Del 1: Echinacoside hemmer glutamatfrigjøring ved å undertrykke spenningsavhengig Ca2 pluss inngang og proteinkinase C i cerebrokortikale nerveterminaler hos rotter
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 og Su Jane Wang 3,*
Abstrakt:
Det glutamaterge systemet kan være involvert i effekten av nevrobeskyttende terapier.Echinacoside, et fenyletanoidglykosid ekstrahert fra den medisinske kinesiske urtenHerba Cistanche, har nevrobeskyttende effekter. Denne studien undersøkte effekten avechinacosidepå 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring i cerebrokortikale nerveterminaler hos rotter (synaptosomer). Echinakosid hemmet Ca2 pluss-avhengig, men ikke Ca2 pluss-uavhengig, 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring på en konsentrasjonsavhengig måte. Echinakosid reduserte også den 4-aminopyridin-fremkalte økningen i cytoplasmatisk fritt Ca2 pluss-konsentrasjon, men endret ikke det synaptosomale membranpotensialet. Den hemmende effekten av echinacoside på 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring ble forhindret av o-conotoxin MVIIC, en bredspektret blokker av Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) kanaler , men var ufølsom overfor de intracellulære Ca2 pluss frigjøringshemmere dantrolen og 7-klor-5-(2-klorfenyl)-1,5-dihydro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157). Videre reduserte echinacoside den 4-aminopyridin-induserte fosforyleringen av proteinkinase C, og proteinkinase C-hemmere opphevet effekten av echinacoside på glutamatfrigjøring. I følge disse resultatene foreslår vi at den hemmende effekten av echinacoside på fremkalt glutamatfrigjøring er assosiert med redusert spenningsavhengig Ca2 pluss inngang og påfølgende undertrykkelse av proteinkinase C-aktivitet.
Nøkkelord:echinacoside; glutamat frigjøring; cerebrokortikale nerveterminaler; spenningsavhengige Ca2 pluss-kanaler; proteinkinase C
1. Introduksjon
Echinacosideer et viktig fenyletanoidglykosid som er tilstede iHerbaCistanche, en velkjent tradisjonell kinesisk medisin som brukes til å behandle glemsel, impotens og kronisk forstoppelse [1].Echinacosidehar ulike bioaktiviteter som antioksidasjon, anti-inflammasjon, antikreft, leverbeskyttelse og immunmodulering [2–4]. Spesielt har echinacoside nevrobeskyttende effekter; for eksempel kan det beskytte mot oksidativt stress- eller nevrotoksin-indusert nevrotoksisitet i primære rottekortikale nevroner, humane neuroblastom SH-SY5Y-celler og feokromocytom (PC12)-celler [5-8]. Videre demper echinakosid hjerneskade og forbedrer kognitiv funksjon i dyremodeller av Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og okklusjon av midtre hjernearterie [9–12]. Imidlertid mekanismen somechinacosideinduserer nevrobeskyttelse er ikke fullt ut forstått.
Nevrobeskyttelse er en kompleks prosess for å bevare nevronal struktur og funksjon ved giftige fornærmelser. Reduksjon av glutamateksitotoksisitet anses som en potensiell mekanisme involvert i hjernens nevrobeskyttelse. Glutamat, en eksitatorisk aminosyrenevrotransmitter, har en avgjørende rolle i flere hjernefunksjoner [13]. Imidlertid forårsaker overaktivering av glutamatreseptorer under høye glutamatkonsentrasjoner intracellulær Ca2 pluss overbelastning, mitokondriell dysfunksjon, frie radikaler og nevronal død [14,15]. Denne patologiske prosessen er involvert i en rekke hjernesykdommer inkludert cerebral iskemi, traumatisk hjerneskade, epilepsi og nevrodegenerativ sykdom [16,17]. Derfor betraktes hemmere som blokkerer patofysiologisk glutamatergisk overføring som potensielle nevrobeskyttende legemidler. Bemerkelsesverdige eksempler på disse er glutamatreseptorantagonister [18,19]; Imidlertid har kliniske studier for disse legemidlene mislyktes på grunn av mindre effektivitet og uønskede eller til og med cytotoksiske bivirkninger [20,21]. I tillegg til direkte glutamatreseptorblokkering, kan hemming av glutamatfrigjøring være en effektiv strategi for nevrobeskyttelse. Flere nevrobeskyttende midler (f.eks. memantin og riluzol) kan redusere glutamatfrigjøring i rottehjernevev [22–24].
Tatt i betraktning rollen til glutamat i eksitotoksisitet og den nevrobeskyttende profilen til echinacoside, brukte denne studien isolerte nerveterminaler (synaptosomer) renset fra rottens hjernebark for å undersøke effekten av echinacosid på glutamatfrigjøring og utforsket ytterligere potensielle mekanismer. Det isolerte nerveterminalpreparatet er en veletablert modell for å studere den presynaptiske reguleringen av nevrotransmitterfrigjøring av legemidler i fravær av noen postsynaptiske effekter [25]. Ved å bruke denne modellen evaluerte vi effekten av echinacoside på glutamatfrigjøring, membranpotensial, presynaptisk Ca2 pluss tilstrømning og proteinkinase C-aktivitet. I følge vår gjennomgang av litteraturen er dette den første rapporten som dokumenterer mekanismen som echinakosid hemmer endogen glutamatfrigjøring på presynaptisk nivå.
2. Resultater
2.1. EchinacosideHemmer 4-Aminopyridine-fremkalt glutamatfrigjøring fra rottecerebrokortikale nerveterminaler ved å redusere vesikulær eksocytose
Figur 1 illustrerer den konsentrasjonsavhengige effekten av echinakosid på 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring fra rensede cerebrokortikale synaptosomer fra rotter. I synaptosomer inkubert med 1 mM CaCl2, fremkalte 1 mM 4-aminopyridin en glutamatfrigjøring på 7,4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 min, som ble redusert med 1, 5, 10, 30 og 50 uM echinacosid til 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,
4,1 ± 0,1 eller 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min, henholdsvis (F(5,24)=67.1, p=0. 000). IC50-verdien for echinakosid-mediert hemming av 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring, avledet fra en dose-respons-kurve, var 24 uM. Dessuten er glutamatfrigjøringen fremkalt av 1 mM 4-aminopyridin i en ekstracellulær Ca2 pluss-fri løsning som inneholder 300 uM etylenglykol bis(-aminoetyleter)-N,N,N/,N/-tetraeddiksyre (EGTA) var 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),
og denne Ca2 pluss-uavhengige komponenten av 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring var upåvirket av 20 uM echinacosid (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; figur 1). I synaptosomer behandlet med 0.1 uM bafilomycin A1, en vesikulær transportørhemmer [26], ble 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring redusert signifikant (2.2 ± 0.2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, s=0.000). I nærvær av bafilomycin A1 klarte ikke 20 uM echinakosid å hemme frigjøringen av glutamat signifikant (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.94; figur 1). Derimot økte 10 uM DL-treo-beta-benzyl-oksyaspartat (DL-TBOA, en glutamatreopptakshemmer) [27], 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring til 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, s=0.000). Selv i nærvær av DL-TBOA, hemmet 20 uM echinacosid 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring signifikant (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p.=0.000; Figur 1).
2.2 Echinacoside reduserer cytosolisk Ca2 pluss konsentrasjon, men endrer ikke synaptosomale membranpotensialet
Synaptosomdepolarisering forårsaket av 1 mM 4-aminopyridin økte Ca2 pluss konsentrasjon (p=0.000; Tabell 1). Påføring av 20 uM echinakosid påvirket ikke basal Ca2 pluss-konsentrasjon (t(8)=0.06, p=0.95, men signifikant redusert den 4-aminopyridin-induserte økningen i Ca2 pluss konsentrasjon (t(10)=6.16, p=0.000). I tillegg økte 1 mM 4-aminopyridin i 3',3',3'-dipropyltiadikarbocyaninjodid [DiSC3(5)]-fluorescens (p=0.000). Tilsetning av 20 uM echinacosid endret ikke hvilemembranpotensialet (t(8)=0.976, p=0.36) eller endret signifikant den 4-aminopyridin-mediert økning i DiSC3 (5) fluorescens (t(8)=-0.014, s=0.99; Tabell 1).
2.3 Redusert Ca2 pluss tilstrømning gjennom Cav2.2 (N-Type) og Cav2.1 (P/Q-Type) kanalene kan være assosiert med hemming av 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring av Echinacoside
Figur 2 viser at 2 uM o-konotoksin MVIIC, en N- og P/Q-type Ca2 pluss kanalblokker, reduserte 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring fra 7,4 ± {{10}}. 2 til 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). I nærvær av o-konotoksin MVIIC var effekten av 20 uM echinacosid på 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring ikke-signifikant (1,8 2± pluss 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06, s=0.32). Dantrolene (10 uM), en hemmer av intracellulær Ca-frigjøring fra endoplasmatisk
retikulum [28], redusert 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, s=0.000). I nærvær av dantrolen kan imidlertid 20 uM echinacosid fortsatt hemme frigjøring av glutamat betydelig (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Lignende resultater ble observert ved bruk av 100 uM 7-klor-5-(2-klorfenyl)-1,5-dihydro-4,1-benzotiazepin -2(3H)-on (CGP37157), en membrangjennomtrengelig blokkering av mitokondriell Na pluss /Ca2 pluss utveksling. I de fem undersøkte synaptosomale preparatene reduserte 20 uM echinacosid kombinert med 100 uM CGP37157 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring med 48,3 prosent ± 5,2 prosent (F(2,13) = 136.79, p {{ 49}}.000), lik inhiberingen av echinakosid alene (46,2 prosent ± 2,3 prosent; p=0.89; figur 2).
2.4 EchinacosideHemmer 4-Aminopyridine-fremkalt glutamatfrigjøring ved å signalisere gjennom proteinkinase C
Som illustrert i figur 3, 10 uM 2-[1-(3-dimetylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid (GF109203X), en generell proteinkinase C-hemmer [29], reduserte 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring (F(2,13) = 19.46, s=0.{{17 }}). I de GF109203X-behandlede synaptosomer reduserte 20 uM echinacosid 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring med bare 5,5 prosent ± 1,8 prosent (p=0.89), mindre enn ved echinacosid alene (42,4 prosent ± 2,3) prosent ; p=0.000). Lignende resultater ble oppnådd med 5,6,7,13-tetrahydro-13-metyl-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 ,4-c]karbazol-12-propanenitril (Go6976), en selektiv for Ca2 pluss-avhengige proteinkinase C isoformer ( , I, II, y) [29]. I nærvær av 3 uM Go6976 reduserte 20 uM echinacosid frigjøring av glutamat med 11,9 prosent ± 2,9 prosent (p=0.59), noe som betyr en signifikant reduksjon sammenlignet med echinakosid alene (42,4 prosent 2,3 prosent ; p {{ 65}}.000; figur 3). Derimot endret ikke 3 uM rottlerin, en Ca2 pluss-uavhengig proteinkinase C6-hemmer [30], signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-fremkalt glutamatfrigjøring (p=0.45). Ikke desto mindre, i nærvær av rottlerin, forårsaket 20 uM echinacosid en gjennomsnittlig hemming på 37,1 prosent ± 5,6 prosent av frigjøringen (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), lik den av echinacoside alene (s=0.41; figur 3). I tillegg kommer den mitogenaktiverte proteinkinasehemmeren 2-(2-amino-3-metoksyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on) (PD98059 ) (50 uM) og proteinkinase A-hemmeren N-[2-(p-bromcinnamylamino)etyl]-5-isokinolinsulfonamid (H89) (100 uM) reduserte 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring (s=0.000). Selv i nærvær av PD98059 eller H89, reduserte 20 uM echinacoside effektivt frigjøringen (F(2,13) = 52.3, p=0.000; figur 3).
Figur 4 viser at 1 mM 4-aminopyridin økte fosforyleringen av proteinkinase C i synaptosomer (t(4)=-6.871, p=0.002). Når synaptosomer ble forbehandlet med 20 uM echinacosid i 10 minutter før tilsetning av 4-aminopyridin, reduserte 4-aminopyridin-indusert fosforylering av proteinkinase C betraktelig (F(2,6)=29.202 , s=0.001).
2.5 Echinakosid-mediert hemming av glutamatfrigjøring involverer ikke en gamma-aminosmørsyre type A (GABAA) reseptor
I figur 5 ble effekten av echinacoside på 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring i fravær eller nærvær av SR95531 (en antagonist av GABAA-reseptoren) sammenlignet. I tillegg endret ikke 100 uM SR95531 signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-fremkalt glutamatfrigjøring. I de SR95531-behandlede synaptosomene resulterte påføring av 20 uM echinacosid i en 43 prosent hemming av 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), som ikke var signifikant forskjellig fra hemmingen produsert av echinacoside alene (40 prosent ; p=0.000). Et lignende resultat ble oppnådd med en annen GABAA-reseptorantagonist, bicuculline (50 uM). Frigjøringen målt i nærvær av bicucullin og echinacosid var signifikant forskjellig fra den oppnådd i nærvær av bicucullin alene (p=0.000).
3. Diskusjon
I denne studien,echinacoside, en aktiv forbindelse i HerbaCistanche, hemmet 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring i nerveterminalene i rottens hjernebark. De mulige underliggende mekanismene forechinacoside-mediert hemming av glutamatfrigjøring blir videre undersøkt og diskutert her.
3.1 Mekanismer som ligger til grunn for Echinacosid-mediert hemming av glutamatfrigjøring
Glutamatfrigjøring fremkalt av 4-aminopyridin består av to komponenter: en fysiologisk relevant Ca2 pluss-avhengig komponent, som produseres gjennom eksocytose av synaptiske vesikler som inneholder glutamat; og en Ca2 pluss-uavhengig komponent, som stammer fra langvarig depolarisering som forårsaker en membranpotensial-mediert forskyvning av glutamattransportørens steady-state mot utadgående retning, og dermed påvirker cytosolisk glutamatutstrømning [31]. Her observerte vi at echinacoside ikke signifikant hemmet 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring i nærvær av et Ca2 pluss-fritt medium (Ca2 pluss-uavhengig frigjøring). Videre ble den observerte echinakosid-medierte hemmingen av 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring effektivt forhindret av bafilomycin A1 (som uttømmer glutamatinnholdet i synaptiske vesikler), men ikke av DL-TBOA (som ikke-selektivt hemmer all eksitatorisk aminosyre transportør undertyper). Disse resultatene tyder på at echinakosid påvirker den Ca2 pluss-avhengige eksocytosen av glutamatfrigjøring uten å påvirke den Ca2 pluss-uavhengige cytosoliske effluksen av glutamat gjennom reversering av den nerveterminale plasmamembranen glutamattransportøren. I synaptiske terminaler stabiliserer Na pluss kanalinhibering eller K pluss kanalaktivering membraneksitabilitet og reduserte følgelig fremkalt Ca2 pluss inngang og nevrotransmitterfrigjøring [32,33]. Derfor involverer den potensielle mekanismen som ligger til grunn for echinakosid-mediert glutamatfrigjøringshemming en reduksjon i synaptosomal eksitabilitet. Imidlertid er denne muligheten uholdbar på grunnlag av to observasjoner: (1) 4-aminopyridin-fremkalt membranpotensialdepolarisering, målt med det membranpotensialsensitive fargestoffet DiSC3(5) var upåvirket av tilsetning av echinakosid; og (2) echinacoside påvirket ikke 4-aminopyridin-fremkalt Ca2 pluss-uavhengig glutamatfrigjøring, en komponent av frigjøring som kun avhenger av membranpotensialet [31]. Hvis effekten ikke er forårsaket av synaptosomal eksitabilitetsundertrykkelse, kan den manifesteres gjennom en reduksjon i aktiviteten til Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 pluss-kanaler kombinert med glutamateksocytose i nerveterminaler [34–36]. Ved å bruke fura-2 demonstrerer vi at echinacoside signifikant reduserer den 4-aminopyridinfremkalte økningen i Ca2 pluss-konsentrasjon. I tillegg viser dataene våre at den hemmende effekten av echinacoside på 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring sank fra 42,4 prosent 2,3 prosent til 12,1 prosent 3,9 prosent etter eksponering for en blokker av Cav2.2 (N-type) og Cav2 .1 (P/Q-type) Ca2 pluss-kanaler. Videre observerte vi at echinakosid fortsatte å signifikant hemme 4-aminopyridin-fremkalt glutamatfrigjøring i nærvær av intracellulær Ca2 pluss frigjøringshemmere. Disse resultatene indikerer at den samtidige undertrykkelsen av Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 pluss-kanalaktivitet er den potensielle mekanismen som ligger til grunn for echinakosid-mediert glutamatfrigjøringshemming. Imidlertid kunne den kombinerte aktiveringen av Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 pluss-kanalaktivitet ikke blokkere virkningen av echinacoside fullstendig. Derfor kan andre uidentifiserte typer Ca2 pluss-kanaler eller andre presynaptiske veier være involvert i inhiberingen. For eksempel er GABAA-reseptorer tilstede på presynaptisk nivå, og deres aktivering har vist seg å hemme Ca2 pluss tilstrømning og glutamatfrigjøring [37]. I denne studien blokkerte ikke GABAA-reseptorantagonistene SR95531 og bicuculline echinacosid-mediert hemming av glutamatfrigjøring, noe som antyder at GABAA-reseptorer ikke er involvert i reduksjonen av spenningsavhengig Ca2 pluss-kanalaktivitet og i den påfølgende hemmingen av glutamatfrigjøring. Ca2 pluss inngang gjennom spenningsavhengige Ca2 pluss-kanaler aktiverer flere proteinkinaser assosiert med glutamatfrigjøring i nerveterminaler, inkludert mitogenaktivert proteinkinase, proteinkinase C og proteinkinase A. Her demonstrerer vi at proteinkinase C-hemmere effektivt antagoniserte echinacosidet -mediert hemming av glutamatfrigjøring; ikke desto mindre var den mitogenaktiverte proteinkinasehemmeren PD98059 eller proteinkinase A-hemmeren H89 ineffektive. Videre reduserte 4-aminopyridin-indusert fosforylering av proteinkinase C i synaptosomer etter forbehandling med echinacosid i en konsentrasjon som er effektiv for å hemme frigjøring av glutamat. Derfor kan signalveien for den echinacosid-medierte glutamatfrigjøringshemmingen involvere proteinkinase C. Proteinkinase C er et viktig intracellulært signalsystem som er tilstede på presynaptisk nivå og har en avgjørende rolle i nevrotransmittereksocytose. For eksempel blir flere synaptiske proteiner involvert i den synaptiske vesikkeltrafikken eller rekruttering og eksocytose, slik som det myristoylerte alaninrike C-kinasesubstratet, fosforylert av proteinkinase C [38,39]. Denne fosforyleringsprosessen kan økes ved depolarisasjonsstimulert Ca2 pluss-inngang, noe som letter glutamatfrigjøring [40]. Derfor kan vi med rimelighet spekulere i at den hemmende effekten av echinacoside på Ca2 pluss-inngang observert her kan redusere proteinkinase C-aktivitet og følgelig frigjøring av glutamat.
