ECH forbedrer sædmengden. Sædtallene i cauda epididymis, sæd levedyktighet og sædmotilitet presenteres i tabell 1. Behandling med 80 mg/kg ECH og 15 mg/kg testosteronpropionat (TP) økte signifikant epididymal sperm teller. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i sæd levedyktighet og sædmotilitet.
ECH øker testosteron- og LH-nivåene i serum, encefalon + hypofyse og testis. ECH-behandling økte spesielt LH-nivåene i serum, encefalon + hypofyse og testis (fig. 1A). I ECH(H)-gruppen økte LH-nivåene betydelig med 1,1 ganger i serum, 1,4 ganger i encephalon + hypofyse og 1,2 ganger i testis. Testosteron ble betydelig økt med henholdsvis 1,5 og 1,3 ganger i encephalon + hypofyse og testis, men ikke i serum etter ECH (H) behandling. Etter TP-behandling ble testosteronnivået betydelig økt med 1,6, 1,8 og 1,4 ganger i serum, encefalon + hypofyse og testis.
ECH økte steroidogent enzymgenuttrykk. ECH økte signifikant uttrykkene for sentrale steroidogene enzymer i testis (fig. 1B). MRNA-nivåene av CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 og HSD17β i ECH(H)-gruppen ble økt mer enn 3 ganger, mens nivåene av StAR mRNA ikke viste signifikante forskjeller med alle ECH-behandlinger (p > 0,05). TP endret ikke uttrykket for CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 og HSD17β betydelig. Dette gjenspeiles i en omfattende varmekartanalyse av effekten av ECH på steroidogent enzymuttrykk som indikerer at ECH betydelig økte mRNA-nivåene av CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 og HSD17β, og spesielt HSD3β1/2 (fig. 1C).
ECH kan krysse blod-hjerne barrieren og i mindre grad blod-testis barrieren. For å evaluere androgentilbakemeldingssløyfen ved HPG-aksen ble ECH-evnen til å gå inn i hypothalamus evaluert i en rekke PK-studier. ECH-konsentrasjoner ble påvist i hypothalamus etter 12 timers enkelt oral administrering av 30 mg/kg ECH, og ECH viste markert hypothalamus-penetrans med gjennomsnittlig hypothalamus/plasmaforhold på 33,92 % (fig. 2A). T1/2-verdiene var henholdsvis 2,61 ± 0,42 t og 1,88 ± 0,22 timer i plasma og hypothalamus (fig. 2B). Imidlertid ble det oppdaget svært begrenset tilgang til ECH i testis ved hjelp av HPLC. Konsentrasjonene av ECH i testis var henholdsvis 0,083 μg/ml, 0,043 μg/ml og 0,028 μg/ml ved henholdsvis 0,5 timer, 1 t og 1,5 timer etter behandling.
ECH reduserer hypothalamus AR-translokasjon til kjernen. For å teste effekten av ECH på AR-translokasjonen ble uttrykket av AR i cytoplasma og kjernen av testis og hypothalamus bestemt ved hjelp av vestlig blotanalyse. Som vist i Fig. 3A, ECH nedregulert AR protein i hypothalamus kjerner ved fold sammenlignet med kontrollgruppen. Behandling med enzalutamid, en AR-hemmer, reduserte nivåer av AR-protein i hypothalamuskjerner med 4,8 ganger. Spesielt var cytoplasmatisk AR høyere med ECH-behandling og enzalutamidbehandling enn kontroller, noe som tyder på at ECH blokkerer AR-transport fra cytoplasma til kjernen i hypothalamus. Som forventet hemmer ikke ECH AR-transport fra cytoplasma til kjernen i testisene (fig. 3B).
ECH økte uttrykkene til HPG-akserelaterte gener. ECH økte uttrykkene for LHβ, LHR, GnRH 1 og Gnrhr betydelig i blandingsbassengene av encefalon + hypofyse, men det var ingen signifikant forskjell i GnRH 1-nivåer etter TP-behandling. Varmekartanalysen viser at uttrykkene for GnRH 1- og LH-β var høyest blant HPG-akserelaterte gener.
Figur 1. Effekt av ECH på nivåene av LH, testosteron og store steroidogene enzymer. Merk: (A) nivåer av LH i serum, encefalon + hypofyse og testis (mIU / ml, gjennomsnittlig ± SD);
nivåer av T i serum, encefalon + hypofyse og testis (ng / ml, gjennomsnittlig ± SD); (B) uttrykk for store steroidogene enzymer;
(C) hierarkisk klynge av mRNA uttrykk for ulike steroidogene enzymer i testis. Grønne, grønnrøde og røde farger representerer lave,
henholdsvis middels og høy overflod, n = 7. a,b,c Ulike bokstaver angir statistisk forskjellige grupper (p<>
Figur 2. Distribusjon og farmakokinetiske parametere av ECH i hypothalamus. Merknader: (A) hypothalamus/ plasmaforhold (%) ble beregnet basert på plasma- og hypothalamuseksponeringer av ECH (konsentrasjon) ved 0,5 timer, 1,0 t, 1,5 t, 2,0 t, 2,5 timer, 3,0 t, 6,0 t, 9,0 t og 12,0 timer etter oral administrering. (B) Farmakokinetiske (PK) parametere for ECH i plasma og hypothalamus. T1/2, halveringstid; Cmax, toppkonsentrasjon; Vz/F, tilsynelatende distribusjonsvolum; MRT, gjennomsnittlig oppbevaringstid; AUC, område under konsentrasjonstidskurven.
AR er et mål for ECH. For å bekrefte forholdet mellom ECH og AR ble ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) syntetisert (fig. 5A, B). Molekylvekten til ECH-OVA er større enn OVA, så de har forskjellig mobilitetshastighet (fig. 5A), og absorbanstoppen til ECH-OVA er mellom ECH og OVA (fig. 5B),
Cistanche ekstrakter
Skikkelse 3. Efect av ECH på AR transport i testis og hypothalamus. Merknader: (En) Effekt av ECH på AR-transport i hypothalamus. AR-proteinnivåer ble bestemt av vestlig blotanalyse og barer representerer densitometrisk kvantifisering av kjernefysisk AR normalisert til Lamin B og cytoplasmatisk AR normalisert til GAPDH. Hver verdi representerer gjennomsnittlig ± SD for seks uavhengige eksperimenter. a,b,c Diferente bokstaver over stolpene angir statistisk forskjellige grupper (p < 0.05);="">B) Effekt av ECH på AR-transport i testis.
antyder at ECH ble vellykket konjugert til OVA. Indirekte ELISA-resultater (fig. 5C), viser at anti-AR-antistoff er i stand til å oppdage AR-protein tilstede i brønner som inneholder ECH-OVA (indikert av anti-OVA-antistoff) som tyder på at ECH kan binde seg til AR-protein.
ECH kombineres med AR-lomme av Met-894 og Val-713. Sammensatt ECH ble forankret til AF2-stedet på overflaten av den menneskelige AR, og den teoretiske bindingsmodusen til ECH og AR ble vist i fig. 5D. Sammensatt ECH vedtok en kompakt konformasjonsbinding ved lommen til den menneskelige AR. De to fenylgruppene av ECH binder seg til det hydrofobe domenet til AR-lommen og opprettholdt nære hydrofobe kontakter med rester Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737, Met-894 og Ile-898, mens de to andre sidene av ECH ble plassert ved inngangen til lommen og gjorde bare noen få kontakter. Detaljert analyse viste at både Met-894 (bindingslengde: 2,4 Å) og Val-713 (bindingslengde: 2,7 Å) dannet hydrogenbindinger med hydroksy1gruppene i ECH, som var hovedinteraksjonen mellom ECH og human AR.
ECH demper BPA-induserte reproduktive skader. For å undersøke effekten av ECH på reproduktiv skade, ble sædkvaliteten og nivåene av kjønnshormoner og steroidogene enzymer undersøkt hos BPA-induserte mus. Som vist i Fig. 6, BPA behandling betydelig redusert sperm count og sperm motility med 26.5% og 39.2%, henholdsvis. ECH-administrasjon forhindret reduksjonen i sædkvalitet og sædmotilitet med henholdsvis 35,5% og 30,1%. BPA-administrasjonen resulterte også i en betydelig reduksjon i LH- og T-sekresjon, og ECH økte nivåene av LH og T betydelig med henholdsvis 24,1 % og 18,3 %, sammenlignet med BPA-behandling alene (fig. 6A,B). MRNA-nivåene av StAR-, CYP17A1-, 3β-HSD- og 17β-HSD i BPA-ECH-behandling ble betydelig økt sammenlignet med BPA-behandling (fig. 6C,D).
Figur 4. Endringer i HPA-relatert genuttrykk etter ECH-behandling. Merknader: (A-D) barer representerer mRNA-nivåene av LHβ, LHr, Gnrh 1 og Gnrhr i encephalon + hypofyse. a,b,c Ulike bokstaver over stolpene angir statistisk forskjellige grupper (p< 0.05).="" (e)="" hierarchical="" clustering="" of="" mrna="" expression="" of="" different="" steroidogenic="" enzymes.="" green,="" green-red="" and="" red="" colors="" represent="" low-,="" medium-="" and="" high="" abundance,="" respectively,="" n="7." control="" (treated="" with="" normal="" saline="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (treated="" with="" ech="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" group="" (treated="" with="" ech="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (treated="" with="" ech="" 80="" mg/kg),="" tp="" (treated="" with="" tp="" 15="">
