Del 1: Effekten av Acteosid som en cellebeskytter for å produsere en klonet hund

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 avdeling for husdyr- og meierivitenskap, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Republikken Korea,

2 Institutt for biologiutdanning, utdanningshøgskolen,Chonnam National University, Gwangju, Republikken Korea

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com

Vennligst klikk her til del 2

Abstrakt

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) er en velkjent laboratorieteknikk. Prinsippet til SCNT innebærer å omprogrammere en somatisk kjerne ved å injisere en somatisk celle i en mottakeroocytt hvis kjerne er fjernet. Derfor anses kjernedonorcellene som en avgjørende faktor i SCNT. Cellesyklussynkronisering av kjernedonorceller på G0/G1-stadiet kan induseres ved kontakthemming eller serumsult. I denne studien,akteosid, en fenylpropanoid glykosidforbindelse, ble undersøkt for å bestemme om den er anvendelig for å indusere cellesyklussynkronisering, cytobeskyttelse og forbedre SCNT-effektivitet i føtale fibroblaster hos hunder. Primære hundeføtale fibroblaster ble behandlet medakteosid(10, 30, 50 μM) for ulike tidsperioder (24, 48 og 72 timer). Cellesyklussynkronisering på G0/G1-stadiet skilte seg ikke signifikant med metoden for induksjon:akteosidbehandling, kontakthemming eller serumsult. Av disse tre behandlingene resulterte imidlertid serumsult i et betydelig økt nivå av reaktive oksygenarter (ROS) (99,5 ± 0,3 prosent) og apoptose. Resultatene avslørte det ogsåakteosidreduserte ROS- og apoptoseprosesser inkludert nekrose i hundeføtale fibroblaster, og forbedret celleoverlevelse. Hundeføtale fibroblaster behandlet medakteosidble arrestert på G0/G1-stadiet. Dessuten produserte de rekonstruerte embryoene ved bruk av kjernedonorceller behandlet med akteosid en sunn klonet hund, men ikke embryoene produsert ved bruk av kjernedonorceller utsatt for kontakthemming. For å konkludere,akteosidindusert cellesyklussynkronisering av kjernedonorceller ville være en alternativ metode for å forbedre effektiviteten til hunde-SCNT på grunn av dens cytobeskyttende effekter.

Cistanche acteosid kan forbedre immuniteten

Introduksjon

SCNT-teknikk har blitt brukt til å produsere genetisk overlegne eller manipulerte dyr til landbruksformål og som biomedisinske ressurser. Med det økende behovet for dyremodeller for sykdom, redning av dyr i fare for utryddelse, stamceller for regenerativ medisin, organtransplantasjon, etc., har interessen for kloning av dyr ved bruk av SCNT økt i nyere tid [1–5]. Selv om produksjonen av klonede dyr har vært vellykket, er effektiviteten til SCNT fortsatt svært lav [6]. Årsakene til lav SCNT embryoutviklingskompetanse inkluderer mange faktorer som er relatert til kvaliteten på mottakeroocyttene, kvaliteten på kjernedonorcellene og tilstanden til surrogatmoren [7–10].

Reaktive oksygenarter (ROS) og apoptose har vært kjent for å være involvert i kvinnelige reproduksjonsprosesser inkludert oocyttutvikling in vivo og in vitro [11–14]. ROS avbryter embryoutvikling ved å indusere cytoplasmatisk kondensasjon, DNA-skade og apoptose i embryoer. Støttestudier har rapportert at reduksjon av ROS forbedrer SCNT embryoutviklingskompetanse under in vitro kultur [15–17]. Apoptose er en fysiologisk prosess som skjer spontant under normal preimplantasjonsembryoutvikling for å opprettholde cellulær homeostase ved å fjerne DNA-skadde/feilfungerende celler. ROS forårsaker DNA-fragmentering og øker apoptotiske blastomerer som forstyrrer embryoutviklingen. Hendelsen av ROS og apoptose observeres oftere etter SCNT enn etter in vitro fertilisering [18, 19]. Mange studier rapporterte at SCNT embryoutviklingskompetanse reddes ved å redusere nivåene av ROS og apoptose ved å bruke antioksidanter som selen [20], insulin-transferrin-selen [17, 21], melatonin [22] og glutation [23].

Tidligere studier rapporterte at bruken av donorceller arrestert på G{{0}}/G1-stadiet forbedret effektiviteten til SCNT [7, 9, 24–28]. Kromatinet i donorcellene på G0/G1-stadiet har blitt ansett som det mest effektive for SCNT-embryoutviklingskompetanse. For å synkronisere donorcellesyklusen har kontakthemming, serumsulting og kjemiske behandlinger blitt brukt ofte [7, 25, 29, 30]. Serumsult reduserte imidlertid celleoverlevelsen og øker DNA-fragmenteringen, noe som fører til apoptose [31]. Kjemisk hemming er en annen strategi for å stoppe cellesyklusen på G0/G1-stadiet ved å bruke hemmere som roscovitin [29, 32], dimetylsulfoksid (DMSO) [33] og cykloheksimid (CHX) [34]. Effektiviteten til metoden som brukes for synkronisering påvirkes av typene og artene til donorcellene. For optimal donorcellesynkronisering må ulike aspekter ved metodene som brukes, evalueres nøye.

Acteosid(også kjent som verbascoside) [{{0}}(3, 4-dihydroksyfenyletyl)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] er isolert fra de fiolette blomstene til Syringa vulgaris. Planter som inneholder akteosid har vært kjent for å ha antimikrobielle og anti-soppvirkninger [35–37], og forhindrer betennelse. Akteosid viser faktisk forskjellige biologiske aktiviteter in vitro og in vivo, slik som antioksidativ aktivitet, anti-apoptotisk aktivitet, cytotoksisitet mot forskjellige tumorceller og cellesyklussynkronisering på G0/G1-stadiet som en syklinavhengig kinase (CDK) hemmer [38]. For eksempel Lee et al. [38] rapporterte at akteosidbehandling kan hemme spredningen av humane promyelocytiske HL-60-leukemiceller ved å indusere cellesyklusstans på G0/G1-stadiet. Effekten av akteosid-behandlede donorceller på effektiviteten til SCNT hos hunder har imidlertid ennå ikke blitt studert.

I denne studien er effektene avakteosidpå cellesyklussynkronisering, ROS ogapoptosepå hundeføtale fibroblaster ble undersøkt. Analysen av cellesyklussynkronisering, ROS og apoptose ble utført ved bruk av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). For å demonstrere effektiviteten til donorcellene behandlet med akteosidet, ble SCNT-embryoer dyrket og overført til en mottakerhund, og produsert en sunn klonet hund.

cistanchekan behandlenyresykdom forbedresnyrefunksjon

Materialer og metoder

Etikkerklæring

I denne studien ble 44 kvinnelige blandingshunder (i alderen 1–6 år) brukt som oocyttdonorer og embryooverføringssurrogater, og en hunnbeagle (i alderen 2 år) ble brukt til etablering av føtale fibroblastcellelinjer. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Chungnam National University (godkjenningsnummer: CNU-00487) og utført i henhold til "The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" publisert av IACUC ved Chungnam National University. Hunder ble oppdratt innendørs i separate bur med temperatur- og ventilasjonskontrollsystem. Hunder ble matet med en kommersiell diett en gang daglig og ga vann ad libitum. I alle dyreforsøkene ble hunder bedøvet med 6 mg/kg ketamin og xylazin innledningsvis og holdt i bedøvet tilstand med 2 prosent isofluran. På slutten av operasjonen ble antibiotika (Procaine Penicillin G, Benzathine Penicillin G og Dihydrostreptomycin sulfat) administrert for å forhindre enhver infeksjon. Etter operasjonen ble hundene overført til sine egne bur med ferskvann, overvåket og gitt spesiell omsorg fra ansvarlig veterinær, slik at nødvendige behandlinger kunne gis dersom dyrene trengte det.

Kjemikalier

Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) med mindre annet er oppgitt. Acteosid ble hentet fra Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. i Kina.

Isolering av hundeføtale fibroblaster

Hundeføtale fibroblaster ble hentet fra {{0}}dager gamle fostre. Kort fortalt ble en kvinnelig beagle kunstig inseminert med sædceller fra en hannbeagle. Etter 28 dager ble graviditet hos den kvinnelige beagle bekreftet og 5 fostre ble oppnådd ved celiohysterektomi. Fostre ble vasket tre ganger i fosfatbufret saltvann (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Hodet, indre organer og lemmer av fostrene ble fjernet med et kirurgisk blad og de resterende kroppsdelene ble hakket i PBS. Fosterstykker ble vasket to ganger ved sentrifugering ved 400 × i 5 minutter og dyrket i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco) supplert med 1 prosent penicillin-streptomycin (produktnr. P4458) og 20 prosent føtalt bovint serum (FBS; Gibco) ved 39 grader i en fuktet atmosfære på 5 prosent CO2 og 95 prosent luft. Når cellene nådde sammenløp etter 5–7 dager, ble de behandlet med 0,25 prosent trypsin-EDTA (Gibco) i 2 minutter og høstet. To hundeføtale fibroblastcellelinjer ble etablert fra to individuelle fostre. Cellene ble frosset i 10 prosent DMSO i FBS og lagret i flytende nitrogen ved -196 grad til de ble brukt.

Cellebehandling

De frosne hundefibroblastene ble tint og dyrket til 80 prosent sammenløp. Celler ble høstet og passert 4 til 7 ganger for påfølgende eksperimenter. Celler ble sådd ved en konsentrasjon på 106/ml i 60 mm kulturskåler. Cellene ble dyrket i (1) DMEM supplert med 10 prosent FBS og 1 prosent penicillin-streptomycin i fem dager (kontakthemming), (2) DMEM supplert med 0,5 prosent FBS og 1 prosent penicillin-streptomycin i fem dager (serum sult) , eller (3) DMEM supplert med 10 prosent FBS og 1 prosent penicillin-streptomycin inneholdende akteosid ved 10 μM, 30 μM eller 50 μM i 24 timer, 48 timer og 72 timer (akteosidbehandling).

Cellesyklusanalyse ved flowcytometri

For analyse av cellesyklusstadiene ble cellene høstet ved bruk av {{0}}.25 prosent trypsin-EDTA og vasket 3 ganger med PBS ved sentrifugering. Etter siste vask ble supernatantene kastet og cellene resuspendert i 0,3 mL PBS. For fiksering ble {{10}},7 mL kald absolutt etanol tilsatt dråpevis til cellesuspensjonen, blandet ved forsiktig vortexing og lagret over natten ved 4 grader. De fikserte cellene ble sentrifugert og vasket to ganger med kald PBS. Cellene ble resuspendert i 0,25 mL PBS supplert med 5 μL 10 mg/mL RNase og inkubert i 1 time ved 37 grader. Deretter ble 10 μL 1 mg/ml propidiumjodid (PI) tilsatt. Cellesyklus ble analysert ved kvantifisering av DNA-innhold i cellepopulasjoner ved G0/G1 (2n), S (mellom 2n og 4n), og G2/M (4n) faser ved bruk av et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

ROS-deteksjon ved flowcytometri

ROS i levende celler ble vurdert ved bruk av et Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt ble celler vasket i PBS etter fjerning av kulturmediet, og 2 ml av 100 μM tert-butylhydroperoksid (TBHP) arbeidsløsning ble tilsatt. Etter inkubering ved 37 grader i 1 time ble TBHP-arbeidsløsningen fjernet, og cellene ble forsiktig vasket 3 ganger i varm Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS; Gibco). Celler ble deretter inkubert i 25 μM 5-(og-6)-karboksy-2,7-diklordihydrofluoresceindiacetat (karboksy-H2DCFDA) arbeidsløsning ved 37 grader i 30 minutter i mørket . Når oksidert, avgir karboksy-H2DCFDA grønn fluorescens, noe som letter vurderingen av ROS ved flowcytometri. TBHP, som er en induser av ROS-produksjon, ble brukt som en positiv kontroll. Cellekjernene ble farget med Hoechst 33342. Etter vask 3 ganger med PBS, ble cellene høstet ved trypsinisering, suspendert i PBS og brukt for å påvise ROS ved å bruke et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Raten for ROS-dannelse ble beregnet ved å dele antall ROS-positive celler med det totale celletallet og konvertere verdiene til prosenter.

Apoptoseanalyse ved flowcytometri

Apoptoseanalyse ble utført ved å bruke et Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt ble cellene høstet ved trypsinisering og vasket 2 ganger med kald PBS. Deretter ble 100 μL 1 x annexinbindende buffer, 5 μL Alexa Fluor 488 annexin V og 1 μL PI tilsatt til cellene. Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur ble 400 μL 1 x annexinbindende buffer tilsatt og cellesuspensjonen ble forsiktig blandet. Annexin V, som er et Ca2 pluss-avhengig fosfolipidbindende protein, har høy affinitet for fosfatidylserin (PS). I levende celler er PS lokalisert på den indre cytoplasmatiske membranen og translokert til den ytre cytoplasmatiske membranen i apoptotiske celler. Apoptotiske celler kjennetegnes av Annexin V merket med Alexa Fluor 488 som binder til PS på den ytre membranen. I tillegg farger PI, som er et nukleinsyrebindende fargestoff, nekrotiske celler med rød fluorescens. Derfor ble apoptotiske celler med grønn fluorescens, nekrotiske celler med rød fluorescens og levende celler med liten eller ingen fluorescens i cellene analysert ved bruk av et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Ratene ble beregnet ved å dele celleantallet av levende, nekrotiske eller apoptotiske celler med det totale celletallet, og konvertere de beregnede verdiene til prosenter.

Samling av in vivo modne oocytter

For å oppdage eggløsning hos hver hund, ble serumprogesteron (P4)-konsentrasjonen målt ved å bruke et DSL-3900ACTIVE progesteron-belagt rør Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Som tidligere beskrevet [39, 40], ble dagen da P4-konsentrasjonen overskred 4 ng/ml betraktet som eggløsningsdagen. 72 timer etter eggløsning ble oocytter hentet ved laparotomi ved bruk av aseptiske kirurgiske prosedyrer. Fimbria av egglederen ble nærmet seg gjennom bursal-spalten og kanylert ved bruk av en omvendt flensformet stålnål (18 gauge, 7,5 cm). Et 24 gauge intravenøst ​​(IV) kateter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) ble satt inn i isthmus av egglederen nær uterotubal-krysset, og medium 199 (Gibco) supplert med 1 prosent penicillin-streptomycin og 5 prosent FBS ble introdusert i egglederen gjennom IV-kateteret. Oocytter ble umiddelbart fraktet til laboratoriet. Totalt 316 oocytter ble samlet inn fra 31 hunder.

Somatisk cellekjerneoverføring og embryooverføring SCNT ble utført som tidligere beskrevet [39]. Kort fortalt, for å fjerne cumulusceller fra in vivo modne oocytter, ble cumulus-oocytt-komplekser (COC) repetert pipettert i 0,1 prosent hyaluronidase. Den første polare kroppen og metafase-II-kromosomene ble fjernet ved aspirasjon. Enukleering ble bekreftet ved farging med Hoechst 33342 (bisbenzimid). Fetale fibroblaster fra hunde ble behandlet med 30 μM akteosid i 48 timer og deretter høstet med 0,25 prosent trypsin-EDTA. En enkelt celle, som har en glatt cellemembran, ble overført til perivitellinrommet til hver enukleert oocytt. Kuplettene var ekvilibrert infusjonsmedium, som er 0.26 M mannitolmedium som inneholder 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4 og 0,05 prosent BSA, og smeltet sammen med to pulser likestrøm (69–75 V i 15 μs) fra et Electro-Cell Fusion-apparat (NEPA gene Co., Chiba, Japan). Disse kupletter ble inkubert i medium 199 supplert med 10 prosent FBS i 1 time og 30 minutter. De smeltede SCNT-embryoene ble kontrollert og kjemisk aktivering ble indusert ved å inkubere dem i 10 μM kalsiumionofor (produktnr. C7522, Sigma) i 4 minutter. SCNT-embryoer ble vasket og deretter plassert i et modifisert syntetisk oviduktalvæskemedium (mSOF) [41] som inneholdt 1,9 mM 6-dimetylaminopurin (6-DMAP) i 3 timer og 30 minutter. De konstruerte embryoene ble kirurgisk overført til oviduktene til brunstsynkroniserte surrogater innen 4 timer etter SCNT. Graviditet ble bekreftet ved ultralyd 26 dager (tidligst) etter embryooverføring.

aktiv ingrediensakteosidicistanche

In vitro kultur av klonede embryoer

Etter SCNT ble klonede embryoer dyrket i 40 μL mikrodråper av et modifisert syntetisk oviductal fluid medium (mSOF) (10 klonede embryoer per mikrodråpe) dekket med mineralolje ved 38,5 grader i 5 prosent CO2 og 95 prosent luft. SCNT embryoutvikling ble observert fra dag 2 til dag 8.

Mikrosatellitt og mitokondriell DNA-analyse av en klonet hund

Totalt DNA ble ekstrahert fra kjernedonorcellene, og huden til oocyttdonorhundene, surrogathundene og den klonede hunden med G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) i henhold til produsentens retningslinjer, og ble deretter eluert i 100 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Mengden av DNA ble målt med BioSpec-nano spektrofotometer (Shimadzu Corp., Japan).

For mikrosatellitt-genotyping ble følgende 7 spesifikke gener valgt: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 og FH2079. PCR ble utført med initial denaturering i 10 minutter ved 95 grader, 20 sykluser bestående av denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 30 sekunders annealing ved 58 grader (-0.1 grad/syklus), 1 minutts forlengelse kl. 72 grader, og 15 sykluser til som består av denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 30 sekunders annealing ved 56 grader, 1 minutts forlengelse ved 72 grader, og endelig forlengelse ved 72 grader i 10 minutter.

For mitokondriell DNA-sekvensering, ved bruk av de komplette nukleotidsekvensene til mtDNA fra hund (GenBank-aksessnr.: U96639), ble følgende oligonukleotidprimere syntetisert: Cytokrom b-region (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTCATTGACCATGATTGAGTCCAGGGGAGGA; Cytokrom c-oksidase-underenhet II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D-løkkeregion (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. PCR-syklusene for denne analysen inkluderte: 95 graders initiale denatureringer i 5 minutter, 5 sykluser med denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 40 sekunders annealing ved 60 grader (-1 grad/syklus), 1 minutts forlengelse kl. 72 grader, og de neste 30 syklusene med denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 40 sekunders annealing ved 55 grader, 1 min forlengelse ved 72 grader, og siste forlengelse ved 72 grader i 10 minutter. PCR-fragmenter fra de forskjellige eksperimentene ble analysert ved bruk av en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA). Sekvensmontering, flere justeringer og justeringstrimming for kontrollregioner ble utført med BioEdit-programvaren (v.7.0.5.3).

akteosidicistanchekan styrke immunforsvaret