DEL 1 Forberedelse og evaluering av mikroemulsjonsbasert transdermal tilførsel av Cistanche Tubulosa fenyletanoidglykosider

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3*, & et al.

Abstrakt.

Hovedmålet med denne studien var å utvikle en ny mikroemulsjon (ME) formulering for å leverefenyletanoidglykosid fra cistanche(PG) for bruk i hudlysere og solkremer. Oljefasen ble valgt på grunnlag av medikamentløselighet, mens overflateaktivt middel og medoverflateaktivt middel ble screenet og valgt på grunnlag av deres solubiliseringsevne og effektiviteten de dannet ME-er med. Pseudo-ternære fasediagrammer ble konstruert for å evaluere ME-regioner og fem formuleringer av olje-i-vann ME ble valgt som bærere. In vitro hudpermeasjonseksperimenter ble utført for å optimalisere ME-formuleringen og for å evaluere dens permeabilitet sammenlignet med saltoppløsningen. De fysisk-kjemiske egenskapene til den optimaliserte ME og gjennomtrengningsevnen til PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche) levert av denne ME ble også undersøkt. Den optimaliserte ME-formuleringen var sammensatt av isopropylmyristat (7 prosent, w/w), Cremorphor EL (21 prosent, w/w), propylenglykol (7 prosent, w/w) og vann (65 prosent, w/w). Den kumulative mengden PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche) som trengte gjennom utskåret musehud når den ble båret av ME, var ~1,68 ganger det når PG ble båret av kun saltoppløsning. Den kumulative mengden PG i mikroemulsjonen (4149,650±37,3 µg·cm-2) var signifikant større enn PG i saltoppløsningen (2288,63±20,9 µg· cm-2). Videre indikerte permeabilitetskoeffisienten at optimalisert mikroemulsjon var en mer effektiv bærer for transdermal levering av PG enn kontrollløsningen (8,87±0,49 cm/hx10-3 vs. 5,41±0,12 cm/hx10-3). Samlet var gjennomtrengningsevnen til ME-båret PG betydelig økt sammenlignet med saltvannsoppløsning.

cistanche

Introduksjon

Herba cistanche,en styrkende urt som ofte er distribuert i ørkenregioner, har blitt ofte brukt i tradisjonell kinesisk medisin. Til dags dato har flere studier blitt utført for å undersøke dens biofarmasøytiske egenskaper, inkludert forbedring av hukommelse, seksuell potens, frie radikaler og anti-aldringsaktivitet (1). Hovedkomponenten i H. cistanche erfenyletanoid glykosid (PG). Tidligere studier har avdekket at PG hemmer aktiviteten til tyrosinase, det hastighetsbegrensende enzymet for syntesen av melanin i menneskekroppen (2). I tillegg har PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche) har blitt rapportert å være ansvarlig for fjerning av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazylradikaler (3), og beskytte keratinocytter mot ultrafiolett (UV) stråling. Derfor kan denne komponenten ha potensial i huddepigmentering. Aktuell medisinering har vært ofte brukt i kosmetiske områder, med stoffet levert direkte på kroppsoverflaten (4). Mikroemulsjoner (ME) er et nytt medikamentleveringssystem konvensjonelt sammensatt av olje-, overflateaktivt-, co-overflateaktive og vandige faser (5) og har blitt rapportert å forbedre hastigheten og absorpsjonen av lipofile legemidler (6). I tillegg, på grunn av dets tilfredsstillende løselighet, lave hudirritasjon og høye permeabilitet, forventes det å bli brukt i topisk medikamentlevering (7,8). Så vidt vi vet, er det utført få studier der PG ble levert via lokal medisin ved bruk av mikroemulsjon. I denne studien ble et olje-i-vann (O/W) nanoemulsjonsleveringssystem for transdermal administrering etablert, og PG ble inkorporert i nanoemulsjonen (9,10). I mellomtiden ble forberedelse og karakterisering av PG-basert nanoemulsjon utført ved å undersøke den transdermale frigjøringen in vitro.

Materialer og metoder Reagenser.

Cremorphor EL og isopropylmyristat (IPM) ble kjøpt fra Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Tyskland). Etanol, oljesyre (OA) og Tween-80 ble kjøpt fra Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kina). Etyloleat ble kjøpt fra Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Alle kjemikalier og løsemidler som ble brukt var av analytisk reagenskvalitet. Forberedelse og evaluering av mikroemulsjonsbasert transdermal tilførsel av Cistanche tubulosa fenyletanoidglykosider JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1,{MEI}WANG2 og } Avdeling for farmasi, Det første tilknyttede sykehuset; 2 Institutt for naturmedisin, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Department of Pharmacy, Kanghua Hospital, Dongguan, Guangdong 523003, PR Kina Mottatt 2. desember 2015; Akseptert 29. november 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Korrespondanse til: Dr. Junping Hu, Institutt for naturmedisin, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830051, Kina E-post: hujp. @yeah.net * Bidro likt Nøkkelord: fenyletanoidglykosid, mikroemulsjon, transdermal levering, hudlysere, solkrem yang et al: ME-BASERT PG FOR KOSMETISK ANVENDELSE 1110 Forberedelse av PhGs. PhG(fenyletanoidglykosid fra cistanche) ble utarbeidet som rutinemessig beskrevet (11).

Den lufttørkedeC. tubulosable drevet og ekstrahert ved perkolering med 80 prosent EtOH. Perkolatet ble fordampet under trykk, etterfulgt av filtrering av det gjenværende fluidet. Filtratet ble konsentrert og kromatografert på en SP-825 makroporøs harpikskolonne ved bruk av 0, 30, 50, 70 og 90 prosent EtOH i vann som elueringsmidler. 30-50 prosent EtOH-elueringsmidler ble konsentrert og tørket for å oppnå PhG-rik fraksjon. UV-spektrofotometri indikerte innholdet i PhG(fenyletanoidglykosid fra cistanche) var 87,6 prosent. Screening av oljer, overflateaktive stoffer og co-tensider for ME. Løselighetstester ble utført for å velge passende komponenter for fremstilling av en ME-formulering med høy medikamentbelastningskapasitet. I denne prosessen ble en overskytende mengde PG tilsatt 4 ml av hver av følgende reagenser: IPM, flytende parafin, OA, Cremophor EL, Tween-80, absolutt etanol, propylenglykol, glyserin og PEG400 , henholdsvis. Etter dette ble den resulterende blandingen ristet gjensidig ved 37˚C i 72 timer, etterfulgt av sentrifugering ved 12.830 xg i 10 minutter. Deretter ble pelleten resuspendert i metanol, og PG ble bestemt ved bruk av UV-spektrofotometri ved 333 nm. Passende fortynnede oppløsninger av oljer, overflateaktive midler og medløsningsmidler i metanol tjente som en blindprøve. Konstruksjon av fasediagram. For å oppnå et konsentrasjonsområde av komponenter for den eksisterende mikroemulsjonsgrensen, ble pseudo-ternære fasediagrammer konstruert ved bruk av en vanntitreringsmetode som tidligere beskrevet (12). Trefasediagrammer ble utarbeidet med 1:3, 1:1 og 3:1 vektforhold mellom overflateaktivt middel og medoverflateaktivt middel. Oljefasen og den overflateaktive blandingen ble deretter blandet i vektforholdene 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 og 9:1 . Blandingen av olje og overflateaktivt middel ble blandet homogent og ble fortynnet dråpevis med renset vann under magnetisk omrøring (300 rpm) ved romtemperatur inntil transparent ME ble oppnådd. Konsentrasjonen av komponenter ble registrert for å fullføre det pseudo-ternære fasediagrammet. Basert på disse diagrammene ble passende konsentrasjoner av materialer valgt for fremstilling av PG-basert ME. Fremstilling av ME og den vandige løsningen av PG. Totalt 5 ME-er (ME1-5) ble valgt i henhold til fasediagrammene med et vektforhold mellom overflateaktivt middel og overflateaktivt middel på 3:1 (tabell I). Mikroemulsjonssystemer ble fremstilt ved å blande olje med blandingen av overflateaktivt middel og co-surfactant, og vann ble tilsatt nøyaktig i oljefaser med magnetisk omrøring (300 r/min) ved 37˚C. Systemene ble ekvilibrert ved bruk av forsiktig magnetisk omrøring i 30 minutter etterfulgt av oppløsning av passende mengde PG under ultralydbehandling. Den vandige løsningen ble fremstilt med samme PG-innhold oppløst i renset vann. Karakterisering av mikroemulsjonen. Den gjennomsnittlige dråpestørrelsen og polydispersitetsindeksen til ME ble evaluert ved fotonkorrelasjonsspektroskopi (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Storbritannia). Alle prøvene ble fortynnet med vann i forholdet 1:5 og ble filtrert gjennom et 0,22 µm filter. Testen ble utført i et termostatkammer ved 25˚C i tre eksemplarer. Morfologien til PG-mikroemulsjoner ble observert ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tokyo, Japan). Kort fortalt ble én dråpe fortynnet prøve avsatt på et filmbelagt kobbergitter, etterfulgt av farging med én dråpe 2 prosent vandig fosfowolframsyreløsning.

De gjennomsnittlige dråpediametrene til mikroemulsjonene ble bestemt ved hjelp av fotonkorrelasjonsspektroskopiinstrument (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) ved romtemperatur. Viskositeten til ME-kjøretøyene ble målt ved 25˚C ved bruk av NDJ-8S digitalt viskosimeter (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Kina) med et nr. 1 rotor satt til 60 rpm. pH-bestemmelse. PH-verdiene til ME-ene ble bestemt ved 25˚C ved bruk av Phs-3C digitale acidimeter (Shanghai REX Instruments Factory, Shanghai, Kina). Brytningsindeksene ble målt med et termostatisk Abbe refraktometer (Optical Instrument Factory, Shanghai, Kina). Forberedelse av hudvev. Kunming hannmus som veide 20 g ble kjøpt fra Experimental Animal Center ved Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). 10 mus (6 uker gamle) ble utsatt for adaptiv fôring i 1 uke på en 12 timers lys/12 timers mørke syklus, ved romtemperatur (24±2˚C), med en fuktighet på 50±15 prosent. Alle dyrene hadde tilgang til standard diett og vann. Håret ble fjernet med en elektrisk klipper. Etter terminal anestesi med kloralhydrat (10 prosent) via subkutan injeksjon, ble hudvev skåret ut fra mageregionen og subkutan fett og bindevev ble fjernet. Vevet ble plassert i kjøleskap ved 4˚C over natten. Studieprotokollene ble godkjent av den etiske komiteen ved Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). In vitro permeasjonsstudie. Permeasjonsforsøk ble utført som tidligere beskrevet (12). Den utskårne huden ble klemt mellom donoren og reseptorkammeret til en vertikal diffusjonscelle med et effektivt diffusjonsområde på 2,8 cm2. Reseptorkammeret var fylt med friskt, normalt saltvann. Diffusjonscellen ble holdt ved 37˚C ved bruk av et resirkulerende vannbad og løsningen i reseptorkamrene ble omrørt kontinuerlig ved 200 rpm. Etter dette ble testformuleringen (1,0 ml) forsiktig plassert i donorkammeret. Deretter ble 3 ml av løsningen i reseptorkammeret fjernet og erstattet med et likt volum friskt normalt saltvann med forhåndsbestemte intervaller (0, 2, 4, 6, 8, 10 og 24 timer). Prøven oppnådd fra reseptorkammeret ble brukt til å bestemme PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche)nivåer ved bruk av UV-spektroskopi ved en bølgelengde på 333 nm. Den kumulative mengden PG som trengte gjennom den utskårne musehuden ble beregnet i henhold til følgende formel:

Der Qn var den akkumulerte mengden på et gitt tidspunkt t, Cn er medikamentkonsentrasjonen til mottakerløsningen ved hvert prøvetakingstidspunkt, Ci er legemiddelkonsentrasjonen til prøven, S er det effektive diffusjonsområdet (S{{0 }}.8 cm2), og V0 og Vi er volumene til henholdsvis mottakerløsningen og prøven. Den kumulative mengden (Qn) av PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche)permeated ble plottet som en funksjon av tid (t) for hver formulering. Permeasjonshastigheten til PG ved en jevn tilstand (Jss, µg/cm-2/h-1) gjennom musehuden ble beregnet fra helningen til den lineære delen av plottene av Qnversus-tid. Permeabilitetskoeffisienten (Kp, cm/h) ble beregnet i henhold til følgende formel:

Der Kp er permeabilitetskoeffisienten, er Jss effluksen beregnet ved steady-state, og C0 representerer medikamentkonsentrasjonen som forble konstant i bæreren. Studie av hudretensjon. De følgende avsnittene beskriver sammenligningen av ex vivo permeasjonsatferd, kumulativ mengde, permeasjonshastighet, permeabilitetskoeffisient og hudretensjonsegenskaper mellom optimaliserte ME-formuleringer (PG-innhold, 2 prosent, vekt/vekt) og den vandige løsningen. Ved slutten av gjennomtrengningseksperimentet ble det gjenværende medikamentnivået i huden bestemt ved bruk av en homogeniseringsmetode. Etter vasking med vanlig saltvann ble huden kuttet i små seksjoner og plassert i et glassrør inneholdende 3 ml metanol i et isbad. Prøven ble homogenisert med en hastighet på 12000 r/min. rpm i 2 minutter, og deretter sentrifugert ved 12.830 xg horisontalt i 30 minutter ved 25˚C. Supernatanten ble ført gjennom et mikroporøst filter (0,45 µm), og PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche)nivåer i supernatanten ble bestemt ved UV-spektroskopi ved en bølgelengde på 333 nm. Stabilitetsstudie. Den fysiske stabiliteten til PG-lastet ME ble undersøkt via klarhet, partikkelstørrelsesanalyse og faseseparasjon, som ble observert ved 2‑8˚C og ved romtemperatur i 3 måneder. Sentrifugering ble utført ved 12.830 xg i 30 minutter ved 25˚C for å vurdere den fysiske stabiliteten til ME. Faseseparasjon og konsentrasjon av PG ble undersøkt månedlig for å bedømme den optimale lagringstemperaturen. Kjemisk stabilitet ble evaluert på medikamentladede formuleringer, lagret ved 2‑8˚C og ved romtemperatur, med PG-innholdet bestemt ved UV-spektrofotometri ved 333 nm. Hudfølsomhetstest. Hudsensitivitetstester ble utført på kaniner (som veide 2,02,5 kg) for å evaluere irritasjonspotensialet ved topisk påføring av den utviklede formuleringen som tidligere beskrevet (13). Ni hollandske kaniner (16 uker gamle; veier 2.0-2,5 kg; 5 hanner og 4 hunner) ble hentet fra Experimental Animal Center ved Xinjiang Medical University. Dyrene ble utsatt for adaptiv fôring i 1 uke på en 12 timers lys/12 timers mørke syklus, ved romtemperatur (24±2˚C), med en fuktighet på 50±15 prosent. Alle dyrene hadde tilgang til standard diett og vann. Luftemboli ble brukt til ofringen. Protokollene som ble brukt i denne studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). Hårene på ryggen ble fjernet ~24 timer før administrering av ME-formuleringene. Dyrene ble delt inn i følgende grupper: En optimalisert ME-gruppe (n=3), med topisk administrering av optimalisert ME inneholdende 2 prosent (vekt/vekt) PG; en PG saltvannsgruppe (n=3), med topisk administrering av saltvannsoppløsning inneholdende 2 prosent (w/w) PG; og kontroll saltvannsgruppe (n=3), underlagt topisk administrering av normalt saltvann. Administreringen ble utført to ganger daglig i 5 dager. Dyrene ble observert for eventuelle tegn på kløe eller forandringer i huden, inkludert erytem, ​​papler, flak og tørrhet (14). Etter seponering av medikamentet ble observasjon for enkelt eller flere administreringer fortsatt i 3 dager. Irritasjonsskårene for testområdet ble evaluert ved å bedømme omfanget av erytem og ødem i henhold til følgende kriterier: 1, ingen synlig reaksjon; 2, en svak reaksjon; 3, en moderat reaksjon og 4, en alvorlig reaksjon (15,16). Til slutt ble de totale irritasjonsskårene for hver tilstand beregnet ved å bruke følgende ligning:

Statistisk analyse. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik. Dataanalyse ble utført ved bruk av en enveis variansanalyse etterfulgt av den minst signifikante forskjellstesten. Data ble analysert med SPSS-programvareversjon 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultater og diskusjon

Screening av oljer, overflateaktive stoffer og co-overflateaktive stoffer for ME. PG(fenyletanoidglykosid fra cistanche)var nesten uløselig i flytende parafin og oljesyre, men moderat løselighet ble observert i IPM (tabell II). IPM øker diffusjonskoeffisienten i huden og resulterer i økning av permeasjonskoeffisienten (17,18). I tillegg er IPM ofte valgt for fremstilling av ME på grunn av dets velkjente gjennomtrengningsfremmende egenskaper og biokompatibilitet. Utvelgelse av overflateaktive stoffer er avgjørende for vellykket formulering av ME, da det bidrar til reduksjon av grensesnittspenningen ved å danne en film ved grensesnittet mellom olje og vann (19). I denne studien viste PG en høyere løselighet i Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Tabell II) sammenlignet med Tween-80 (28,051 mg/ml; Tabell II). Derfor ble CremophorEL valgt for bruk i videre studier på grunn av dets løselighetsprofil og dets lave toksisitetsnivå som et ikke-ionisk overflateaktivt middel. Videre viste dens vandige løsning god løselighet av PG. Den høyeste løseligheten av PG blant de medoverflateaktive stoffene ble observert i propylenglykol (48,714 mg/ml; Tabell II). I tillegg har propylenglykol evnen til å danne ME med IPM og CremophorEL. Sammenlagt ble IPM, CremophorEL og propylenglykol brukt som henholdsvis oljefase, overflateaktivt middel og co-surfactant for formuleringen av PG-lastede ME-er. Konstruksjon av pseudo-ternære fasediagrammer. I denne studien ble fasediagrammer konstruert for å velge konsentrasjonsområdet for komponenter for mikroemulsjonene, og de markerte områdene indikerer den klare O/WME-regionen (fig. 1). En nær sammenheng mellom hydreringseffekten av stratum corneum og den dermale permeasjonen er tidligere rapportert (20), og den termodynamiske aktiviteten til legemidler ved ME var en betydelig drivkraft bak frigjøring og penetrering av legemidler inn i huden (20,21 ). Den termodynamiske aktiviteten til legemidler ved ME med lavere innhold av overflateaktive stoffer ble vist å være en viktig drivkraft for frigjøring og penetrering av legemidlet inn i huden (22,23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 var grumsete og ustabile (fig. 2).

De endelige sammensetningene av ME1-5 er oppført i tabell I. ME-preparering og karakterisering. De fysiske egenskapene til ME1-5 er oppført i tabell III. De disperse systemene var makroskopisk identiske, homogene og transparente, uten utfellinger. Gjennomsnittlig dråpestørrelse for disse ME-ene varierte mellom 30.56 og 79.21 nm (fig. 3; tabell III), med polydispersitetsindeksverdier mellom 0.187 og 0.321 (Tabell III). Dette indikerte en ensartet ME med en smal størrelsesfordeling. I tillegg økte dråpestørrelsen proporsjonalt med oljeinnholdet, men avtok med innholdet av overflateaktivt stoffblanding. Dette fenomenet kan tilskrives utvidelsen av ME-oljekjernen, og den høye overflateaktive konsentrasjonen som kraftig reduserer olje-vann-grensesnittspenningen for å redusere dråpestørrelsen. Videre ble ME-viskositeten forhøyet som følge av økt nivå av overflateaktive stoffer og redusert vann. pH-verdiene for alle ME-er falt innenfor det passende området på 5.0-7.5 (tabell III) og var derfor kompatible med hudvevet. Når det gjelder fysisk stabilitet, ble det ikke observert faseseparasjon, brudd eller medikamentutfelling i noen av de testede ME-ene, noe som indikerer at ME-ene hadde tilfredsstillende termodynamisk stabilitet mot sentrifugering. Fargestoffløselighetstesten avslørte at et vannløselig fargestoff (metyloransje) fordelte seg jevnt gjennom ME-systemet, noe som antydet at det dannede ME var av O/W-type (data ikke vist). Mikrofotografiene avslørte separate enkelt ME5-dråper med en sfærisk kontur (fig. 4). Exvivo hudpermeasjonsstudie. Permeasjonsprofilene til alle de testede kjøretøyene fulgte nullordens frigjøringskinetikk (26,27) og ME5 ga den høyeste transdermale fluksen av PG (86.795±0.23 µg/cm{{28 }} /h-1; Fig. 5; Tabell III). I denne studien ble effekten av oljeinnhold og overflateaktivt stoffblanding på hudgjennomtrengningen av PG bestemt. Resultatene indikerte at overflateaktive stoffer forbedrer hudgjennomtrengning ved å øke membranfluiditet, medikamentoppløselighet og ekstraksjon av lipid fra stratum corneum. Gjennomtrengningshastigheten til ME5 (86.795±0.23 µg/cm-2 /t-1) var signifikant økt sammenlignet med permeasjonsratene til ME1 (69.57±{ {48}}.78, P=0.0094), ME2 (44.326±0.84, P{{50}} .0052), ME3 (79.859±0.12, P=0.039) og ME4 (58.332±0.39 µg/cm-2 /t-1 , P=0.0063, Fig. 5; Tabell III) Dette var i samsvar med resultatene fra en tidligere studie, der den termodynamiske aktiviteten til ME-medikamentlasten kan avta med økningen av overflateaktive stoffnivåer (12,28 ). Viskositeten til ME5 (30,43±0,12 mPa.s) var lavere sammenlignet med den andre ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0.0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60.49±1.34 mPa.s, P=0.0094) og ME4 (43.27±0.21 mPa.s, P=0.0059).