Del 2: Epigenetisk regulering av det cirkadiske genet Per1 bidrar til aldersrelaterte endringer i hippocampus hukommelse

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Vennligst klikk her til del 1

Knockdown av Per1 svekker langsiktighukommelsehos unge mus.Deretter for å teste om oppregulering av Per1 i dorsal hippocampus er nødvendig på lang sikthukommelseformasjon, infunderte vi siRNA rettet mot Per1 i dorsal hippocampus til unge mus 48 timer før 10-min. OLM-trening. Infusjon av Per1 siRNA ga en signifikant reduksjon av PER1-protein i dorsal hippocampus, målt 2 timer etter den siste testøkten (fig. 4d, tilleggsfig. 5). Denne relativt beskjedne nedbrytningen av PER1-protein (~30 prosent) produserte alvorlig svekkethukommelsedannelse for OLM; mus infundert med Per1 siRNA viste ingen signifikant økning i DI mellom trening og testing og viste signifikant mindre preferanse for det bevegelige objektet under testing enn kontrollmus (fig. 4e) uten effekt på total objektutforskning ved test (fig. 4f) og ingen forskjell i bevegelse under tilvenningsøktene før trening (tilleggsbilde 8c). Dette viser, for første gang, at lokal forstyrrelse av et kjerne døgnklokkegen selektivt i hippocampus kan svekkehukommelseformasjon.

Per1 overuttrykk forbedreshukommelsehos aldrende mus. Til slutt,for å bestemme om overekspresjon av Per1 i dorsal hippocampus er tilstrekkelig for å lindre aldersrelaterthukommelsesvekkelser, oppregulerte vi Per1 lokalt ved å bruke to komplementære metoder. Først brukte vi et lentivirus som uttrykker villtype Per1 med en v5 epitop-tag (pLVX-v5Per1) (fig. 5a, tilleggsfig. 6a). For å bekrefte at dette plasmidet overuttrykker Per1, transfekterte vi HT22-celler med pLVX-v5Per1 eller pLVX-EV og målte Per1 mRNA-ekspresjon. Både 24 og 48 timer etter transfeksjon ble Per1 mRNA betydelig økt i celler transfektert med pLVX-v5Per1 i forhold til celler transfektert med kontrollplasmidet (fig. 5b). Transfeksjon av pLVX-v5Per1 førte også til en signifikant økning i mRNA for Per2 (et periodeklokkefamiliemedlem som interagerer med Per1) etter 24 timer (tillegg Fig. 6b), selv om denne økningen var langt mindre enn den observerte økningen i Per1 (kl. 24 t, Per1: 466-fold økning i forhold til EV, Per2: 1.6-fold økning i forhold til EV). Per1-overekspresjon påvirket imidlertid ikke transkripsjonen av det nærmeste nedstrømsgenet Hes7 (Supplerende Fig. 6c).

For å finne ut om Per1-overuttrykk forbedreshukommelseytelse i aldrende mus, ble pLVX-v5Per1 infundert i dorsal hippocampus til 18-mo mus 2 uker før oppførselen. pLVX-v5Per1 mus viste seg betydelig forbedrethukommelsefor OLM ved test i forhold til pLVX-EV (tom vektor) kontroller (fig. 5c). Bare pLVX-v5Per1 mus viste en signifikant økning i preferanse for det bevegelige objektet i hvile i forhold til trening uten observerte gruppeforskjeller i total utforskning ved test (fig. 5d) eller i bevegelse under tilvenning (tilleggsfig. 8d).

Etter oppførsel ble hippocampusvev fra en undergruppe av dyr behandlet for RNA-sekvensering for å bekrefte tilstedeværelsen av pLVX-EV- og pLVX-v5Per1-transkriptene i de passende gruppene in vivo (tilleggsfigur 7a, b, f, g).

For å komplementere denne tilnærmingen brukte vi også CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) system33 for å drive transkripsjonell aktivering av Per1 i dorsale hippocampus. Dette systemet består av tre lentivirale komponenter: en katalytiskinaktiv Cas9 (dCas9) fusjonert til et VP64 transkripsjonsaktiveringsdomene med en GFP-tag (dCas9-VP64-GFP), et modifisert enkeltveilednings-RNA (sgRNA) målrettet mot Per1 med to MS2 RNA-aptamerer som kan rekruttere den tredje komponenten, et MS2- dobbelt transkripsjonsaktivator (MS2-p65-HSF1) fusjonsprotein(Fig. 5e). Kontrolldyr mottok et kontroll-sgRNA som manglet 20 nukleotidsekvensen som kreves for å målrette SAM-systemet til Per1 (referert til som ctrl sgRNA). Sammenstilling av disse komponentene ved Per1-promoteren gjør at de tre effektordomenene (VP64, p65 og HSF1) kan drive Per1-transkripsjon. For å bekrefte, forbedrer effektiviteten til Fig. 5 Overekspresjon av Per1 i dorsal hippocampus aldersrelaterte svekkelser i objektplasseringhukommelse. et skjema over lentiviruskonstruksjonen brukt til å overuttrykke v{{0}}tagget Per1 (pLVX-v5Per1) sammenlignet med den tomme vektorkontrollen (pLVX-EV). b Per1 mRNA ble signifikant økt 24 og 48 timer etter transfeksjon av pLVX-v5Per1 i HT22-celler sammenlignet med celler transfektert med EV (Toveis ANOVA: Gruppe x Tidspunktinteraksjon (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidaks="" post="" hoc-tester,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" mus="" gitt="" hippocampus="" infusjoner="" av="" plvx-v5per1="" viste="" signifikant="" bedre="" hukommelse="" for="" olm="" enn="" mus="" som="" fikk="" plvx-ev="" kontrollvirus="" (toveis="" anova:="" virus="" x="" øktinteraksjon,="" (f(1,29)="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0.05),="" sidaks="" post="" hoc-tester,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" n="16," 15,="" alle="" menn).="" d="" total="" utforskning="" var="" lik="" for="" begge="" gruppene="" ved="" test="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" skjematisk="" av="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)-system="" som="" brukes="" til="" å="" drive="" per1-transkripsjon.="" øverst:="" individuelle="" komponenter="" av="" sam.="" nederst:="" komponenter="" satt="" sammen="" ved="" per1-promoteren,="" som="" driver="" per1-transkripsjon.="" f="" per1="" mrna="" ble="" signifikant="" økt="" 48="" timer="" etter="" transfeksjon="" av="" crispr-sam-komponenter="" i="" ht22-celler="" sammenlignet="" med="" celler="" transfektert="" med="" kontroll-sgrna="" (toveis="" anova:="" gruppe="" x="" tidspunktinteraksjon="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" sidaks="" post="" hoc-tester,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" mus="" som="" ble="" gitt="" hippocampale="" infusjoner="" av="" crispr-sam-systemet="" med="" sgrna-målretting="" per1,="" viste="" seg="" betydelig="">hukommelsefor OLM sammenlignet med EV-kontrollmus med kontroll-sgRNA (Toveis ANOVA: Virus x Session-interaksjon (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidaks="" post="" hoc-tester,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" alle="" menn).="" h="" total="" utforskning="" var="" lik="" for="" begge="" gruppene="" ved="" test="" (t(30)="0.41," p="0.68)." data="" presenteres="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem="" i="" crispr-sam-systemet,="" vi="" transfekterte="" ht22-celler="" med="" alle="" tre="" plasmidene,="" høstet="" cellene="" 24="" eller="" 48="" timer="" senere="" og="" målte="" per1="" mrna-ekspresjon.="" ved="" 48="" timer="" etter="" transfeksjon="" ble="" per1="" mrna="" betydelig="" økt="" i="" gruppen="" som="" fikk="" per1="" sgrna="" sammenlignet="" med="" kontroller="" (fig.="" 5f),="" noe="" som="" bekreftet="" at="" crispr-sam-systemet="" effektivt="" driver="" per1="" mrna-ekspresjon.="" vi="" observerte="" ingen="" endring="" i="" ekspresjon="" for="" verken="" per2-mrna="" (supplerende="" fig.="" 6e)="" eller="" hes7-mrna="" (supplerende="" fig.="" 6f),="" noe="" som="" indikerer="" at="" crispr-sam-systemet="" driver="" selektiv="" overekspresjon="" av="" målgenet="">

Deretter ble 18-mo mus gitt intra-hippocampale infusjoner av CRISPR-SAM lentivirusene (tilleggsbilde 6d) og trent i OLM 2 uker senere. Som observert med vår pLVX-v5Per1-overuttrykk, ble CRISPR-SAM-mediert Per1-overuttrykk betydelig forbedrethukommelseytelse i Per1 sgRNA-infunderte mus i forhold til kontrolldyr (fig. 5g) uten å påvirke total utforskning (fig. 5h) eller bevegelse under tilvenning (tilleggsfig. 8e). Bare mus gitt Per1 sgRNA viste en signifikant økning i preferanse for det bevegelige objektet i hvile i forhold til trening, noe som indikerer intakthukommelsefor objektplasseringene (fig. 5g). Etter oppførsel ble hippocampusvev fra en undergruppe av dyr behandlet for RNA-sekvensering for å bekrefte tilstedeværelsen av CRISPR-transkripsjonene i de passende gruppene in vivo (tilleggsbilde 7c-g). Sammen viser disse resultatene at overekspresjon av Per1 i dorsal hippocampus er tilstrekkelig for å lindre aldersrelaterte svekkelser i langsiktig objektlokaliseringsminne. Per1 er derfor et nøkkelgen som er kritisk for langtidshukommelsesdannelse, reguleres av HDAC3 og er svekket i den aldrende hjernen.

Diskusjon

Resultatene våre viser at sletting eller forstyrrelse av den undertrykkende histondeacetylase HDAC3 kan lindre aldersrelaterte svekkelser på både lang sikthukommelseog synaptisk plastisitet. Videre gjenoppretter sletting av HDAC3 erfaringsindusert uttrykk for det cirkadiske genet Per1 i dorsale hippocampus. Siden hippocampus PER1-ekspresjon er kritisk for langtidshukommelsesdannelse (fig. 4) og overekspresjon av Per1 i hippocampus forbedrer aldersrelaterte hukommelsessvikt (fig. 5), er PER1 en potensiell mekanisme der sletting av HDAC3 forbedres.hukommelseog synaptisk plastisitet hos aldrende mus. Mer generelt kan aldersrelatert forstyrrelse av Per1 forbinde aldersrelaterte svekkelser i både langtidshukommelse og døgnrytme, avhengig av strukturen.

Et nøkkelfunn fra den nåværende studien var at aldersrelaterte svekkelser i hippocampus LTP kunne forbedres med HDAC3-sletting eller forstyrrelse. Dette er i samsvar med nylig arbeid fra Sajikumar-laboratoriet som viser at farmakologisk blokade av HDAC3 også kan lindre aldersrelaterte svekkelser i assosiativ hippocampus LTP34. Interessant nok fant vi at skiver fra gamle HDAC3flox/flox- og HDAC3(Y298H)-dyr ikke klarte å nå samme potenseringsnivå som skiver fra unge HDAC3ox/flox- eller HDAC3(Y298H)-dyr (fig. 2c, f), noe som tyder på at aldrende hjerner kan ha et lavere plastisitetstak enn unge hjerner. En mulig forklaring på denne forskjellen i potensering er at aldersrelatert tap av synaptiske kontakter i CA122 kan senke plastisitetstaket i den aldrende hippocampus, ettersom de færre tilgjengelige synapsene vil bli mettet raskere enn de relativt rikelige synapsene i den unge DH. Hvis dette er tilfelle, bør ikke styrking av stimuleringsprotokollen eller gi stimuleringsanfall med avstand35 forbedre LTP ytterligere i den aldrende hippocampus, siden ingen ytterligere synapser er tilgjengelige. Ytterligere arbeid vil være nødvendig for å bestemme mekanismen som ligger til grunn for denne forskjellen.

Våre RNA-sekvenseringsresultater viste at bare en liten undergruppe av gener passer til kriteriene for å bli gjenopprettet i den aldrende hjernen ved HDAC3-sletting (fig. 3e). I stedet for å rekapitulere genekspresjonsprofilen til den unge hjernen, gjenopprettet sletting av HDAC3 i den aldrende hjernen erfaringsindusert uttrykk for noen få nøkkelgener som er kritisk viktige for langtidshukommelsesdannelse, inkludert Per1. Per1 ser ut til å være direkte regulert av HDAC3, da fokal sletting av HDAC3 gjenopprettet erfaringsindusert Per1-uttrykk og HDAC3 fjernes fysisk fra Per1-promotoren som svar på OLM-trening. Videre er Per1 uttrykk nødvendig forhukommelse, som siRNA-mediert knock-down av PER1 protein i DH svekket langsiktighukommelsedannelse hos unge mus, og overekspresjon forbedrethukommelsefor OLM hos aldrende mus. Spesielt transfekterte begge lentivirale systemene som ble brukt til å overuttrykke Per1 bare et lite antall celler i CA1b-området av dorsal hippocampus (tilleggsfigur 6a, d), noe som gjorde det nødvendig å bekrefte tilstedeværelsen av disse konstruksjonene med RNA-sekvensering (se metoder) ). Som tidligere arbeid har vist at denne nøyaktige regionen av dorsale hippocampus er kritisk for OLM36, viser dette at selv en liten fokal endring av Per1 i en minnerelevant struktur kan påvirke langtidsminnedannelsen. Dette utvider tidligere forskning som viser at ikke-spesifikk sletting av Per1 i hele hjernen kan svekke hukommelsesdannelse hos unge mus6,28,29. Unormal HDAC3-mediert undertrykkelse av Per1 i den aldrende hjernen er derfor en nøkkelhendelse som kan føre til aldersrelaterte svekkelser i både langtidshukommelsesdannelse og døgnrytme. Selv om denne studien tydelig viser at Per1 er et viktig gen som HDAC3 regulerer langtidshukommelsen i den aldrende hjernen, bidrar andre gener mest sannsynlig til de minneforbedrende effektene av HDAC3-sletting. Andre gener foreslått for å formidle effekten av HDAC3 på synaptisk plastisitet og minne inkluderer NF-κB34, FMRP37 og Nr4a226. I den nåværende studien identifiserte vi ytterligere tre gener (fig. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) som, i likhet med Per1, viser nedsatt uttrykk i den aldrende hjernen som forbedres av HDAC3-sletting. Hvordan disse forskjellige genene unikt bidrar til de minneforbedrende effektene av HDAC3-sletting er foreløpig uklart. Spesielt er alle disse genene grensesnitt med CBP/CREB-banen, som er kritisk for langtidshukommelsesdannelse38,39 og er både opp- og nedstrøms for PER16,28. Siden PER1 er oppstrøms for CREB-fosforylering6, er det mulig at HDAC3-mediert undertrykkelse av Per1 reduserer CREB-fosforylering, og til slutt svekker transkripsjonen av CREB-medierte gener som Fmrp40,41 og Nr4a-genfamiliemedlemmene Nr2a1 og Nr4a. Å forstå den komplekse dynamikken mellom HDAC3, PER1 og disse andre molekylære aktørene vil være et viktig mål for fremtidig forskning.

I den nåværende studien brukte vi to komplementære metoder for å overuttrykke Per1 i den aldrende hjernen: overuttrykk av en Per1 cDNA-konstruksjon i full lengde ved bruk av pLVX-v5Per1 og transkripsjonell aktivering av endogen Per1 ved bruk av CRISPR-SAM-systemet. Selv om pLVX-mediert overekspresjon drev en stor økning i Per1-mRNA (fig. 5b), ble dette ledsaget av en økning i Per2, et annet periodefamiliemedlem (tilleggsfig. 6b). Ekspresjonen av nedstrømsgenet Hes7 var imidlertid uendret av pLVX-v5Per1 (Supplerende Fig. 6c). CRISPR-SAM-systemet, derimot, produserte en mer subtil økning i Per1-mRNA som unngikk off-target-forbedringer av enten Per2- eller Hes7-ekspresjon (tilleggsbilde 6e–f). Ettersom begge tilnærmingene ble tilsvarende forbedret på lang sikthukommelsehos aldrende mus er det usannsynlig at økningen utenfor målet i Per2 observert med pLVX-v5Per1 var årsaken til den observerte forbedringen i langtidshukommelsen.

Døgntidseffekter på lang sikthukommelseantas tradisjonelt å stamme fra dysregulering i SCN, som deretter driver endringer i perifere strukturer involvert i minnedannelse, som dorsal hippocampus. Lite er kjent om rollen til individuelle døgnklokkegener i DH, til tross for en klar sammenheng mellom døgnrytme og dannelse av langtidshukommelse. Hukommelse er nært knyttet til tid på dagen, ettersom plastisitetsrelaterte genkaskader viser døgnsvingninger3,6 oghukommelsekan erverves lettere i visse perioder av døgnsyklusen. For eksempel erverves kontekstfryktkondisjonering sterkere på dagtid, når MAPK-fosforyleringsnivåene topper3. Videre er det godt dokumentert at aldring er ledsaget av et sammenbrudd av døgnrytmer, antagelig på grunn av endringer i den sentrale døgnklokken, den suprachiasmatiske kjernen (SCN) (for gjennomgang1). Hvordan denne forstyrrelsen i døgnklokken forholder seg til aldersrelaterte svekkelser ihukommelseer et åpent spørsmål. Resultatene våre antyder at HDAC3 begrenser erfaringsindusert Per1 i den aldrende hippocampus, noe som muligens kan bidra til de observerte svekkelsene i langtidshukommelsen. Epigenetisk undertrykkelse av Per1 kan derfor representere et viktig grensesnitt mellom aldersrelaterte svekkelser i både døgnrytme og langtidshukommelsesdannelse.

Av kjernegenene for kanoniske døgnklokker, er Per1 unikt klar til å dramatisk påvirke hippocampus på lang sikthukommelse. Per1 ser ut til å være hovedsakelig involvert i SCN-utgangsveier og spiller en nøkkelrolle i perifere klokker nedstrøms for SCN, for eksempel hippocampus42. Videre antyder nyere arbeid at Per1 kan "gate" romlig minnedannelse gjennom dag/natt-syklusen ved å kontrollere CREB-fosforylering6,28,29. Faktisk har hippocampal Per1 mRNA-oppregulering blitt observert etter kontekst eller romlig læring i minst tre andre RNA-seq-studier, inkludert arbeid på rotter, noe som indikerer at Per1 vanligvis er oppregulert etter læring på tvers av arter20,43,44. Sammen med resultatene fra den nåværende studien, indikerer dette arbeidet at PER1-ekspresjon er kritisk viktig for hippocampus langtidsminnedannelse; reduksjoner i PER1 som oppstår om natten29 eller med aldring kan svekke hippocampushukommelse. Til dags dato,

forskning som impliserer Per1 inhukommelseformasjon har utelukkende basert seg på globale knockouts som forstyrrer Per1-uttrykk i kjernen circadian clock og andre regioner i tillegg til minnerelevante strukturer som hippocampus6,28,29,45,46, noe som gjør det umulig å avgjøre om hippocampus PER1 er spesifikt nødvendig for minnedannelse. Faktisk påvirker global Per1-sletting døgnrytme i noen rapporter42. Her viser vi for første gang at reduksjon av PER1-uttrykk direkte i dorsal hippocampus kan svekkehukommelsehos unge mus, mens lokal overekspresjon av Per1 i dorsal hippocampus kan forbedre hukommelsen hos aldrende mus. Siden selektiv sletting HDAC3 (som regulerer Per1) i dorsale hippocampus ikke hadde noen effekt på døgnaktivitetsmønstre i den nåværende studien (tilleggsfigur 4), og selv elektrolytiske lesjoner i dorsale hippocampus er utilstrekkelige til å påvirke døgnrytmen47, virker det usannsynlig at manipulering av Per1 i dorsal hippocampus påvirker funksjonen til den sentrale døgnklokken. Ikke desto mindre er det mulig at erfaringsinduserte økninger i Per1 eller virusmediert overuttrykk av Per1 kan påvirke døgnsvingningen til andre molekylære spillere, for eksempel andre klokkegener, i hippocampale nevroner, selv uten å påvirke døgnaktivitetsmønstrene. Å forstå hvordan Per1 fungerer for å endre minnedannelse, inkludert å identifisere disse potensielle samhandlende partnere, vil være målet for fremtidig arbeid.

Sammen viser disse resultatene at kjernen døgnklokkegenet Per1 spiller en nøkkelrolle innen lokalthukommelsestrukturer for å endre minnedannelse, en rolle som er uavhengig av dens funksjon i SCN. Mer generelt utfordrer dette den tradisjonelle hypotesen om at circadian endreshukommelsedannelsen er drevet av endringer i kjernen circadian clock og støtter i stedet hypotesen om at circadian clock gener spiller en mer autonom rolle i hippocampus celler, muligens porter minnedannelse basert på tiden på dagen6.

Metoder

Mus. Unge voksne mus var mellom 2 og 4 måneder gamle på testtidspunktet, og aldrende mus var mellom 18 og 20 måneder gamle. Alle mus var C57BL/6J eller holdt på en C57BL/6-bakgrunn (HDAC3 pluss/plus og HDAC3flox/flox-mus). Mus hadde fri tilgang til mat og vann og lysene ble holdt på en 12 timers lys/mørke syklus. All atferdstesting ble utført under lyssyklusen. Alle eksperimenter ble utført i henhold til US National Institutes of Healths retningslinjer for dyrepleie og bruk og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Irvine.

Kirurgi. Mus ble bedøvet med isofluran (indusert, 4 prosent; opprettholdt 1,5–2.0 prosent) og plassert i stereotaksisk. Injeksjonsnåler ble senket til den dorsale hippocampus med en hastighet på 0,2 mm/15 s (AP, −2,0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, − 1,5 mm i forhold til Bregma ). To minutter etter måldybden ble 1,0 ul virus eller siRNA infundert bilateralt i DH med en hastighet på 6 ul/time. For CRISPR-SAM lentivirale infusjoner ble en cocktail av de tre virusene infundert til et sluttvolum på 1,5 μL per halvkule med samme hastighet. Injeksjonsnåler forble på plass i to minutter etter injeksjon for å la viruset diffundere. Injektorene ble deretter hevet 0,1 mm og fikk sitte i ytterligere et minutt før de ble fjernet med en hastighet på 0,1 mm per 15 s. Virale infusjoner ble utført 2 uker før atferdsanalyse, mens siRNA knockdown ble utført 2 dager før trening13. For alle injeksjonsforsøk ble dyrene tilfeldig tildelt de forskjellige injeksjonsforholdene (med unntak av HDAC3 plus/plus og HDAC3flox/flox-mus, som alle ble injisert med AAV-CaMKII-Cre). For alle atferdseksperimenter ble dyr innenfor hver virustilstand tilfeldig tildelt til hjemmebur/trent grupper, og alle forhold (objekter, bokser, etc.) ble balansert mellom gruppene.

AAV produksjon. AAV2.1-CaMKII-Cre ble kjøpt fra Penn Vector Core (titer: 1,81 × 1013 GC/ml). For AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 amplifiserte vi villtype HDAC3 fra hippocampus cDNA og klonet produktet inn i en modifisert pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) under kontroll av CMV-promotoren og -globin-intron. 3×-FLAG-taggen, IRES-elementet og hrGFP ble fjernet fra vektoren og erstattet med en V5-tag, noe som muliggjorde en C-terminal fusjon til HDAC3 (plasmid MW91). For å lage punktmutasjonen endret vi nukleotidene til å kode for en histidinrest i stedet for tyrosin ved aminosyre 298 (plasmid MW92). For den tomme vektorkontrollen var HDAC3-kodende sekvensen ikke til stede, men alle andre elementer forblir (plasmid MW87). AAV ble laget av Penn Vector Core og de endelige titrene ble bestemt ved qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Lentivirus produksjon. For CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)-systemet ble lentivirale plasmider kjøpt fra Addgene for dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) og MS2- P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC)-konstruksjoner (titere større enn eller lik 8× 106 TU/ml). For Per1 sgRNA klonet og satte vi inn en antisense-guidesekvens som tilsvarer CRE-elementet i Per1-promotoren (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) i Addgene sgRNA (MS2) kloningsryggraden (#61427). Kontroll-sgRNA var identisk, bortsett fra at ingen guidesekvens ble klonet inn i plasmidet. Lentivirus for både Per1 sgRNA (titer: 6,8 × 107 IFU/ml) og kontroll sgRNA (3,5 × 107 IFU/ml) ble produsert av USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

For pLVX-V5Per1-overekspresjonskonstruksjonen amplifiserte vi full-lengde villtype Per1 fra Addgene pCMV-Sport2-mPer1-plasmidet (#16203) og klonet produktet inn i en modifisert pLVX-EF1 -IRES-mCherry ryggrad (Takara, #631987). IRES- og mCherry-elementene ble fjernet og ble erstattet med en V5-tag, noe som muliggjorde en N-terminal fusjon til PER1 (plasmid MW206). For den tomme vektorkontrollen (EV) var PER1-kodende sekvensen ikke til stede, men alle andre elementer forble (plasmid MW93). Lentivirus for pLVX-v5Per1 (titer: 1,3 × 108 IFU/ml) og pLVX-EV (titer: 1,5 × 108 IFU/ml) ble produsert av USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory. Alle lentivirale konstruksjoner ble uttrykt under EF1-promotoren.

Cellekulturverifisering av pLVX-v5Per1 og CRISPR-SAM. For å bekrefte at pLVX-v5Per1 produserer overekspresjon av Per1-mRNA, ble muse-HT22-celler (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) transfektert med pLVX-v5Per1 eller pLVX-EV (fig. 5a) ved bruk av Lipofectaine LTX (Invitrogen). For å bekrefte at CRISPR-SAM-systemet effektivt kan drive Per1-transkripsjon, ble HT22-celler transfektert med dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast ble en gave fra Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast var en gave fra Feng Zhang, Addgene plasmid #61426), og enten Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) eller det ikke-målrettede kontrollen sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2) _zeo ryggrad var en gave fra Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) ved bruk av Lipofectamine LTX (Invitrogen). Celler ble høstet etter 24 eller 48 timer, lysert, og mRNA ble isolert som beskrevet ovenfor. qRT-PCR ble utført som beskrevet ovenfor ved bruk av Per1, Per2 og Hes7 primere og probe oppført i tabell S4.

siRNA. For Per1 knockdown-eksperimentet ble Accell SMARTpool små interfererende RNA (siRNAs; Dharmacon, GE) rettet mot Per1 fortynnet til en endelig totalkonsentrasjon på 1 0 μM i ddH20 og infundert i DH (1,0 ul/side). Accell ikke-målrettende pool siRNA ble brukt som kontroll (total konsentrasjon, 10 μM) og ble infundert på samme måte. For siRNA-eksperimenter ble mus håndtert og tilvennet som beskrevet ovenfor, og kirurgi ble utført dagen etter den siste tilvenningsdagen. Musene ble gitt en hel dag med restitusjon etter operasjonen og ble trent dagen etter (~ 48 timer etter operasjonen) for å sikre maksimal målnedbrytning. For å sikre knockdown ble mus ofret ~1 time etter test og slag fra dorsal hippocampus ble behandlet med western blots for å sikre knockdown av PER1-protein.

Objektplassering og objektgjenkjenninghukommelseoppgaver. For objektplassering og objektgjenkjenningsminneoppgaver ble mus håndtert i 2 minutter/dag i 4 dager og deretter tilvennet konteksten i 5 minutter/dag i seks påfølgende dager i fravær av objekter. Under trening ble mus eksponert for to identiske gjenstander (100 ml begerglass, krydderbokser eller lysestaker) og fikk utforske i 10 minutter. Under retensjonstesten (24 timer senere for langvarighukommelseeller 60 m senere for korttidshukommelse), fikk musene utforske i 5 minutter. For objektplasseringhukommelse, ble en av de to kjente gjenstandene flyttet til et nytt sted. For gjenkjenning av objekterhukommelse, objektplasseringene forble konstant, men ett av objektene ble erstattet med et nytt element. Tilvenning for objektgjenkjenningsminne begynte minst en uke etter fullført OLM-testing og en ny kontekst og ukjente objekter ble brukt48. Utforskning ble skåret når musehodet orienterte seg mot objektet og kom innenfor 1 cm eller når nesen berørte objektet. Total letetid ble registrert (t) og preferanse for det nye elementet ble uttrykt som en diskrimineringsindeks (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 prosent ). For treningsøkter ble objektet utpekt til å flyttes ved test brukt som det nye objektet for å la trenings- og testing DI bli direkte sammenlignet. Mus som utforsket begge objektene i mindre enn 2 s under testing eller 3 s under trening ble fjernet fra videre analyse. Mus som viste en preferanse for ett objekt under trening (DI > ±20) ble også fjernet. Tilvenningsøkter ble analysert (for å bestemme tilbakelagt distanse og hastighet) ved å bruke ANY-labyrint atferdsanalyseprogramvare (Stoelting Co). All tilvenning, trening, testing og scoring ble utført av eksperimentatorer som var blindet for eksperimentelle grupper.

Kontekst frykt til tilstand. For kontekstuell fryktkondisjonering ble mus først håndtert i 5 dager. Under anskaffelse ble mus eksponert for konteksten i 2 minutter og 28 s etterfulgt av et 2 s (0.75 mA) sjokk, en protokoll som vanligvis produserer robust langtidsminne12,20. Mus forble i sammenhengen i ytterligere 30 s før de ble fjernet. Mus ble ofret 60 m etter trening sammen med hjemmeburkontroller som ble håndtert, men ikke trent. Fryseatferd ble målt ved å bruke Ethovision 11 programvare (Noldus)12.

Forhøyet pluss-labyrint. Pluss-labyrinten ble utført av en eksperimentator som var blind for forsøksgruppene. En uke etter fullføringen av ORM ble en undergruppe av mus testet på pluss-labyrinten. To armer av labyrinten var åpne (30 × 5 cm) og to armer var lukket (30 × 5 × 15 cm), forbundet med en sentral plattform (5 × 5 cm). Labyrinten ble hevet 40 cm over gulvet. Mus ble testet i 5 minutter på apparatet, som besto av å plassere hver mus på den sentrale plattformen vendt mot en av de åpne armene. Mellom forsøkspersonene ble labyrinten renset med 70 prosent etanol. Prosentandelen av tiden brukt i lukkede og åpne armer ble målt ved bruk av ANY-labyrint-programvare.

Døgnrytmeanalyse. Unge ({{0}}mnd) og aldrende (18-mnd) HDAC3 pluss/plus og HDAC3flox/flox-mus ble avlet og holdt under en 12 timers lys/mørke (LD)-syklus. To uker etter AAV-CaMKII-Cre-infusjon (beskrevet ovenfor), ble mus overført til et isolert 12 timers LD-innføringsrom i 7 dager. Mus ble deretter overført til et lysbeskyttet aktivitetsanalyserom, hvor lokomotorisk aktivitet ble analysert ved bruk av optiske strålebevegelsesdetektorer (Philips Respironics). Aktiviteten ble overvåket i løpet av 2 uker med LD-syklus-medriving i det lysbeskyttede rommet før mus ble byttet til konstant mørke (DD) i ytterligere 3 uker. Aktivitetsovervåking fortsatte gjennom DD-fasen for å bestemme om HDAC3-sletting i DH påvirket endogene døgnrytmer. Data ble samlet inn ved hjelp av Minimitter VitalView 5.0 og Clocklab-programvare (Actimetrics) ble brukt for å bestemme utbruddet av fri aktivitet. Tau-verdier ble beregnet ved å finne stigningstallet for denne utbruddet og beregne minste kvadrater som passer med Clocklab-programvare49,50.

Immunhistokjemi. Etter at oppførselen var fullført, ble mus avlivet ved cervikal dislokasjon og hjernen deres ble fjernet og flash-frosset i iskald isopentan. Tjue mikrometer skiver ble samlet gjennom hele den dorsale hip-campus, tinemontert på lysbilder og lagret ved -80 grader. Objektglass ble fikset med 4 prosent paraformaldehyd (10-min), permeabilisert i 0.01 prosent Triton X-100 i 0,1 M PBS (5-min) , og blokkert i 1 time med 8 prosent normalt geiteserum (Jackson). Objektglass ble inkubert over natten (4 grader) i kaninantistoff mot HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) eller V5 (1:1000, Abcam, ab9116), eller kyllingantistoff mot GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Dagen etter ble objektglass vasket og inkubert i 1 time ved romtemperatur med geit-anti-kanin Alexa 488 (HDAC3 og V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) eller geit-anti-kylling Alexa 488 (GFP) ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) i mørket. Objektglassene ble deretter vasket med PBST og inkubert i 50 m i NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), en fluorescerende nissl-farge. For å slukke ikke-spesifikk autofluorescens51 ble skivene deretter vasket i PBS med 0,01 prosent Triton, skylt i vann og inkubert i 10-min. i 10 mM CuSO4 i 50 mM ammoniumacetatbuffer. Skivene ble igjen skylt i vann, vasket i PBS og dekkglass med VectaShield Antifade monteringsmedium (Vector Laboratories).

Alle bildene ble tatt med en Olympus Scanner VS110 med et 20x apokromatisk objektiv (numerisk blenderåpning 0,75) med VS110 skannerprogramvare. Alle behandlingsgruppene var representert på hvert lysbilde, og alle bildene på et lysbilde ble tatt med samme eksponeringstid under ikke-mettende forhold. Immunmerkingsintensiteten ble kvantifisert med ImageJ ved å prøve den optiske tettheten til cellelaget i CA1 og trekke fra en prøve av bakgrunnsfluorescens i det samme bildet. For alle AAV-eksperimenter ble dyr som ikke klarte å uttrykke viruset i område CA1 av dorsal hippocampus ekskludert fra analyser. Avbildning og kvantifisering ble utført av forsøkspersoner som var blinde for de eksperimentelle forholdene.

Western blot. For å verifisere PER1 knockdown, ble Per1 siRNA og kontroll siRNA mus ofret 2 timer etter testing og hjerner ble flash-frosset. Hjerner ble koronalt seksjonert og 1 mm DH-stanser ble samlet fra 500 μm skiver. Stanser ble homogenisert i T-PER-buffer (Thermo Fisher) med Halt-protease og fosfataseinhibitor (Thermo Fisher) ved bruk av en Dounce-homogenisator. Proteinlysater ble kvantifisert ved å bruke en modifisert Bradford-analyse (BioRad) og 5 0 ug totalt proteinlysat ble lastet inn i hver bane av en 7,5 prosent NuPAGE Bis-Tris gel (Thermo Fisher). Geler kjørte i 50 minutter ved 200 volt og blots ble overført over natten ved 15 V ved 4 grader til nitrocellulosemembraner (Novexi, LC2001). Dagen etter ble membraner inkubert i blokkeringsbuffer i 1 time (5 prosent fettfri melk i Tris-bufret saltvann med 0,01 prosent Tween 20), vasket (0,1 prosent Tween 20 i TBS) og deretter inkubert i primært antistoff (1:500, kanin anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) i primær antistoffbuffer (3 prosent BSA i TBS med 0,1 prosent Tween) over natten ved 4 grader. Membranene ble deretter vasket og inkubert i HRP-konjugert museantistoff mot kanin (1:10,000, Jackson Laboratories, lettkjedespesifikk, #211-032-171) i 1 time. Membraner ble vasket og utviklet ved bruk av Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077). Flere filmeksponeringer ble brukt for å bekrefte linearitet. Blottene ble vasket og strippet i 10 m med Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), vasket igjen og deretter re-probed over natten (4 grader) med et kaninantistoff mot GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778) ). PER1- og GAPDH-blotter i full lengde er vist i tilleggsfigur 5. Relative optiske tettheter ble beregnet fra skannet film ved bruk av ImageJ (US National Institutes of Health) av en eksperimentator som var blind for de eksperimentelle forholdene. Alle verdier ble normalisert til GAPDH-ekspresjonsnivåer.

QRT-PCR. Vev ble samlet fra DH-stanser (beskrevet ovenfor) og frosset ved -80 grader inntil behandling. RNA ble isolert ved bruk av en RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) og cDNA ble opprettet ved bruk av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, 04379012001). Primere og prober ble avledet fra Roche Universal ProbeLibrary (tabell S4) og ble brukt til multipleksing i Roche Light-Cycle 480 II-maskinen (Roche). Alle verdier ble normalisert til Gapdh. Analyser og statistikk ble utført ved bruk av Roches proprietære algoritmer og REST 2009-programvare basert på Pfafffl-metoden52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 ble inkludert i vår analyse. cDNA-biblioteker for hver gruppe ble utarbeidet i henhold til TruSeq RNA Sample Preparation Guide (Illumina). To hundre og femti nanogram totalt RNA fra hver mus ble renset med poly-T-oligo-festede magnetiske kuler og varmefragmentert. Den første og andre-trådens cDNA ble deretter syntetisert og renset. Etter at endene var stumpe, ble 3'-enden adenylert for å forhindre sammenknytting av malen under adapterligering. For hver gruppe ble et unikt adaptersett lagt til endene av cDNA og bibliotekene ble amplifisert ved PCR. Kvaliteten på biblioteket ble vurdert av Bioanalyzer og kvantifisert ved bruk av qRT-PCR med en standardkurve utarbeidet fra et kommersielt sekvenseringsbibliotek (Illumina). Prøver ble multiplekset, med hver atferdsgruppe representert i hver strømningscelle i sekvenseren. 10 nM av hvert bibliotek ble samlet i fire multipleksbiblioteker og sekvensert på et Illumina HiSeq 2500-instrument under en enkeltlest 50 bp-sekvensering, drevet av Genomic High-Throughput Facility ved University of California, Irvine. De resulterende sekvenseringsdataene for hvert bibliotek ble etterbehandlet for å produsere FastQ-filer. Dataene ble deretter demultiplekset og filtrert ved hjelp av Illumina CASAVA 1.8.2-programvare så vel som intern programvare. Leser av dårlig kvalitet (som mislykkedes i Illuminas standardkvalitetstester) og kontrollavlesninger som var vellykket justert til PhiX-kontrollgenomet, ble fjernet fra analyser. Kvaliteten på de gjenværende sekvensene ble videre vurdert ved å bruke PHRED-kvalitetspoeng produsert i sanntid under basiskallingstrinnet i sekvenseringskjøringen (tilleggsfig. 3a).

Justering til referansegenomet og transkriptomet. Lesningene fra hvert eksperiment ble separat justert til referansegenomet og det korresponderende transkriptomet ved bruk av kortleste aligners ELAND v2e (Illumina) og Bowtie24. Avlesninger unikt justert av begge verktøyene til kjente eksoner eller spleiseforbindelser med ikke mer enn to feiltilpasninger på et hvilket som helst 25 bp-fragment av avlesningen ble inkludert i transkriptomet. Avlesninger unikt justert, men med mer enn to feiltilpasninger på et hvilket som helst 25 bp-fragment av avlesningen ble fjernet fra analyser. På samme måte ble avlesninger som samsvarte med flere steder i referansegenomet fjernet fra analysen. Prosentandelen av avlesninger tildelt referansegenomet og transkriptomet ved bruk av denne protokollen er rapportert for hver gruppe replikater (tilleggsfigur 3b). Dette resulterte i et gjennomsnitt på omtrent 30 millioner avlesninger per prøve.

For å verifisere tilstedeværelsen av pLVX- og CRISPR-SAM-plasmidene etter lentiviral infusjon, kjørte vi RNA-sekvensering på hippocampusprøver fra en undergruppe av tre dyr per gruppe etter oppførsel. Siden antallet celler infisert med lentivirusene in vivo var for lite til å pålitelig oppdage tilstedeværelsen av de passende transkripsjonene ved bruk av RT-qPCR (Supplerende Fig. 6a, d), brukte vi RNA-seq som en mer sensitiv metode for å oppdage tilstedeværelsen av disse utskriftene. En oppdatert versjon av genomsammenstilling og genomannotering ble bygget ved å legge til sekvensene og merknaden til plasmidkonstruksjonene til henholdsvis det originale mm10 musegenomet og til mm10 musegenommerknaden. Ved å bruke lesejusteringsverktøyet TopHat i Tuxedo Suite54 ble avlesninger kartlagt til genomet og bare treff som var unike for plasmidtranskriptene sammenlignet med det endogene musereferansegenomet ble ansett som "matchede avlesninger" til plasmidkonstruksjonene. Antallet av de samsvarende avlesningene ble deretter kvantifisert for hver konstruksjon for hver prøve.

Genuttrykk og differensialanalyse. Genekspresjonsnivåer ble direkte beregnet fra lesejusteringsresultatene for hver replikat. Standard RPKM-verdier55, lesninger per kilobase av eksonmodell per million kartlagte lesninger) ble ekstrahert for hvert gen dekket av sekvenseringsdataene og hver replikat som ble brukt i denne studien.

Differensielle transkripsjonsanalyser ble utført ved bruk av Cyber ​​T56,57 på tvers av hvert par av grupper (hjemmebur versus 60 m etter trening) for å identifisere gener opp- eller nedregulert etter OLM. I tillegg til de 18-måned gamle HDAC3 plus/plus- og HDAC3ox/flox-musene som ble trent for den nåværende studien, behandlet identisk RNA-sekvenseringsdata fra {{10}}måned gamle C57 villtypemus ( homecage og OLM-trent på samme måte som den nåværende studien) fra en tidligere studie20 ble brukt til differensialanalyser. Antall dyr (biologiske replikater) for hver gruppe var: Ung HDAC pluss / pluss HC: 6, Ung HDAC3 pluss / pluss OLM: 6, Gammel HDAC3 pluss / pluss HC: 6, Gammel HDAC3 pluss / pluss OLM: 6, Gammel HDAC3flox/flox HC: 8, Gammel HDAC3flox/flox OLM: 8. Ingen tekniske replikater ble brukt. P-verditerskelen som brukes for å bestemme differensialuttrykk er 0,05 for alle grupper. False Discovery Rate (FDR) målt ved Benjamini & Hochberg (BH) q-verdi ble brukt for å korrigere for flere tester, med en FDR-terskel på 0,15. Settene med gener oppregulert etter opplevelsen (sammenlignet med hjemmebur) for disse 3 gruppene (ung villtype, aldrende HDAC pluss/pluss eller aldrende HDAC3flox/flox) ble krysset for å bestemme gener som er felles for to eller flere grupper. Anrikning av hver gruppe for vevsspesifikt uttrykk, Gene Ontology termer58 og KEGG pathways59,60 ble vurdert ved bruk av DAVID61, basert på differensielt uttrykte gener etter atferd. Datavisualisering ble utført ved å bruke "matplotlib" for python og "ggplot" for R.

Kromatin immunutfelling. ChIP ble utført på DH-stanser basert på protokollen fra Millipore ChIP kit11,12,62. Vev ble kryssbundet med 1 prosent formaldehyd (Sigma), lysert og sonikert, og kromatin ble immunutfelt over natten med 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) eller 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) eller en tilsvarende mengde normalt kaninserum (H4K8Ac negativ kontroll, Millipore) eller anti-muse IgG (HDAC3 negativ kontroll, Millipore). Etter vasking ble kromatin eluert fra kulene og reversert tverrbundet i nærvær av proteinase K før kolonnerensing av DNA. Primersekvenser for promotorene til hvert gen ble designet av Primer 3-programmet (tabell S4). Fem ul av input, anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG, eller anti-kanin/muse IgG immunutfelling fra hvert dyr ble undersøkt i duplikat. For å normalisere ChIP-qPCR-data brukte vi prosentinndatametoden. Inndataprøven ble justert til 100 prosent og både IP- og IgG-prøvene ble beregnet som en prosent av denne inngangen ved å bruke formelen 100*AE^(justert input – Ct(IP)). Foldeberikelse ble deretter beregnet som et forhold mellom ChIP og gjennomsnittlig IgG. En standardkurve i plate bestemte amplifikasjonseffektivitet (AE).

Forberedelse og opptak av skiver. Unge (omtrent 3-mnd) og aldrende (18-mnd) mus ble stereotaksisk infundert med viruset. For det første eksperimentet ble unge og gamle HDAC3 plus/plus- og HDAC3flox/flox-mus infundert med AAV-CaMKII-Cre bilateralt i DH. For det andre eksperimentet ble unge og gamle villtype C57-mus infundert med AAV-HDAC3(Y298H) i DH på en halvkule og AAV-EV-kontroll i den andre halvkule. To uker etter infusjon (for å tillate optimal virusekspresjon)2, ble tverrgående hippocampusskiver (320 μm) plassert i et grensesnittregistreringskammer med forvarmet (31 ± 1 grad) kunstig cerebrospinalvæske (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM) KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 og 10 mM D-glukose). Skiver ble kontinuerlig perfusert med en hastighet på 1,75–2 ml per min mens overflaten av skivene ble utsatt for varm, fuktet 95 prosent O2/5 prosent CO2. Opptakene startet etter minst 2 timers inkubasjon.

Felteksitatoriske postsynaptiske potensialer (fEPSPs) ble registrert fra CA1b stratum radiatum ved bruk av en enkelt glasspipette (2–3 MΩ) fylt med 2 M NaCl. Stimuleringspulser (0.05 Hz) ble levert til Schaffer collateral-commissural projeksjoner ved hjelp av en bipolar stimulerende elektrode (tvinnet nikromtråd, 65 μm) plassert i CA1c. Strømintensiteten ble justert for å oppnå 50 prosent av maksimal fEPSP-respons. Etter at en stabil grunnlinje ble etablert, ble LTP indusert med et enkelt tog på fem theta-utbrudd, hvor hvert utbrudd (fire pulser ved 100 Hz) ble levert 200 ms fra hverandre (dvs. ved theta-frekvens). Stimuleringsintensiteten ble ikke økt under TBS. Data ble samlet inn og digitalisert av NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Statistisk analyse. Statistiske analyser ble utført som angitt i tekst- og figurforklaringer ved bruk av Prism 6 (GraphPad). Våre analytiske tilnærminger er basert på tidligere publisert arbeid12,20,63,64. Ingen statistiske metoder ble brukt for å forhåndsbestemme utvalgsstørrelser, men våre utvalgsstørrelser er lik de som vanligvis brukes i feltet, inkludert de som er rapportert i tidligere publikasjoner12,20,64,65. Datafordelingen ble antatt å være normal, med lignende varians observert blant grupper, men dette ble ikke formelt testet. Når et eksperiment hadde to grupper å sammenligne, ble det brukt to-halede Students t-tester. Når to faktorer ble sammenlignet, (som alder og genotype eller økt og gruppe), ble data analysert med toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multiple sammenligninger post hoc-tester. Alle analyser er to-halede, med en verdi på 0,05 som kreves for signifikans. Feilstreker i alle figurer representerer SEM. For alle eksperimenter ble verdier ± 2SD fra gruppegjennomsnittet ansett som uteliggere og ble fjernet fra analyser.

Datatilgjengelighet. Dataene som støtter funnene i denne studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel. RNA-sekvenseringsdata er deponert i NCBIs Gene Expression Omnibus og er tilgjengelige gjennom GEO Series-tilgangsnummer GSE94832.

Referanser

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Epigenetiske endringer i den suprachiasmatiske kjernen og hippocampus bidrar til aldersrelatert kognitiv nedgang. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Døgnrytme og minnedannelse. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Cirkadisk oscillasjon av hippocampus MAPK-aktivitet og cAmp: implikasjoner for hukommelsesutholdenhet. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Cirkadisk modulering av læring og hukommelse hos fryktbetingede mus. Oppførsel. Brain Res. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Døgnklokken og patologien til den aldrende hjernen. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 porterer døgnmodulasjonen av minnerelevant signalering i musehippocampus ved å regulere kjernefysisk skytteltransport av CREB-kinasen pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD En epigenetisk hypotese om aldringsrelatert kognitiv dysfunksjon. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Endret histonacetylering er assosiert med aldersavhengig hukommelsessvikt hos mus. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. H3K9me3-hemming forbedrer hukommelsen, fremmer ryggradsdannelse og øker BDNF-nivåer i den eldre hippocampus. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetiske bidrag til kognitiv aldring: disentangling mindspan and lifespan. Lær Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-selektiv hemmer øker utryddelsen av kokainsøkende atferd på en vedvarende måte. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Kontekst og auditiv frykt er differensielt regulert av HDAC3-aktivitet i de laterale og basale subkjernene i amygdala. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 er en kritisk negativ regulator for langtidsminnedannelse. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Histon-deacetylase-hemming via RGFP966 frigjør bremsene på sensorisk kortikal plastisitet og spesifisiteten til minnedannelse.J. Neurosci. 35, 13124–13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Avdekke den skjulte katalytiske aktiviteten til virveldyr klasse IIa histon deacetylaser. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. Deacetylase-uavhengig funksjon av HDAC3 i transkripsjon og metabolisme krever nukleær reseptor corepressor. Mol. Cell 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Distinkte roller for deacetylase-domenet til HDAC3 i hippocampus og medial prefrontal cortex i dannelse og utryddelse av minne. Neurobiol. Lære. Mem. 145, 94–104 (2017).

18. Nott, A. et al. Histon deacetylase 3 assosieres med MeCP2 for å regulere FOXO og sosial atferd. Nat. Neurosci. 19, 1497–1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histondeacetylase 3 er nødvendig for riktig hjerneutvikling. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Den nevronspesifikke kromatinregulatoriske underenheten BAF53b er nødvendig for synaptisk plastisitet og hukommelse. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Transkripsjonsfaktorer i langtidshukommelse og synaptisk plastisitet. Physiol. Rev. 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Langsiktig potensering og den aldrende hjernen. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. UCSC Genome Browser-databasen: 2016-oppdatering. Nucleic Acids Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrarask og minneeffektiv justering av korte DNA-sekvenser til det menneskelige genomet. Genom Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Hippocampus-ekspresjonsanalyser avslører selektiv assosiasjon av umiddelbar-tidlige, nevroenergetiske og myelinogene veier med kognitiv svekkelse hos eldre rotter. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Differensielle roller for Nr4a1 og Nr4a2 i objektplassering vs objektgjenkjenning langtidsminne. Lær Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Effekter av søvnmangel og aldring på langtids- og fjernminne hos mus. Lær Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 koordinerer hippocampus rytmer og minnebehandling med dagtid. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Temporal dynamikk av mus hippocampal klokke genuttrykk støtter minnebehandling. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Cirkadiske svingninger i hippocampus støtter minnedannelse og utholdenhet. Foran Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Erfaringsavhengig genuttrykk i rottehippocampus etter romlig læring: en sammenligning av de umiddelbart-tidlige genene Arc, c-fos og zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Kromatinmodifikasjoner og deres funksjon. Cell 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Transkripsjonsaktivering i genomskala av et konstruert CRISPR-Cas9-kompleks. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Histone deacetylase 3-hemming reetablerer synaptisk merking og fangst i aldring gjennom aktivering av kjernefysisk faktor kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Synaptisk bevis for effektiviteten av avstandslæring. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Hippocampus fokal knockout av CBP påvirker spesifikke histonmodifikasjoner, langsiktig potensering og langtidshukommelse. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Økt langsiktig potensering ved medialt-perforante bane-dentate granulcellesynapser indusert av selektiv hemming av histondeacetylase 3 krever Fragilt X mental retardasjonsprotein. Neurobiol. Lære. Mem. 114, 193–197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB og minne. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funksjonelle roller til CREB som en positiv regulator i dannelsen og forbedringen av minne. Brain Res. Okse. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Genet som koder for det skjøre X RNA-bindende proteinet er kontrollert av nukleær respiratorisk faktor 2 og CREB-familien av transkripsjonsfaktorer. Nucleic Acids Res. 34, 1205-1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Roller til CREB i reguleringen av FMRP av gruppe I metabotropiske glutamatreseptorer i cingulate cortex. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Endret atferdsrytme og klokkegenuttrykk hos mus med en målrettet mutasjon i Period1-genet. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. DNA-metyleringsendringer i plastisitetsgener følger med dannelsen og vedlikeholdet av minne. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Erfaringsavhengig epigenomisk omorganisering i hippocampus. Lær Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Et klokkegen, punktum, spiller en nøkkelrolle i dannelsen av langtidshukommelse hos Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058–16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Kokainsensibilisering og belønning er under påvirkning av døgngener og rytme. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Den daglige oscillasjonen av MAP (mitogen-aktivert protein) kinase og adenylyl cyclase aktiviteter i hippocampus avhenger av den suprachiasmatiske kjernen. J. Neurosci. 31, 10640–10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Undersøker objektplassering og objektgjenkjenningsminne hos mus. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Døgnklokken i den ventromediale hypothalamus kontrollerer syklisk energiforbruk. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotyping av døgnrytmer hos mus. Curr. Protoc. Mus Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Reduksjon av lipofuscinlignende autofluorescens i fluorescerende merket vev. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfaffl, MW En ny matematisk modell for relativ kvantifisering i sanntids RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).

53. Pfafffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Relativt uttrykksprogramvareverktøy (REST) ​​for gruppevis sammenligning og statistisk analyse av relative uttrykksresultater i sanntids PCR. Nucleic Acids Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Differensiell gen- og transkripsjonsekspresjonsanalyse av RNA-seq-eksperimenter med TopHat og Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Kartlegging og kvantifisering av pattedyrtranskriptomer ved RNA-Seq. Nat. Methods 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T webserver: differensiell analyse av data med høy gjennomstrømning. Nucleic Acids Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Et Bayesiansk rammeverk for analyse av mikroarray-ekspresjonsdata: regularisert t-test og statistiske slutninger av genforandringer. Bioinformatikk 17, 509–519 (2001).