Del 2: Echinacoside øker spermmengden hos rotter ved å målrette mot den hypotalamiske androgenreseptoren
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 og Xiaoying Zhang1,2
Eksperiment behandling.
Eksperiment 1. Mus ble tilfeldig delt inn i seks grupper, syv mus i hver gruppe (n=7).ECH(Echinacoside fra cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Kina) ble administrert ved hjelp av en intragastrisk sonde, og testosteronpropionat (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Kina) ble gitt ved intramuskulær injeksjon én gang daglig i 14 dager i henhold til følgende eksperimentelle design: Kontrollgruppe: normal saltvann (10 ml/kg), ECH(L)gruppe (5 mg/kg), ECH(M)gruppe (20 mg/kg), ECH(H)gruppe (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) og enzalutamid (AR-hemmer, én gang daglig annenhver dag i 14 dager; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Shanghai, Kina).
Etter 2 ukers behandlinger ble musene bedøvet med dietyleter for å samle blodprøver for analyser av hormonnivåer. Musene ble deretter dissekert for å skille hypothalamus, encephalon pluss hypofyse, testis og cauda epididymis. Prøver av cauda epididymis ble satt i vanlig saltvann med 5 prosent BSA for sædkvalitetsvurdering, og hypothalamus, encephalon pluss hypofyse og testikler ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 grader for videre undersøkelser.
Eksperiment 2. Mus ble tilfeldig delt inn i 10 grupper, fem dyr per gruppe. ECH (20 mg/kg) ble administrert oralt og musene i hver gruppe ble bedøvet med dietyleter på tidspunktene 0,5 t, 1 t, 1,5 t, 2 t, 2,5 t, 3 t, 4 t, 6 t, 9 t og 12 timer etter administrering for prøvetaking.
Plasma ble samlet og hjertet ble eksponert. Perfusjon av normalt saltvann inn i venstre ventrikler ble utført av et infusjonsapparat inntil leveren og lungene ble blanchert. Deretter ble hypothalamus og testikler samlet for å bestemme vevskonsentrasjonene av ECH(Echinacoside fra cistanche).
Eksperiment 3. Mus ble tilfeldig delt inn i 4 grupper, syv i hver gruppe. ECH(Echinacoside fra cistanche)og BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Kina) ble administrert med en intragastrisk sonde én gang daglig i 6 uker i henhold til følgende eksperimentelle design: normal gruppe (maisolje, 10 mL/kg, kroppsvekt/ d), modellgruppe: BPA-gruppe (BPA 200 mg/kg, kroppsvekt/d, maisolje), og forsøksgruppe: BPA pluss ECH-gruppe (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).
Etter 42 dagers behandling ble musene bedøvet med dietyleter og blodprøvene ble samlet for hormonnivåanalyser. Testis og cauda epididymis ble separert og samlet. Cauda epididymis ble brukt til sædkvalitetsvurdering og testis ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 grader for videre undersøkelse.
Figur 7. Baner regulert av utvalgt HPG-akserelatert hormon og protein i mannlig reproduksjon som forutsagt av Pathway Ontology Database og KEGG Pathway Database.
Merknader: Regulerte prosesser er representert av bakgrunner med forskjellige farger og former, og regulatoriske hendelser vises ved hjelp av piler og linjer.
Referansene knyttet til hvert protein var basert på Pathway Ontology Database og KEGG Pathway Database, og er ikke oppført.
Bestemmelse av sædkvalitet. Klargjøring av sædsuspensjon. Cauda epididymider ble hakket inn i 5 ml normal saltvann med 5 prosent BSA og inkubert i 5 minutter ved 37 grader for å la innholdet spre seg inn i mediet.
Spermnummer: I henhold til metoden beskrevet av Yokoi (2003), ble den fortynnede sædsuspensjonen (1:10; v/v; sædsuspensjon/10 prosent metanol) overført til hvert tellekammer i et hemocytometer og fikk stå i 5 min og deretter telt under et lysmikroskop (Nikon, Instruments Inc., Japan) ved X200 forstørrelse.
Spermlevedyktighet: Totalt 20 μL spermasuspensjon ble blandet med et likt volum eosin-nigrosin-farge i 2 minutter; de ufargede sædcellene ble talt under et lysmikroskop ved 200x forstørrelse.
Spermmotilitet: Totalt 10 μL spermsuspensjon ble satt på et glassglass og ble registrert som enten mobilt eller immobilt under et lysmikroskop ved 200x forstørrelse.
Bestemmelse av hormonnivåer. Nivåer av testosteron (T) og LH ble kvantifisert i serum, encephalon pluss hypofyse- og testishomogenater ved bruk av radioimmunoassay (RIA)-sett (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, Kina). Kort fortalt ble anti-testosteron eller anti-LH IgG-antistoff (100 μL) og 125-I-konjugert anti-muse-antistoff tilsatt til prøver eller standarden (100 μL), og blandet på en vippe over natten ved 4 grader. Etter vask tre ganger med PBS-Tween 20 (500 μL), ble blandingene sentrifugert (3500 rpm/min) ved 4 grader i 15 min. CPM-verdiene til utfellingene ble vurdert med radioimmunoassay-instrument (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, Kina) og konsentrasjonene av T og LH ble beregnet i henhold til formelen til en standard kurve. T- og LH-variasjonskoeffisienten er henholdsvis 2,8 prosent og 3,2 prosent i utvalgsgrupper, og 2,1 prosent og 2,8 prosent i standardgrupper.
Bestemmelse av genuttrykk ved sanntids kvantitativ PCR. Totalt RNA ble isolert fra frosset testikkel og encefalon pluss hypofysevev ved å bruke et RNA Simple Total RNA-sett (Tiangen, Beijing, Kina). Kvantitativ sanntids-PCR (q RT-PCR) ble utført for amplifikasjon av cDNA ved bruk av 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Kina). PCR-prosedyren besto av 95 grader i 30 sekunder etterfulgt av 35 sykluser på 95 grader i 15 sekunder, 58 grader i 30 sekunder og 72 grader i 30 sekunder. Smeltekurveanalysen ble utført på PCR-produktene for å bekrefte primerspesifisitet og produktrenhet. En dissosiasjonskurve ble utført for hver plate for å bekrefte produksjonen av et enkelt produkt. Den relative mengden av hvert mRNA ble beregnet. PCR-primerne brukt for studien er vist i tabell 2.
Western blot. For AR-ekspresjonsanalyse ble ekstraksjonen og isoleringen av cytoplasmatisk og nukleært protein utført ved bruk av et cytoplasmatisk og nukleært proteinekstraksjonssett (Beyotime, Nanjing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjonene av cytoplasmatiske og nukleære proteiner ble vurdert ved bruk av et Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Kina). Proteinprøver (80 ug) ble kjørt på en 12 prosent og 5 prosent SDS-PAGE gel og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering ble membranene inkubert med anti-AR IgG-antistoffer (1:1,000; Bioss; Beijing Kina), og muse polyklonale anti-GAPDH-antistoffer (1:1,000; Wuhan Boster BiologiskTechnology, Wuhan, Kina) eller mus polyklonale anti-Lamin b1 antistoffer i 2 timer. Membranen ble vasket tre ganger med TBST og inkubert med et HRP-konjugert kanin-anti-muse-IgG-antistoff (1:5,000; Bioss; Beijing Kina). Signalet ble visualisert ved hjelp av ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Shanghai, Kina).
Høyytelses væskekromatografi (HPLC) analyse. Blod ble samlet i hepariniserte glassrør. Plasmaet ble separert ved umiddelbar sentrifugering ved 6,000 rpm i 10 min og lagret ved -20 grader for videre eksperiment. Hypothalamus- og testisprøvene fra hvert tidspunkt ble samlet og homogenisert med metanol. Etter sentrifugering ved 10,000 rpm ved 4 grader i 10 minutter, ble supernatanten konsentrert med N2 og resten ble oppløst i 50 μL metanol og filtrert gjennom et 0,45 μm filter. Ti μL av den prøvefiltrerte væsken ble injisert i HPLC-systemet for analyse.
Standardkurven besto av prøver som inneholdt 50, 100, 250, 500 og 750 ng/mL av ECH(Echinacoside fra cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Kina). Plasmakvalitetskontrollprøver tilsatt 75 ng/ml (lav), 150 ng/ml (middels) og 300 ng/ml (høy) av ECH ble derfor forberedt for å måle nøyaktigheten og presisjonen til metoden.
Kromatografi ble utført med et HPLC-system (D2{{10}}00 Elite-serien, Hitachi, Japan) koblet til en UV-detektor (L-2400, Hitachi, Japan). Separasjon ble utført på en Thermo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, 4,6 μm partikler) kolonne holdt ved 25 grader. Den mobile fasen var en gradient fremstilt fra 0,1 prosent fosforsyre inneholdende 0,04 prosent trimetylamin (komponent A) og metanol (komponent B). Den lineære gradienten var som følger: 70–90 prosent A over 0-2 min, 60–70 prosent A over 2–6 minutter, 55–60 prosent B over 6–8 minutter og deretter tilbake til 90 prosent A ved 8. min umiddelbart. Strømningshastigheten var 0,8 ml/min. UV-detektoren ble operert ved 332 nm. Toppområdet ble evaluert som analytisk måling.
Farmakokinetiske studier på mus. Penetrasjonen av ECH(Echinacoside fra cistanche)til hypothalamus og testis ble utsatt for farmakokinetisk analyse med Drug and Statistics-programvare (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetiske parametere ble bestemt ved bruk av den ikke-kompartmentelle metoden basert på statistisk momentteori. De foreløpige farmakokinetiske parametrene inkludert tid til toppkonstant (Tmax), toppkonsentrasjon (Cmax), eliminasjonshastighetskonstant (Ke), eliminasjonshalveringstid (T0.5), arealet under kurven (AUC{ {4}}–12), tilsynelatende distribusjonsvolum (Vc) og klaring (CL) ble oppnådd for videre analyse. Hjerne/plasma-forhold ble beregnet basert på AUC0-t-verdier for plasma og hjerne.
ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) syntese og identifikasjon. Totalt 9,8 mg ECH(Echinacoside fra cistanche)og 1,0 mg butandiolanhydrid ble oppløst i 2 ml pyridin, blandet i 12 timer under omrøring ved romtemperatur. Blandingen ble konsentrert med N2 og resten ble kombinert med 10,8 mg N-hydroksysuksinimid (NHS) og 19,3 mg dicykloheksylkarbodiimid (DCC) og oppløst i 4 ml N, N-dimetylformamid (DMF) i 12 timer under omrøring ved romtemperatur . Etter sentrifugering ved 2,000 g i 5 minutter ved 4 grader, ble supernatanten tilsatt til 5 ml PBS hvori 14,4 mg ovalbumin (OVA) ble oppløst. Den nye blandingen ble omrørt i 24 timer ved 4 grader. Reaksjonsløsningen ble deretter dialysert mot PBS i tre dager. Tilstedeværelsen av ECH-OVA ble bekreftet av UV-spektra (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) ved en bølgelengde fra 190 til 400 nm samt ved denaturering av PAGE.
Indirekte ELISA (iELISA). En mikrotiterplate ble belagt med ECH-OVA (2 ug/100 μL) og inkubert over natten ved 4 grader. Platen ble vasket tre ganger med PBST og to ganger med PBS; og 5 prosent PBSM (PBS som inneholder 5 prosent skummet melk) ble tilsatt for å blokkere de ubundne stedene ved 37 grader i 2 timer. Etter at platene var vasket med PBST og PBS, ble brønnene delt inn i 4 grupper; eksperimentell gruppe, 1 ug AR totalt protein/100 μL; positiv gruppe, kanin-anti-OVA-antistoff (1:1,000); negativ gruppe, 1 ug bovint serumalbumin; og en blank gruppe inneholdende PBS. Etter inkubasjon i 1,5 time ble platene vasket, og 100 μL/brønn med kanin HRP-konjugert IgG (1:1,000) ble tilsatt til den positive gruppen, 100 μL/brønn anti-AR ble tilsatt (1:1,000) til de andre gruppene. Etter inkubering i 1,5 timer ble kanin HRP-konjugert IgG (1:5,000) fortynning tilsatt til platene. Etter inkubering ved 37 grader i 1 time ble platene vasket tre ganger med PBST og to ganger med PBS. TMB ble deretter tilsatt og inkubert i 10 minutter i mørket ved romtemperatur og 2 M H2SO4 ble tilsatt for å stoppe reaksjonen. Absorbansen ble avlest ved en bølgelengde på 450 nm.
Molekylær dokking. En molekylær docking-studie ble utført for å undersøke bindingsmåten til forbindelsen ECH(Echinacoside fra cistanche)til den humane androgenreseptoren (AR) ved å bruke Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Den tredimensjonale (3D) strukturen til AR (PDB ID: 2YHD) ble lastet ned fra Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D-strukturen til ECH ble oppnådd av programvaren ChemBioDraw Ultra 14.0 og ChemBio 3D Ultra 14.0. AutoDockTools 1.5.6-pakken (http://mgltools.scripps.edu) ble brukt for å generere dokkinginndatafilene. Søkenettet til AR ble identifisert som center x: 36.141, center y: 8.513, og center z:
21.304 med dimensjoner størrelse x: 15, størrelse y: 15, og størrelse z: 15. Verdien av uttømmende ble satt til 20. For Vina-dokking ble standardparametrene brukt hvis det ikke var nevnt. Posisjonen med best poengsum, bedømt av Vina-dokkingscore, ble valgt og visuelt analysert ved hjelp av PyMOL 1.7.6-programvaren (http://www.pymol.org).
Dataanalyse og statistiske metoder. Dataene ble analysert ved hjelp av statistisk programvare SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En enveis ANOVA ble brukt for sammenligning mellom gruppene. Tukeys sammenligningstester av signifikante forskjeller mellom grupper ble bestemt. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) ved bruk av Graph Pad Prism programvare v.7 (GraphPad Software, Inc, California, USA).
Etikkgodkjenning og samtykke til å delta. Etisk godkjenning for denne studien ble innhentet fra den etiske komiteen ved Anyang Institute of Technology.
Referanser
1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Trening, trening og hypothalamus-hypofyse-gonadal aksen hos menn og kvinner.Front. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).
2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Rollen til mitokondrier i steroidogenese. Beste praksis. Res. Cl. No. 26, 771–790 (2012).
3. Rone, MB et al. Identifikasjon av et dynamisk mitokondrielt proteinkompleks som driver kolesterolimport, menneskehandel og metabolisme til et steroidhormon. Mol. Endokrinol. 26, 1868–1882 (2012).
4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Utskillelse og måling av kortikosteron- og testosteronmetabolitter i bankvoles (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endokrinol. 243, 39–50 (2017).
5. O'Hara, L. et al. Hypofyse androgenreseptorsignalering regulerer prolaktin, men ikke gonadotropiner hos hannmus. PloS en. 10, e0121657 (2015).
6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testikulære LH-reseptorer og sirkulerende hormonnivåer i tre musemodeller for arvelige sykdommer (Tfm/y, lit/lit og hyt/hyt). Endokrinol. Exp. 20, 349-58 (1986).
7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Ikke-klassisk testosteron-signalering mediert gjennom ZIP9 stimulerer claudin-ekspresjon og dannelse av tight junction i Sertoli-celler. Celle. Signal. 28, 1075–85 (2016).
8. Walker, WH Testosteronsignalering og regulering av spermatogenese. Spermatogenese. 1, 116–20 (2011).
9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (red. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).
10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP og Zhang, XYEchinacosideogCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight lindre bisfenol A-indusert testikkel- og sædskade hos rotter gjennom gonadakseregulerte steroidogene enzymer. J. Ethnopharmacol. 193, 321–328 (2016).