Del 2: Effekten av Acteosid som en cellebeskytter for å produsere en klonet hund

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1 , Eun Young Kim1 , Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1 , Kil Woo Han1 , Kang-Sun Park1 , Kyung-Bon Lee2 , Min Kyu Kim1*

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com

Vennligst klikk her for del 1

Vennligst klikk her til del 3

Acteosidicistanchehar mangeHelsefordeler

Statistisk analyse

Data ble analysert ved hjelp av IBM SPSS-statistikk (SPSS Inc., Chicago, IL USA) ved enveis ANOVA og Tukeys ærlig signifikante forskjellstest. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikante når P-verdien var mindre enn 0.05.

Resultater

Effekt av akteosid på cellesyklussynkronisering

Virkningen avakteosidpå cellesyklussynkronisering ble undersøkt ved bruk av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) (tabell 1). Hundeføtale fibroblaster ble behandlet med ulike konsentrasjoner avakteosid(10, 30, 50 μM) for forskjellige varigheter (24, 48, 72 timer), og cellene ble separert i G0/G1-trinn, S-trinn og G2/M-trinn ved FACS. Resultatene av FACS ble sammenlignet med resultatene til cellene synkronisert ved serumsulting og kontakthemming. Serumsult resulterte i den høyeste frekvensen av cellesyklussynkronisering (88,2 prosent) på G0/G1-stadiet sammenlignet med kontakthemmingen (84,6 prosent) ogakteosidbehandling (80,8–84,5 prosent ).Acteosidbehandling i 24 timer indusert G0/G1 cellesyklussynkronisering ved laveste effektivitet (80.8, 81.1 og 82.0 prosent).Acteosidvar mest effektiv til å indusere G0/G1-cellesyklussynkronisering ved 30 μM konsentrasjon og behandlingsvarighet på 48 timer (84,5 prosent). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom konsentrasjoner og varighet avakteosidbehandling i induksjon av G1/G0 cellesyklussynkronisering. Alt i alt,akteosidbehandling viste ingen signifikant forskjell sammenlignet med serumsult og kontakthemming når det gjelder G{{0}}/G1 cellesyklussynkronisering. Det var heller ingen forskjell i cellesyklussynkronisering på S-stadiet blant de tre gruppene. I tillegg var andelen av celler arrestert på G2/M-stadiet lik andelen av celler arrestert på G0/G1-stadiet.

Tabell 1. Effekt av kontakthemming, serumsult, ogakteosidbehandling på cellesyklussynkronisering i hundeføtale fibroblaster.

Fig 1. ROS-nivåer i hundeføtale fibroblaster. Cellesyklussynkronisering ved (A) kontakthemming, (B) serumsulting og (C) 30 μM akteosidbehandling i 48 timer. Histogrammer viser nivåer av ROS påvist i føtale fibroblaster hos hunder.

Effekt av akteosid på ROS og apoptose

Virkningen avakteosidpå ROS ble bestemt av FACS ved bruk av karboksy-H2DCFDA, en oksidativ stressindikator som aktiveres i celler når esteraser fjerner acetatgrupper mellom cellene (fig 1). ROS ble påvist ved lavere nivåer i akteosidbehandlede celler enn i celler synkronisert ved serumsult eller kontakthemming. Nivået av ROS var signifikant lavere i akteosidbehandlingsgruppen (42,8 prosent) enn i kontakthemmings- og serumsultgruppene (henholdsvis 54,3 og 99,5 prosent) (tabell 2).

For å forstå effekten avakteosidpå celleoverlevelse og død, ble apoptose undersøkt i celler etter induksjon av cellesyklussynkronisering. Overlevelsesraten for akteosid-behandlede celler (94,8 ± 1,2 prosent) var signifikant høyere enn både kontakthemmings- og serumsultgruppene (87,3 ± 0,5 prosent) (fig 2D). Ratene av apoptose i serumsultgruppen

(52,1 ± 5,3 prosent) var signifikant høyere enn de i kontakthemmings- og akteosidbehandlingsgruppene (fig 2E). Apoptose observert i kontakthemmingsgruppen var 10,6 prosent, som også var signifikant høyere enn akteosidbehandlingsgruppen (4,2 prosent) (fig 2E). I tillegg var det mindre nekrose funnet i akteosidbehandlede celler sammenlignet med den i kontakthemmingsgruppen (fig 2F).

Cistanchedeserticola acteosid kan forsterkeimmunitetog redusereapoptose

Effekt av akteosid på in vitro-utvikling av kjernefysiske overføringsembryoer fra hund

For å undersøke effekten av akteosid i SCNT-embryoutvikling, ble kjernedonorceller overført til hundekjernede oocytter etter cellesyklussynkronisering ved hjelp avakteosid. Som vist i tabell 3, var det ingen signifikante forskjeller i tidlig embryoutvikling fra kjernefysisk

Tabell 2. Kvantifisering av ROS

Fig 2. Celleoverlevelsesrater, apoptose og nekrose av føtale fibroblaster hos hund. Apoptotiske celler i (A) kontakthemming, (B) serumsult og (C) 30 μMakteosidbehandling for 48 timers gruppe ble bestemt av FACS; Kvantitativ analyse av FACS-resultatene av (D) celleoverlevelse, (E) apoptose og (F) nekrose. Dette eksperimentet ble gjentatt fire ganger uavhengig. (S<>

donorceller med forskjellige cellesyklussynkroniseringsmetoder for enten kontakthemming eller akteosidbehandling. Imidlertid er det bare hunde-SCNT-embryoene konstruert ved å bruke kjernedonorcellene synkronisert på G0/G1-stadiet med akteosid utviklet utover 10-celleembryostadiet.

Produksjon av en klonet hund ved bruk av celler dyrket medakteosid

Femtisyv klonede hundeembryoer produsert ved bruk av kontaktinhiberte donorceller ble kirurgisk overført til egglederne til 6 mottakere. Ingen av de 6 mottakerne ga avkom

Tabell 3. In vitro-utvikling av kjernefysiske overføringsembryoer fra hund.

Tabell 4. Produksjon av en klonet hund ved SCNT.

eller til og med blitt gravid. Trettiåtte klonede hundeembryoer produsert fra acteosid-behandlede donorceller ble også kirurgisk overført til egglederne til 3 mottakere. Graviditet ble bekreftet hos en av de tre surrogatmødrene, som til slutt fødte, ved keisersnitt, en frisk valp som veide 354 g (tabell 4 og fig. 3). For å bestemme opprinnelsen til genomet ble mikrosatellittamplifisering utført med genene til den klonede hunden. Mikrosatellitter er korte gjentatte tandemsekvenser som brukes i genom-skjermer for å spore arvelighet og koblingsanalyse i familier. Syv mikrosatellittmarkører ble brukt for å identifisere opprinnelsen til genomet i den klonede hunden (tabell 5). De klonede hunden og donorcellene som ble brukt til å klone hunden hadde de samme mikrosatellittmarkørene, mens oocyttdonoren og surrogatet bare delte delvise alleler (tabell 5). I mors herkomsttest hadde den klonede hunden og mottakeroocytten identiske mitokondrielle DNA (mtDNA) sekvenser, noe som viste at mtDNA til den klonede hunden var avledet fra oocyttdonoren (tabell 6).

akteosidi cistanche

Diskusjon

Synkronisering av donorcellesyklusen er en viktig faktor for å forbedre SCNT-effektiviteten [43]. Hastigheten av SCNT embryoutvikling og effektiviteten av kloning av dyreproduksjoner

Fig. 3. En klonet hund: (A) Ultrasonogram av fosteret i føtal vesikkel 32 dager etter embryooverføring; (B) Den klonede beagle ved 2 måneders alder.

akteosidicistanchekan anti-aldring