For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

KLIKK HER FOR DEL 1

Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer

Acteosid påvirker ikke osteoblastogenese i benmargsceller

Den role avakteosidpå osteoblastisk differensiering ble videre undersøkt ved bruk av benmargsceller. Som vist i fig. 10A, økte DAG-behandling antallet rødfargede alizarinceller, og dette ble ikke endret med 10 mMakteosidforbehandling. Mengden av tilstedeværende fargestoff indikerte at de kombinerteakteosidog DAG-behandling endret ikke mineralisering (fig. 10B). Tilsvarende ble ikke DAG-induserte økninger i det intracellulære kalsiuminnholdet (fig. 10C) og mRNA-nivåer (fig. 10D) av benspesifikke markører, som Runx2, osterix, BSP og OC, påvirket av forbehandling medakteosid.

Diskusjon

Benremodellering er tett regulert av balansen mellom bendannelse av osteoblaster og benresorpsjon av osteoklaster. Langvarig og overdreven benresorpsjon forårsaker ubalanse i skjelettomsetningen, noe som resulterer i benresorptive sykdommer. For å utforske effekten av akteosid på osteoklastogenese, brukte vi to makrofager, primære dyrkede BMM-er og RAW264.7-celler. Disse cellene ble stimulert med RANKL til å differensiere til osteoklaster i nærvær og fravær avakteosid. Det viste vi for første gangakteosidhemmer osteoklastdifferensiering og -dannelse. Acteosid i seg selv ved de undersøkte konsentrasjonene forårsaket ikke en reduksjon i levedyktigheten til de primære dyrkede makrofagene under både vekst- og differensieringsbetingelser.Akteosidbehandling reduserte også resorpsjonsaktiviteten til modne osteoklaster. Disse resultatene tyder på detakteosidundertrykker osteoklastisk dannelse fra makrofager og osteoklastresorpsjonsaktivitet. Resultatene fra kultursystemet vårt, som ikke inkluderte osteoblaster eller stromaceller, tyder også på at acteosid forhindrer osteoklastdannelse ved å virke direkte på osteoklastforløpere. RANKL aktiverer MAPK-er inkludert p38, ERK og JNK. Disse tre kinasene er involvert i tidlig osteoklastisk differensiering og dermed deres hemming farmakologisk eller med en dominant-negativ JNK-transfeksjon undertrykker RANKL-indusert osteoklastogenese [29]. Resultatene våre avslørte at akteosid-forbehandling hemmet alle disse kinasene, noe som indikerer en ikke-spesifikk nedregulering av MAPK-er. Dette resultatet skilte seg delvis fra den forrige rapporten at EGCG, den viktigste antiinflammatoriske forbindelsen i grønn tee, spesifikt svekket JNK-aktivering uten å påvirke eller p38-aktivering i RANKL-stimulerte BMMer [7]. Paeonol, en anti-inflammatorisk forbindelse avledet fra en kinesisk urt, har også blitt rapportert å hemme ERK og p38, men ikke søppel, fosforylering i RANKL-stimulerte RAW264.7-celler [30]. I motsetning til dette, svekket silibinin, en ny hemmer i bein, rangindusert aktivering av p38, ERK og JNK [31]. Disse funnene tyder på at effekten av anti-resorptive forbindelser på MAPK-aktivering av RANKL avhenger av forbindelsen, selv om alle tre MAPK-ene er involvert i tidlig osteoklastogenese. Med tanke på observasjonen somakteosidsvekkede p-JNK-nivåer i RANKL-stimulerte BMM-er, selv ved 1 mm, så blokkeringen av JNK i stedet for av p38 MAPK eller ERK ut til å være en mer spesifikk hendelse iakteosid-mediert anti-osteoklastogenese i cellene. Selv omakteosidved samme konsentrasjon reduserte ikke antall osteoklaster i BMM, var det en signifikant reduksjon i gropdannelse vedakteosidbehandling. Vi fant også at forbehandling med SP600125, en farmakologisk hemmer spesifikk for JNK, dramatisk forhindret dannelsen av osteoklaster (data ikke vist). Samlet antyder disse funnene at JNK-mediert signalering er nært knyttet tilakteosidmediert undertrykkelse av osteoklastogenese stimulert av RANKL. NF-kB-signalering regulerer cellulære hendelser, inkludert apoptose, cellesyklusprogresjon, celleadhesjon, cytokinproduksjon og overlevelse i makrofager [32]. NF-kB-signalering er også nødvendig for osteoklastutvikling, noe som har blitt demonstrert ved utseendet av osteopetrose hos NF-kB-knockout-mus [33,34]. Derfor foreslås hemming av NF-kB å være et effektivt mål for antiresorptive midler for å nedregulere osteoklastaktivitet og behandle osteoporose. Post-translasjonell modifikasjon av NF-kB-underfamilieproteiner er avgjørende for å modulere NF-kB-aktivitet. Spesielt er fosforylering av p65-underenheten og IkB-kinase kritisk for at NF-kB skal indusere osteoklastogenese [7]. Våre nåværende funn viste at RANKL-stimulering økte DNA-bindingsaktiviteten til NF-kB og fosforylering av p65-underenheten og Ikea i både BMM-er og RAW264.7-celler. Forbehandling medakteosidhemmet disse RANKL-induserte økningene, noe som resulterte i nedregulert NF-kB-aktivitet. Følgelig antyder disse resultatene at, i tillegg til MAPK-er, er NF-kB-signalering hovedmålet forakteosidi å hemme osteoklastdifferensiering og dannelse fra RANKL-stimulerte makrofager. I tillegg til NF-kB-signalering, spiller c-Fos/c-Jun/NFATc1-banen nøkkelroller i osteoklastutvikling, og derfor kan mangelen på noen av disse proteinene stoppe osteoklastogenese. I denne studien fant vi at acteosid forhindret RANKL-indusert c-Fos- og NFATc1-ekspresjon på mRNA- og proteinnivåer. JNK er enoppstrøms kinase av c-Jun, som er nødvendig for NFATc1-ekspresjon og osteoklastogenese som respons på RANKL [29]. Blokkering av JNK/c-Jun-banen med en JNK-hemmer reduserte RANKL-indusert osteoklastdannelse og c-Fos og NFATc1-uttrykk [7]. Våre resultater og tidligere funn tyder på at hemming av JNK-mediert signalering av acteosid er nært assosiert med å forhindre RANKL-mediert c-Fos og NFATc1.

ekspresjon, som undertrykker osteoklastdifferensiering i makrofager. Forskjeller i effekten av akteosid på BMM-er og RAW264.7-celler skyldes i det minste delvis forskjeller i følsomheten for JNK-hemming. TNF-a kan indusere osteoklastogenese uavhengig av RANKL-RANK-signalering [37]. IL-1 er en potent mediator av patologisk beinødeleggelse indusert av østrogenmangel eller betennelse[7]. Å forstyrre type I IL-1-reseptoren eller IL-1-signalering kan reversere bentap indusert av ovariektomi [38] eller revmatoid artritt [39]. Denne studien demonstrerte evnen tilakteosidå redusere produksjonen av inflammatoriske cytokiner som TNF-a, IL-1b og IL-6 i makrofager. Akteosid antas å hemme inflammatorisk cytokinproduksjon ved å undertrykke p38 kinase og ERK signalering fordi aktivering av ERK1/2, p38 MAPK eller begge er nødvendig for lipopolysakkarid-indusert produksjon av disse cytokinene i makrofager [40,41]. Luteolin, en inflammatorisk forbindelse, hadde også blitt rapportert å undertrykke produksjonen av inflammatoriske mediatorer ved å hemme aktivering av p38 MAPK [42]. I denne studien fant vi også at akteosid svekket bentap hos ovariektomiserte mus, som bevist av den gjenopprettede maksimale frakturkraften ved midtskaftet av høyre lårben og forsvinningen av osteoporotisk kortikalt bein. Muntligakteosidadministrering nedregulerte de ovariektomiserte induserte økningene i serum IL-1b og IL-6 nivåer, men ikke ALP. De økte serumnivåene av kalsium, TRAP og OC i OVX ble også hemmet ved oral behandling med akteosid, noe som tyder på atakteosiddemper endring av biomarkører spesifikke for bendannelse så vel som resorpsjon. Siden osteoporose er preget av redusert massetetthet og forverret trabekulær benmikroarkitektur, ble OVX-indusert trabekulært bentap og morfometriske parameterendring betydelig hemmet av oralakteosidadministrasjon. Disse funnene tyder på detakteosidkan brukes som et anti-resorptivt middel for å behandle osteoporose ved å reversere ubalansert osteoklastaktivering. Imidlertid er osteoblaster den primære faktoren som er ansvarlig for ny beindannelse. Derfor er det nødvendig med et middel som er i stand til å øke osteoblastproliferasjon eller differensiering for å forbedre bendannelse [30]. Derimot fant vi at akteosid ikke påvirket osteoblastdifferensiering eller mineralisering i DAG-behandlede benmargsceller. Samlet tyder våre resultater på at akteosid har en anti-resorpsjonseffekt, men ikke direkte påvirker beindannelsen. Mer detaljerte eksperimenter som analyserer beinspesifikke parametere in vivo og in vitro er nødvendig for å avklare hvorvidt acteosid fordeler osteoblastogenese. Denne studien fremhever den hemmende effekten av akteosid på osteoklastdifferensiering og benresorpsjon ved å undertrykke MAPKs og flere transkripsjonelle faktorer som NF-kB, c-Fos og NFATc1. Dataene antyder to mulige mekanismer som acteosid har disse fordelene med. En mulighet er detakteosid

hemmer osteoklastogenese på grunn av dets antioksidantpotensial. Tallrike studier har vist at reseptormediert ROS-produksjon kan tjene som en nedstrøms signalmediator [43–45]. Noen få kinaser og transkripsjonsfaktorer er følsomme for den cellulære redokstilstanden, som påvirker ulike cellulære hendelser. RANKLstimulerer ROS-produksjon, som medierer RANKL-induserte cellulære responser for osteoklastdifferensiering [24]. Forbehandling med antioksidanter, som N-acetylcystein og glutation, forhindret RANKL-mediert ROS-generering, noe som indikerer at antioksidanter reduserer bentap ved å senke RANKL-indusert reproduksjon [24]. I samsvar med disse funnene avslører den nåværende studien at acteosid demper intracellulær ROS produsert i BMMs under osteoklastdifferensiering på en doseavhengig måte. Denne observasjonen antyder at hemmingen av osteoklastogenese i det minste delvis skyldes antioksidantpotensialet tilakteosid. Vi foreslår også at acteosid kan nedregulere Ca2 pluss tilstrømning, og dermed undertrykke osteoklastogenese. Akteosid ble nylig rapportert å hemme type I-allergier ved å nedregulere/NFAT- og JNK-signalering i basofile celler [46]. Den kalsiumfølende reseptoren er nært knyttet til reguleringen av osteoklastogenese [47]. Dette forholdet antyder at en kalsiumkanal er involvert iakteosid-indusert hemming av osteoklastdifferensiering og -dannelse.

Det kreves imidlertid ytterligere studier for å utforske de eksakte mekanismene somakteosidfungerer som et anti-resorptivt middel gjennom modulering av Ca2 pluss homeostase. Avslutningsvis viser våre nåværende funn atakteosidhemmer RANKL-indusert osteoklastdifferensiering fra BMM-er og RAW264.7-makrofager og undertrykker benresorpsjon av modne osteoklaster.Akteosidforhindrer også RANKL-indusert aktivering av tre velkjente MAPK-er og transkripsjonsfaktorer som NF-kB, c-Fos og NFATc1, samt produksjon av inflammatoriske cytokiner som TNF-a, IL-1b, og IL-6.

I tillegg oral administrering avakteosiddemper ovariektomi-indusert osteoporose, selv om det ikke påvirker osteoblastogenese fra benmargsceller. Samlet antyder disse funnene at CTE-siden har gunstige roller i å redusere osteoklastdannelse og aktivitet som et potent anti-resorptivt middel.

støttende informasjon

Figur S1 Kjemisk struktur av akteosid.(TIF)

Figur S2 Acteosid forhindrer RANKL-indusert gropdannelse i BMMer.

En BMM ble forbehandlet med de angitte dosene av akteosid i 2 timer i benbelagte 24-brønnplater og stimulert med 50 ng/ml M-CSF og 10{{15} } ng/ml RANKL i 7 dager. Gropdannelse ble observert under optisk mikroskopi. B, BMM-er ble dyrket med M-CSF og RANKL i nærvær av forskjellige akteosidkonsentrasjoner (0–20 mM), og 7 dager senere ble det resorberte området kvantifisert fra 3 uavhengige eksperimenter og uttrykt som en prosentandel av kontroll (n=4 per eksperiment). *p,0.05, **p,0.01 og ***p,0.001 vs. celler dyrket med M-CSF og rangering. (TIF)Figur S3 Acteosid demper produksjonen av inflammatoriske cytokiner i RANKL-stimulerte RAW264.7-celler. Celler ble forbehandlet med de økende konsentrasjonene (0–10 mM) av acteosid i 2 timer etterfulgt av stimulering med 100 ng/ml RANKL i 48 timer. Nivåene av TNF-a, IL-1b og IL-6 ble bestemt ved å bruke ELISA-sett. ***p,0,001 vs. celler uten RANKL og akteosid. #p,0.05 og ##p,0.01 vs. celler stimulert kun med RANKL.

Referanser

1. Rho J, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimmunologi: interaksjoner mellom immun- og skjelettsystemet. Molecules and Cells 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Ben og benmarg: samme organ. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporose: nå og fremtiden. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Benmetastase i prostatakreft: nye terapeutiske strategier. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Funn, narkotika og skjelettlidelser. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutiske tilnærminger til beinsykdommer. Science 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigallocatechin-3- gallat hemmer osteoklastogenese ved å nedregulere c-Fos-uttrykk og undertrykke kjernefaktor-kappaB-signalet. Molecular Pharmacology 77: 17– 25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, en benzamidhistondeacetylasehemmer, forhindrer osteoklastogenese ved å nedregulere c-Fos-uttrykk og undertrykker bentap hos mus. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, Ma JY (2013) Den anti-osteoporotiske effekten av Yijung-tang i en ovariektomisert rottemodell mediert av hemming av osteoklastdifferensiering. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Fiskeolje undertrykker benresorpsjon ved å hemme osteoklastogenese gjennom redusert ekspresjon av M-CSF, PU.1, MITF og RANK hos ovariektomiserte rotter. Molecular Medicine Reports 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklasten: en multinukleert, hematopoetisk opprinnelse, benresorberende osteoimmuncelle. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Reguleringsmekanisme for osteoklastogenese av RANKL- og Wnt-signaler. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.

13. Jules J, Zhang P, Ashley JW, Wei S, Shi Z, et al. (2012) Molekylær grunnlag for kravet om reseptoraktivator for nukleær faktor-kB-signalering for interleukin 1--mediert osteoklastogenese. Journal of Biological Chemistry 287: 15728–15738.

14. Li C, Yang Z, Li Z,Ma Y, Zhang L, et al. (2011) Maslinsyre undertrykker osteoklastogenese og forhindrer ovariektomi-indusert bentap ved å regulere RANKL-mediert NF-kB og MAPK signalveier. Journal of Bone and Mineral Research 26: 644–656.

15. Tomoda M, Miyamoto H, Shimizu N (1994) Strukturelle egenskaper og anti-komplementær aktivitet av rehmannan SA, et polysakkarid fra roten tilRehmannia glutinosa. Kjemisk og farmasøytisk bulletin (Tokyo) 42: 1666–1668.

16. Kim H, Lee E, Lee S, Shin T, Kim Y, et al. (1998) Effekt avRehmannia glutinosa på en umiddelbar allergisk reaksjon. International Journal of Immunopharmacology 20: 231–240.

17. Schapoval EE, Vargas MR, Chaves CG, Bridi R, Zuanazzi JA, et al. (1998) Antiinflammatoriske og antinociseptive aktiviteter av ekstrakter og isolerte forbindelser fraStachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology 60: 53–59.

18. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, et al. (1998) Hepatobeskyttende aktivitet av fenyletanoider fra Cistanche deserticola.Planta Medica 64: 120–125.

19. Chun JC, Kim JC, Hwang IT, Kim SE (2002) Acteoside fraRehmannia glutinosaannullerer paraquat aktivitet iCucumis sativus. Pesticide Biochemistry and Physiology 72: 153–159.

20. Kim SS, Son YO, Chun JC, Kim SE, Chung GH, et al. (2005) Antioksidantegenskaper til en aktiv komponent renset fra bladene av paraquat-tolerantRehmannia glutinosa. Redoksrapport 10: 311–318.

21. Son YO, Lee SA, Kim SS, Jang YS, Chun JC, et al. (2011) Acteosid hemmer melanogenese i B16F10-celler gjennom ERK-aktivering og tyrosinase-nedregulering. The Journal of Pharmacy and Pharmacology 63: 1309–1319.

22. Yu JY, Lee SY, Son YO, Shi X, Park SS, et al. (2012) Kontinuerlig tilstedeværelse av H₂O₂induserer mitokondrie-mediert, MAPK- og caspase-uavhengig vekstinhibering og cytotoksisitet i humane gingivalfibroblaster. Toxicology In Vitro 26: 561–570.

23. Lu J, Yu JY, Lim SS, Son YO, Kim DH, et al. (2013) Cellulære mekanismer for de cytotoksiske effektene av zearalenonmetabolittene a-zearalenon og b-zearalenon på RAW264.7 makrofager. Toksikologi in vitro 27: 1007–1017.

24. Ha H, Kwak HB, Lee SW, Jin HM, Kim HM, et al. (2004) Reaktive oksygenarter medierer RANK-signalering i osteoklaster. Eksperimentell celleforskning 301: 119–127.

25. Cho ES, Kim MK, Son YO, Lee KS, Park SM, et al. (2012) Effektene av rosiglitazon på osteoblastisk differensiering, osteoklastdannelse og benresorpsjon. Molecules and Cells 33: 173–181.

26. Son YO, Jang YS, Heo JS, Chung WT, Choi KC, et al. (2009) Apoptose-induserende faktor spiller en kritisk rolle i caspase-uavhengig, pyknotisk celledød i hydrogenperoksid-eksponerte celler. Apoptosis 14: 796–808.

27. Kook SH, Jeon YM, Park S, Lee JC (2013) Periodontale fibroblaster modulerer spredning og osteogen differensiering av embryonale stamceller gjennom produksjon av fibroblastvekstfaktorer. Journal of Periodontology In Press

28. Qi W, Yan YB, Lei W, Wu ZX, Zhang Y, et al. (2012) Forebygging av ubrukelig osteoporose hos rotter avCordyceps Sinensisekstrakt. Osteoporosis International 23: 2347–2357.

29. Ikeda F, Nishimura R, Matsubara T, Tanaka S, Inoue J, et al. (2004) Kritiske roller for c-jun-signalering i reguleringen av NFAT-familien og RANKL-regulert osteoklastdifferensiering. Journal of Clinical Investigation 114: 475–484.

30. Tsai HY, Lin HY, Fong YC, Wu JB, Chen YF, et al. (2008) Paeonol hemmer RANKL-indusert osteoklastogenese ved å hemme ERK-, p38- og NF-kappaB-veien. European Journal of Pharmacology 588: 124–133.

31. Kim JH, Kim K, Jin HM, Song I, Youn BU, et al. (2009) Silibinin hemmer osteoblastdifferensiering mediert av TNF-familiemedlemmer. Molecules and Cells 28: 201–207.

32. Napetschnig J, Wu H (2013) Molekylær basis for NF-kB-signalering. Annual Review of Biophysics 42: 443–468.

33. Franzoso G, Carlson L, Xing L, Poljak L, Shores EW, et al. (1997) Krav til NF-kappaB i osteoklast- og B-celleutvikling. Gener og utvikling 11: 3482–3496.

34. Iotsova V, Caamano J, Loy J, Yang Y, Lewin A, et al. (1997) Osteopetrose hos mus som mangler NF-kappaB1 og NF-kappaB2. Naturmedisin 3: 1285–1289.

35. Teitelbaum SL (2004) RANKING c-jun i osteoklastutvikling. The Journal of Clinical Investigation 114: 463–465.

36. Takayanagi H (2005) Mekanistisk innsikt i osteoklastdifferensiering i osteoimmunologi. Journal of Molecular Medicine (Berl) 83: 170–179.

37. Cho ES, Lee KS, Son YO, Jang YS, Lee SY, et al. (2010) Komprimerende mekanisk kraft forsterker osteoklastogenese av benmargsmakrofager gjennom aktivering av c-Fms-mediert signalering. Journal of Cellular Biochemistry 111: 1260–1269.

38. Lorenzo JA, Naprta A, Rao Y, Alander C, Glaccum M, et al. (1998) Mus som mangler type I interleukin-1 reseptor mister ikke benmasse etter ovariektomi. Endocrinology 139: 3022–3025.

39. Abramson SB, Amin A (2002) Blokkering av effekten av IL-1 ved revmatoid artritt beskytter bein og brusk. Rheumatology (Oxford) 41: 972–980.

40. Hwang JM, Yu JY, Jang YO, Kim BT, Hwang KJ, et al. (2010) En fenolsyre-fenetylureaforbindelse hemmer lipopolysakkarid-indusert produksjon av nitrogenoksid og pro-inflammatoriske cytokiner i cellekultur. International Immunopharmacology 10: 526–532.

41. Fang M, Lee SY, Park SM, Choi KC, Lee YJ, et al. (2011) Anti-inflammatorisk potensial avPhaseolus calcaratus Roxburgh, en orientalsk medisin, på LPS-stimulerte RAW 264.7 makrofager. The Journal of Pharmacy and Pharmacology 63: 120–128.

42. Lee JW, Ahn JY, Hasegawa S, Cha BY, Yonezawa T, et al. (2009) Hemmende effekt av luteolin på osteoklastdifferensiering og funksjon. Cytotechnology 61: 125–134.

43. Cosentino-Gomes D, Rocco-Machado N, Meyer-Fernandes JR (2012) Cellesignalering gjennom proteinkinase C-oksidasjon og aktivering. International of Journal Molecular Sciences 13: 10697–10721.

44. Lee JC, Son YO, Pratheeshkumar P, Shi X (2012) Oksidativt stress og metallkarsinogenese. Fri radikal biologi og medisin 53: 742–757.

45. Nguyen Ngoc TD, Son YO, Lim SS, Shi X, Kim JG, et al. (2012) Natriumfluorid induserer apoptose i embryonale stamceller fra mus gjennom ROS-avhengige og caspase- og JNK-medierte veier. Toxicology and Applied Pharmacology 259: 329–337.

46. ​​Motojima H, Villareal MO, Iijima R, Han J, Isoda H (2013) Acteosid hemmer type I allergi gjennom nedregulering av Ca/NFAT og JNK MAPK signalveier i basofile celler. Journal of Natural Medicines In Press

47. Caudrillier A, Hurtel-Lemaire AS, Wattel A, Cournarie F, Godin C, et al. (2010) Strontiumranelat reduserer reseptoraktivator av nukleær faktor-kB ligandindusert osteoklastisk differensiering in vitro: involvering av den kalsiumfølende reseptoren. Molecular Pharmacology 78: 569–576.