Del 2|Glykogensyntase kinase 3b hyperaktivitet i eksfolierede urinceller forutsier progresjon av diabetisk nyresykdom

Klikk her for del 1

For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

DISKUSJON

I USA og andre vestlige land er DKD fortsatt den ledende etiologien til progressivKronisk nyre sykdomog legger en tung byrde på statskassen og helsevesenet uten at noen endelig behandling ennå er tilgjengelig.5 Det har lenge vært erkjent at ikke alle pasienter med diabetes vil fortsette å utvikle DN.5 Avhengig av kohorten som er studert, har det blitt anslått at DN rammer mellom 30 og 50 prosent av diabetikere. Tiltakene som er tatt i bruk av gjeldende klinisk praksis for å identifisere diabetespasienter med risiko for å utvikle DKD, er i stor grad begrenset til øyeundersøkelser for retinopati og urinanalyse for albuminuri.5 Sammenfallende epidemiologiske bevis tyder imidlertid på at ekstrarenal mikrovaskulopati eller albuminuri er signifikant uenig med den påfølgende progresjonen av DKD.12,13,26,27 Som sådan er det et presserende behov for å utvikle en ny biomarkør for presis stratifisering av diabetespasienter med risiko for DN. Denne studien, for første gang, rapporterer at GSK3b er overuttrykt og hyperaktiv i parenkymnyreceller i både eksperimentell og klinisk DN, assosiert medprogresjon av nyresykdom. Dessuten er GSK3b-hyperaktivitet i urineksfolierede celler sannsynligvis i stand til å forutsi progresjonen av DN.

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

GSK3b, en svært konservert, redokssensitiv serin/treonin-proteinkinase, er sentralt involvert i insulinsignalering samt en rekke andre cellulære signalveier som er avgjørende for patofysiologiske prosesser knyttet tilnyreskade, reparasjon og regenerering. I insulinfølsomme vev, som lever og skjelettmuskulatur, er GSK3b aktiv under basale forhold og undertrykker aktiviteten til glykogensyntase.19,28 Insulin inaktiverer raskt GSK3b via hemmende fosforylering ved serin 9, noe som resulterer i glykogenbiosyntese. En økende mengde bevis tyder på at GSK3b-dysregulering er assosiert med type 2 diabetes mellitus.19,29–31 Faktisk er det data som indikerer GSK3b-overuttrykk og hyperaktivitet i muskler hos diabetespasienter31–33 og i fettvev hos overvektige diabetiske mus.34 Dessuten , transgen overekspresjon av GSK3b i skjelettmuskulatur hos mus forårsaker nedsatt glukosetoleranse, insulinresistens og hyperinsulinemi.29,35 Motsatt viste mus som mangler GSK3b i skjelettmuskulaturen forbedret glukosetoleranse.36 Konsekvent er GSK3-hemmere i stand til f.eks. litium, etterligner insulinvirkning i cellelinjer og vev.37 Dessuten, hos overvektige diabetiske mus, forbedret GSK3-hemmere insulinfølsomhet og glukosehomeostase.38nyrehar tradisjonelt ikke blitt betraktet som et målorgan for insulinvirkning. Imidlertid antydet overbevisende bevis nylig at insulin signaliserer innnyreceller, spesielt i podocytter, spiller en nøkkelrolle i å opprettholde glomerulære ognyrehomeostase.39–41 Defekt insulinsignalering i podocytter, på grunn av insulinmangel eller -resistens, er sannsynligvis en sentral initiator for mange av de patologiske lesjonene observert i DN. Videre har kliniske studier vist at insulinresistens korrelerer med utbruddet og alvorlighetsgraden av albuminuri selv hos normotensive pasienter som ikke har diabetes, noe som tyder på at insulinresistens i seg selv kan forårsake albuminuri.42 På samme måte kan mus med podocyttspesifikk insulinresistens, oppnådd av betinget knockout av insulinreseptoren i glomerulære podocytter, utviklet albuminuri og glomerulære lesjoner som rekapitulerer DN, til tross for fravær av hyperglykemi eller diabetes.41 Omvendt, hos diabetiske dyr er insulinsensibilisatorer i stand til å bremse progresjonen av DN uavhengig av glykemisk kontroll.43 Disse funnene tyder på at insulinsignalering regulerer podocyttfunksjonen uavhengig av blodsukkernivået. Men som nøkkeltransduseren av insulinsignalveien, har rollen til GSK3b i patogenesen og progresjonen av DN blitt mye understudert.

Inyre, GSK3b er hovedsakelig uttrykt i podocytter og, i mindre grad, i mesangiale og endotelceller i glomerulus20,21 og ekstensivt uttrykt av renale tubulære celler. Det er data fra våre og andre grupper som indikerer at GSK3b medierer autonom podocyttskade ved å integrere flere podocy topatiske signalveier.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blokade av GSK3b kan beskytte mot podocyttskade og dempe proteinuri i dyremodeller ulike ikke-diabetiske glomerulopatier.21 Dessuten i progressivekronisknyresykdom, GSK3b ble funnet å være en modulator av renal tubulær og interstitiell skade. Hvorvidt og hvordan GSK3b er involvert i DN har imidlertid vært usikkert og intenst kontroversielt, selv om denne studien viste at forbedret GSK3b-aktivering inyreog i urin eksfolierte celler kan være assosiert med utvikling eller progresjon av DKD. For eksempel, hos rotter med streptozotocin-indusert diabetes, fant Lin et al.46 at hemming av GSK3b av adenosintrifosfat-konkurrerende hemmer (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oksim ( BIO) svekket proteinuri og forbedrede glomerulære lesjoner av DN i fravær av korreksjon av hyperglykemi, noe som tyder på at GSK3b spiller en skadelig rolle i DN. Også hos rotter med streptozotocin-indusert diabetes, gjorde Paeng et al.22 lignende funn ved å bruke BIO og konkluderte med at økt GSK3b-aktivitet i podocytter under diabetiske forhold er assosiert med podocyttapoptose og tap i DN. Dette er kongruent med en annen in vitro-studie, der GSK3b ble funnet å mediere podocytt-dedifferensiering og skade etter eksponering for et medium med høyt glukose.47 Tvert imot hevdet Mariappan et al.48 at aktiveringen av GSK3b i stedet forbedrer diabetesindusertnyreskade. I deres studie ble streptozotocin-induserte diabetiske mus behandlet med natriumnitroprussid, en nitrogenoksiddonor som er i stand til å aktivere GSK3b. De fant at albuminuri, nyrehypertrofi og ekstracellulær matriseakkumulering i glomeruli ble alle forbedret i fravær av forbedring i hypertensjon eller hyperglykemi. Disse funnene motsier imidlertid skarpt dataene fra genmålrettede knock-in mus med konstitutivt aktiv GSK3 som utviklet spontan albuminuri og podocyttskade.49 For å forene de motstridende funnene, bør det utvises forsiktighet for å tolke dataene generert ved bruk av kjemiske hemmere eller aktivatorer. av GSK3b. Selv om BIO gjentatte ganger har blitt bekreftet å være en svært selektiv småmolekylær hemmer av GSK3b, er ikke natriumnitroprussid en spesifikk aktivator av GSK3b, men kjent for å ha en potent hemodynamisk effekt,50 som sannsynligvis vil forvirre dens albuminuri-reduserende og nybeskyttende virkning i diabetiske mus. Samlet sett, til tross for noen motstridende data, har rådende bevis en tendens til å støtte at GSK3b sannsynligvis er assosiert mednyreskadeog proteinuri i DN. Et par begrensninger ved denne studien må nevnes. For det første var de prekliniske dataene bare begrenset til DB/DB-murinemodellene. For å bestemme generaliserbarheten til rollen til GSK3b idiabetisk nyreskade, er det nødvendig å validere funnene i andre modeller av DN, inkludert type 1 DN-modeller. For det andre ble de kliniske observasjonene her hentet fra retrospektive kohorter av diabetespasienter med begrenset utvalgsstørrelse og relativt kort oppfølgingstid. Riktignok kreves det storskala, prospektive, randomiserte, multisenterstudier for å verifisere observasjonene våre og for å bekrefte kraften til GSK3b i urineksfolierede celler for å forutsi utfallet av DKD.

GSK3b, en svært konservert, redokssensitiv serin/treonin-proteinkinase, er sentralt involvert i insulinsignalering samt en rekke andre cellulære signalveier som er avgjørende for patofysiologiske prosesser knyttet tilnyreskade, reparasjon og regenerering. I insulinfølsomme vev, som lever og skjelettmuskulatur, er GSK3b aktiv under basale forhold og undertrykker aktiviteten til glykogensyntase.19,28 Insulin inaktiverer raskt GSK3b via hemmende fosforylering ved serin 9, noe som resulterer i glykogenbiosyntese. En økende mengde bevis tyder på at GSK3b-dysregulering er assosiert med type 2 diabetes mellitus.19,29–31 Faktisk er det data som indikerer GSK3b-overuttrykk og hyperaktivitet i muskler hos diabetespasienter31–33 og i fettvev hos overvektige diabetiske mus.34 Dessuten , transgen overekspresjon av GSK3b i skjelettmuskulatur hos mus forårsaker nedsatt glukosetoleranse, insulinresistens og hyperinsulinemi.29,35 Motsatt viste mus som mangler GSK3b i skjelettmuskulaturen forbedret glukosetoleranse.36 Konsekvent er GSK3-hemmere i stand til f.eks. litium, etterligne insulin

virkning i cellelinjer og vev.37 Dessuten, hos overvektige diabetiske mus, forbedret GSK3-hemmere insulinfølsomhet og glukosehomeostase.38 Nyren har tradisjonelt ikke blitt betraktet som et målorgan for insulinvirkning. Imidlertid har overbevisende bevis nylig antydet at insulinsignalering i nyreceller, spesielt i podocytter, spiller en nøkkelrolle i å opprettholde glomerulær og nyrehomeostase.39–41 Defekt insulinsignalering i podocytter, på grunn av insulinmangel eller -resistens, er sannsynligvis en sentral initiator. for mange av de patologiske lesjonene observert i DN. Videre har kliniske studier vist at insulinresistens korrelerer med utbruddet og alvorlighetsgraden av albuminuri selv hos normotensive pasienter som ikke har diabetes, noe som tyder på at insulinresistens i seg selv kan forårsake albuminuri.42 På samme måte kan mus med podocyttspesifikk insulinresistens, oppnådd av betinget knockout av insulinreseptoren i glomerulære podocytter, utviklet albuminuri og glomerulære lesjoner som rekapitulerer DN, til tross for fravær av hyperglykemi eller diabetes.41 Omvendt, hos diabetiske dyr er insulinsensibilisatorer i stand til å bremse progresjonen av DN uavhengig av glykemisk kontroll.43 Disse funnene tyder på at insulinsignalering regulerer podocyttfunksjonen uavhengig av blodsukkernivået. Men som nøkkeltransduseren av insulinsignalveien, har rollen til GSK3b i patogenesen og progresjonen av DN blitt mye understudert.

I nyrene er GSK3b hovedsakelig uttrykt i podocytter og, i mindre grad, i mesangiale og endotelceller i glomerulus20,21 og i stor grad uttrykt av renale tubulære celler. Det er data fra våre og andre grupper som indikerer at GSK3b medierer autonom podocyttskade ved å integrere flere podocyttpatiske signalveier.17,20,44,45 Inkonsekvens, genetisk eller farmakologisk blokade av GSK3b kan beskytte mot podocyttskade og dempe proteinuri i dyremodeller ulike ikke-diabetiske glomerulopatier.21 Dessuten, i progressiv kronisknyresykdom, GSK3b ble funnet å være en modulator av renal tubulær og interstitiell skade. Hvorvidt og hvordan GSK3b er involvert i DN har imidlertid vært usikkert og intenst kontroversielt, selv om denne studien viste at forbedret GSK3b-aktivering i nyrene og i urineksfolierede celler kan være assosiert med utvikling eller progresjon av DKD. For eksempel, hos rotter med streptozotocin-indusert diabetes, fant Lin et al.46 at hemming av GSK3b av adenosintrifosfat-konkurrerende hemmer (20 Z,30 E)-6- brom i indirubin-30 -oksim ( BIO) svekket proteinuri og forbedrede glomerulære lesjoner av DN i fravær av korreksjon av hyperglykemi, noe som tyder på at GSK3b spiller en skadelig rolle i DN. Også hos rotter med streptozotocin-indusert diabetes, gjorde Paeng et al.22 lignende funn ved å bruke BIO og konkluderte med at økt GSK3b-aktivitet i podocytter under diabetiske forhold er assosiert med podocyttapoptose og tap i DN. Dette er kongruent med en annen in vitro-studie, der GSK3b ble funnet å mediere podocytt-dedifferensiering og skade etter eksponering for et medium med høyt glukose.47 Tvert imot hevdet Mariappan et al.48 at aktiveringen av GSK3b i stedet forbedrer diabetesindusertnyreskade. I deres studie ble streptozotocin-induserte diabetiske mus behandlet med natriumnitroprussid, en nitrogenoksiddonor som er i stand til å aktivere GSK3b. De fant at albuminuri, nyrehypertrofi og ekstracellulær matriseakkumulering i glomeruli ble alle forbedret i fravær av forbedring i hypertensjon eller hyperglykemi. Disse funnene motsier imidlertid skarpt dataene fra genmålrettede knock-in mus med konstitutivt aktiv GSK3 som utviklet spontan albuminuri og podocyttskade.49 For å forene de motstridende funnene, bør det utvises forsiktighet for å tolke dataene generert ved bruk av kjemiske hemmere eller aktivatorer. av GSK3b. Selv om BIO gjentatte ganger har blitt bekreftet å være en svært selektiv småmolekylær hemmer av GSK3b, er ikke natriumnitroprussid en spesifikk aktivator av GSK3b, men kjent for å ha en potent hemodynamisk effekt,50 som sannsynligvis vil forvirre dens albuminuri-reduserende og nybeskyttende virkning i diabetiske mus. Samlet sett, til tross for noen motstridende data, har rådende bevis en tendens til å støtte at GSK3b sannsynligvis er assosiert mednyreskadeog proteinuri i DN. Et par begrensninger av

nåværende studie må nevnes. For det første var de prekliniske dataene bare begrenset til de dB/dB murine modellene. For å bestemme generaliserbarheten til rollen til GSK3b idiabetisk nyreskade, er det nødvendig å validere funnene i andre modeller av DN, inkludert type 1 DN-modeller. For det andre ble de kliniske observasjonene her hentet fra retrospektive kohorter av diabetespasienter med begrenset utvalgsstørrelse og relativt kort oppfølgingstid. Riktignok kreves det storskala, prospektive, randomiserte, multisenterstudier for å verifisere observasjonene våre og for å bekrefte kraften til GSK3b i urineksfolierede celler for å forutsi utfallet av DKD.

Oppsummert viste studiene våre at nyreekspresjon og aktivitet av GSK3b forsterkes i eksperimentell og klinisk DN. GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller kan tjene som en ny biomarkør for å forutsi progresjonen av DN. Dataene våre kan bane vei for en storstilt, dyptgående undersøkelse av verdien som GSK3b i urineksfolierede celler kan tjene som en prognostisk biomarkør for DN.

METODER

Dyrestudier

Dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care and Committee, og de er i samsvar med det amerikanske landbruksdepartementets forskrifter og National Institutes of Healths guide for human Care and Use of Laboratory Animals. DB/DB-hannmus og kontroll-db/m-kullkamerater i alderen 6 uker ble kjøpt fra NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Kina) og plassert i Central Animal Facility ved Zhengzhou University. Alle mus ble matet ad libitum, og 8 til 10 mus ble drept ved angitte alder. Urin- og blodprøver ble tatt på angitte tidspunkter. Etter avliving ble nyrene høstet for videre undersøkelse. Urinalbuminnivåer ble målt ved bruk av et musealbumin-enzym-koblet immunosorbentanalyse-kvantifiseringssett (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Urinkreatininnivåer ble bestemt ved bruk av et kreatininanalysesett (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Cellekultur

Betinget udødeliggjorte musepodocytter mellom passasjer 21 og 25 ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum under tillatte forhold som beskrevet tidligere.22 Subkulturer av podocyttene ble utsatt for ikke-permissive forhold for å indusere differensiering i 14 dager og ble deretter eksponert for et normalt miljø/kulturmedium som inneholdt 5 mM glukose, et diabetisk miljø bestående av glukose (25 mM) og transformerende vekstfaktor b1 (2 ng/ml), eller et kontrollmedium med høy osmolalitet inneholdende 20 mM mannitol for 48 timer. Murine proksimale tubulære epitelceller og muse glomerulære mesangiale celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/F12 supplert med 5 prosent føtalt bovint serum. Celler ble sådd ut ved w70 prosent konfluens i mediet som inneholdt 5 prosent føtalt bovint serum i 24 timer og gjennomgikk deretter serumsulting i ytterligere 24 timer etterfulgt av eksponering for et normalt miljø/kulturmedium som inneholdt 5 mM glukose, et diabetisk miljø bestående av høy glukose (25 mM) og transformerende vekstfaktor b1 (2 ng/ml), eller et kontrollmedium med høy osmolalitet inneholdende 5 mM glukose og 20 mM mannitol i 48 timer. Cellelevedyktighet ble vurdert ved Trypanblått eksklusjon. Ved angitte tidspunkter ble celler fiksert eller cellelysater samlet for videre undersøkelse.

Forbigående transfeksjon av vektorer

Vektorene som koder for tom vektor eller hemagglutinin (HA)-merket konstitutivt aktiv (S9A) mutant (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) av GSK3b ble levert av Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) og ble transfektert til dyrkede podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller ved å bruke Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) som tidligere beskrevet.44 Transfeksjonseffektivitet ble verifisert ved immunfluorescensfarging eller immunblotting for HA etter 12 timer. Celler ble deretter samlet og forberedt for Western blot-analyse eller andre analyser.

RNAi

En samling av 3 mus GSK3b-spesifikke små, interfererende RNA-duplekser—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACTt-30 og 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 - ble designet og syntetisert i henhold til den fullstendige kodende sekvensen til det murine GSK3b-genet (GenBank-aksessnr. BC060743.1). I tillegg ble en kryptert liten, forstyrrende RNA-sekvens (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUTt-30) uten sekvenslikhet med noen kjente gensekvenser fra mus, rotter eller mennesker brukt som kontroll for RNAi. Effektiviteten til lipofektamin (Invitrogen, Carlsbad, CA) -mediert gen-demping ble vurdert ved immunoblotanalyse for GSK3b. Tilfredsstillende undertrykkelse av GSK3b-proteinekspresjon ble observert i dyrkede podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller 24 timer etter RNAi. Celler ble deretter utsatt for et normalt miljø/kulturmedium, et diabetisk miljø eller et kontrollmedium med høy osmolalitet i 48 timer som angitt ovenfor før cellene ble behandlet for ytterligere analyser.

Kliniske studier

Den kliniske delen av denne studien samsvarte med de etiske retningslinjene i Helsinki-erklæringen fra 1975 og ble godkjent av Institutional Review Board of the First Affiliated Hospital of ZhengzhouUniversity. Menneskelige forskningsdeltakere ble ikke spesielt rekruttert til denne studien. Alle de kliniske dataene ble samlet inn ved retrospektiv kartgjennomgang og ved undersøkelse av arkiverte vevssnitt eller urinprøver. For mange eller kasserte nyrebiopsiprøver, samt fraksjonerte urinprøver, har rutinemessig blitt deponert ved Institute of Nephrology ved det første tilknyttede sykehuset ved Zhengzhou University. Arkivert uidentifisert formalinfiksert parafininnstøpt nyrebiopsivev fra pasienter i forskjellige stadier av DN ble tilfeldig valgt for undersøkelse. Ytterligere nyreprøver uten histomorfologiske lesjoner ble hentet fra nyrer som ble kastet for transplantasjon på grunn av vaskulære anomalier eller fra preimplantasjonsbiopsivev og fungerte som normale kontroller. For den retrospektive kohortstudien ble totalt 127 pasienter med type 2 diabetes mellitus, som hadde blitt fulgt opp siden 2010 med bankprøver av fraksjonert urin, retrospektivt screenet for inkludering i denne studien. De studerte pasientene var mellom 29 og 80 år og diagnostisert med type 2-diabetes i henhold til American Diabetes Association-kriteriene. Ekskluderingskriterier inkluderte tap av oppfølging, utilstrekkelig informasjon,nyredysfunksjon, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 år. Under rutinemessig oppfølging ble demografiske data, så vel som kliniske parametere, dokumentert, inkludert kjønn, alder, komorbiditeter, medisiner, varighet av diabetes, blodtrykk, glykemisk nivå, serumkreatininnivå, urinanalysedata, UAE og eGFR. Det kliniske resultatet etter 5 års oppfølging var tilstedeværelse eller fravær av progresjon av nedsatt nyrefunksjon, som ble definert som enten $25 prosent reduksjon i eGFR eller progresjon av albuminuri som indikert av eskaleringen av alvorlighetsgraden av albuminuri langs ulike kliniske stadier av DN, det vil si normoalbuminuri, mikroalbuminuri, makroalbuminuri eller åpenbar proteinuri. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke.

Nyremorfologivurdering og immunhistokjemianalyse

Parafininnstøpte formalinfikserte musenyrevevsblokker ble kuttet i 3-mm seksjoner. For generell histologi ble seksjoner behandlet for periodisk syre-Schiff-farging. Immunhistokjemisk farging for GSK3b og p-GSK3b ble utført ved bruk av et VECTASTAIN ABC-sett (Vector Laboratories, Burlingame, CA) som beskrevet tidligere.20 Som en negativ kontroll ble det primære antistoffet erstattet med ikke-immun serum fra samme art; ingen farging oppstod. De morfologiske egenskapene til alle seksjoner ble vurdert av en enkelt observatør på en blind måte med bistand fra en nyrepatolog.

Immunfluorescerende farging

Dyrkede celler eller frosne kryostatseksjoner ble fiksert og farget med primære antistoffer og fulgt av påføring av Alexa Fluor-konjugerte sekundære antistoffer (Invitrogen). Som en negativ kontroll ble primære antistoffer erstattet med preimmunt IgG fra samme art; ingen farging oppstod. Til slutt ble seksjoner motfarget med 40,6-diamidino-2-fenylindol eller propidiumjodid og montert med VECTASHIELD monteringsmedium (Vector Laboratories). For FL-fluorescensmikroskopi ble alle seksjoner analysert samtidig for å utelukke artefakter på grunn av variabel nedbrytning av fluorokromet. Snitt ble undersøkt ved bruk av et Olympus FL fluorescensmikroskop utstyrt med et Spot II digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan). For tofargefarging ble bilder tatt sekvensielt for å unngå fargestoffinterferens. ImageJ-programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD) ble brukt til etterbehandling av bildene, for eksempel skalering, sammenslåing og kolokaliseringsanalyse.

Datastyrt morfometri

Bilder av immunhistokjemifarging ble fanget og digitalisert ved hjelp av et datastyrt bildeanalysesystem bestående av et høyoppløselig ladningskoblet digitalkamera festet til et mikroskop (Olympus BX41, Olympus) og til en datamaskin. Bildene ble vist med en pikseloppløsning på 1024 768 piksler (romlig oppløsning, 0,24 mm/piksel). For bilder av immunhistokjemifarging av humant nyrevev, ble ImageJ-programvare brukt for bildesegmentering, terskeletablering og målinger av signalintensitet. Manuelle korrigeringer ble utført etter behov. Totalt ble det tatt prøver av 10 glomeruli eller 10 tilfeldige tubulointerstitielle felt for morfometrisk analyse, og de endelige dataene ble uttrykt som verdien av integrert pikseltetthet i forhold til kontrollgruppen.

Western immunoblot analyse

Dyrkede celler ble lysert;nyreveveller isolerte nyre glomeruli ble homogenisert i radioimmunutfellingsanalysebuffer supplert med proteasehemmere, og prøver ble behandlet for immunoblotanalyse. For immunoblotanalyse av det begrensede antallet eksfolierede celler i urinen, ble protokollen for Western blot modifisert som beskrevet tidligere ved å bruke høyytelses NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) og høykvalitets overføringsmembraner.25 Raffinert immunoblotting kunne oppdage moderat uttrykte proteiner i så få som 1000 celler. Antistoffene mot GSK3b, fibronektin, kollagen IV, aktin og glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); de mot synaptopodin ble kjøpt fra PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Tyskland); og de mot ZO-1 og p-GSK3b ble anskaffet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistisk analyse

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 sammenligninger. Kategoriske data ble sammenlignet mellom grupper ved bruk av kjikvadrattesten. Lineær regresjonsanalyse ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger mellom 2 parametere. Univariate Cox proporsjonal hazards regresjonsanalyser ble utført for å vurdere assosiasjonene mellom de relevante variablene og risikoen for progresjon av nedsatt nyrefunksjon, etterfulgt av multivariate analyser med hensyn til potensielle konfoundere. ROC-kurveanalyse ble utført og områdene under ROC-kurvene ble målt for å analysere kraften til visse variabler for å forutsi progresjon av nedsatt nyrefunksjon hos diabetespasienter. Ikke-normalfordelte variabler, slik som UAE, ble transformert ved logaritme for å oppnå normalitet for Cox-andelen farer regresjonsanalyser ROC-kurveanalyser. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av PSS versjon 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P-verdier<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

FORMIDLING

Alle forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

TAKK

En del av denne studien ble presentert som en muntlig presentasjon på KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15.–20. november 2016, Chicago, IL. RG ble delvis støttet av stiftelsen for helse. XL ble støttet av et stipendiat for å få ekstramural opplæring. ZL ble støttet av National NaturalScience Foundation of China bevilger U1604284, 81770672 og 81873612. Finansierne hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av denne studien, innsamlingen og tolkningen av dataene, eller forberedelsen og godkjenningen av manuskriptet.

FORFATTERBIDRAG

RG utviklet de konseptuelle ideene. XL, ZL og RG bidro til studiedesignet. XL, PW, BC, YG, AYG og BF utførte cellekultureksperimentene. XL og ZL utførte dyreforsøkene og samlet inn data fra diabetespasienter. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, og bidro til diskusjon og tolkning av resultatene. tok ledelsen i å skrive manuskriptet. XL, BC og BF bidro til manuskriptredigering. Alle forfattere var enige om at hele konseptet og eierskapet til dette verket tilhører RG. Alle forfattere godkjente det endelige manuskriptet.

TILLEGGSMATERIALE

Supplerende metoder.

Tabell S1. Kjennetegn på kontrollpersoner og pasienter med diabetisk nefropati, stratifisert i henhold til histologiske klasser av diabetisk nefropati. Tabell S2. Baseline demografiske, kliniske og laboratoriedata for den retrospektive kohorten av diabetespasienter i tidlig stadium uten tegn på DKD. Tabell S3. Demografiske, kliniske og laboratoriedata for pasienter med diabetes type 2 i tidlig stadium, stratifisert i henhold til deres nyreresultater etter 5 års oppfølging. Figur S1. Den økte nyreaktiviteten til GSK3b forutsier utviklingen og alvorlighetsgraden avdiabetikernyresykdomi db/db mus. Db/db og db/m hannmus ble fulgt opp mellom 4 og 13 uker gamle. (A) Blod ble tatt fra ikke-fastende mus ved 4 og 7 ukers alder, og plasmaglukosenivåer ble analysert. *P < 0.001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 7="" ukers="" alder.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" spoturin="" ble="" tatt="" ved="" 4,="" 7,="" 10="" og="" 13="" ukers="" alder="" og="" utsatt="" for="" urinalbumin="" og="" urinkreatininanalyse="" for="" bestemmelse="" av="" urinalbumin-til-kreatinin-forhold="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 10="" ukers="" alder="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" versus="" db/m="" mus="" ved="" 13="" ukers="" alder.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" alle="" mus="" fikk="" åpen="" nyrebiopsi="" ved="" 7="" ukers="" alder,="" og="" biopsiprøver="" ble="" behandlet="" for="" immunoblotanalyse="" for="" p-gsk3b,="" gsk3b="" og="" gapdh.="" (d)="" immunoblots="" ble="" utsatt="" for="" densitometrisk="" analyse.="" den="" relative="" overfloden="" av="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" ble="" bestemt="" som="" densitometriske="" forhold="" mellom="" respektive="" molekyl/gapdh="" som="" fold="" endringer="" sammenlignet="" med="" kontroll="" db/m="" mus.="" den="" relative="" aktiviteten="" til="" gsk3b="" ble="" beregnet="" som="" forhold="" mellom="" p="" gsk3b="" og="" gsk3b="" som="" folder="" av="" kontroll="" db/m="" mus.="" (e)="" lineær="" regresjonsanalyse="" viste="" en="" statistisk="" signifikant="" positiv="" korrelasjon="" mellom="" renal="" gsk3b-aktivitet="" ved="" 7="" ukers="" alder="" hos="" db/db-mus="" og="" utviklingen="" og="" alvorlighetsgraden="" av="" albuminuri,="" et="" kjennetegn="">diabetikernyresykdomved 13 ukers alder. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Mottakeroperasjonskarakteristisk kurveanalyse viste at nyre-GSK3b-aktivitet i tidlige stadier av diabetes (7 ukers alder) gir utmerket nøyaktighet og kraft i å forutsi utviklingen av albuminuri og DKD ved 13 ukers alder hos db/db-mus. Figur S2. Insulinresistens og høy omgivelsesglukose aktiverer synergistisk GSK3b i nyreceller. (A) dyrkede murine podocytter, (B) urin glomerulære mesangiale celler (MMCs) og (C) renale tubulære epitelceller (TECs) ble transfektert med krypterte siRNA-oligonukleotider (siCon) eller siRNA-oligonukleotider (siIRb) spesifikke for b-isoformen insulinreseptoren (IRB) for å modellere tilstanden til insulinresistens in vitro. Celler ble deretter eksponert i 48 timer for det normale glukoseholdige normale miljøet (NG) eller det høyglukoseholdige diabetiske miljøet (HG). Cellelysater ble samlet og utsatt for immunoblotanalyse for IRB, p-GSK3b, GSK3b og GAPDH etterfulgt av densitometrisk analyse av blottene. *P < 0,01="" versus="" irb-ekspresjon="" i="" sicon-behandlede="" celler="" eksponert="" for="" samme="" miljø="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" versus="" samme="" proteinekspresjon="" i="" siirb="" þ="" ng-="" eller="" sicon="" þ="" hg-gruppen="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" mot="" samme="" proteinuttrykk="" i="" den="" andre="" þ="" hg-="" eller="" siirb="" þ="" ng-gruppen="" (n="" ¼="" 3).="" figur="" s3.="" ekspresjonsnivåer="" av="" gsk3b-mrna="" i="" humane="" nyreprøver="" hentet="" fra="" friske="" levende="" givere="" og="" pasienter="" med="" diabetisk="" nefropati.="" data="" ble="" hentet="" fra="" www.nephroseq.org="" på="" grunnlag="" av="" ju="" ckd="" glom-datasettet51="" og="" uttrykt="" som="" log2="" mediansentrert="" intensitet.="" figur="" s4.="" forbedret="" aktivitet="" av="" gsk3b="" i="" eksfolierede="" urinceller="" samlet="" fra="" diabetespasienter="" i="" tidlig="" stadium="" forutsier="" utviklingen="" av="" diabetisk="" nyresykdom.="" (a,="" b)="" deteksjon="" av="" gsk3b="" og="" aktivert="" gsk3b="" i="" urineksfolierede="" celler="" samlet="" fra="" tidlig="" stadium="" diabetespasienter="" (pts)="" og="" friske="" kontroller="" (ctrls).="" urineksfolierede="" celler="" ble="" samlet="" og="" lysert.="" cellelysater="" ble="" behandlet="" for="" immunoblotanalyse="" for="" gsk3b,="" p-gsk3b="" og="" gapdh.="" (c)="" immunoblots="" ble="" utsatt="" for="" densitometrisk="" analyse.="" den="" relative="" overfloden="" av="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" ble="" bestemt="" som="" densitometriske="" forhold="" mellom="" respektive="" molekyl/gapdh="" som="" fold="" endringer="" sammenlignet="" med="" kontroller="" (ctrls).="" den="" relative="" aktiviteten="" til="" gsk3b="" ble="" beregnet="" som="" forhold="" mellom="" p-gsk3b="" og="" gsk3b="" som="" folder="" av="" normal="" kontroll="" (ctrls).="" (d)="" mottakeroperasjonskarakteristisk="" kurveanalyse="" viste="" at="" den="" relative="" gsk3b-aktiviteten="" (p-gsk3b/gsk3b-forhold)="" i="" urineksfolierte="" celler="" samlet="" inn="" fra="" diabetespasienter="" i="" tidlig="" stadium="" gir="" utmerket="" nøyaktighet="" i="" å="" forutsi="" utviklingen="">diabetisk nyresykdomom 5 år, hvor arealet under kurven (AUC) er 0.886.

REFERANSER

1. Umanath K, Lewis JB. Oppdatering om diabetisk nefropati: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Endringer i diabetesrelaterte komplikasjoner i USA, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan for forsinkelse eller forebygging av mikroalbuminuri ved type 2 diabetes. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetiske mekanismer ved diabetisk nefropati. J Am Soc Nephrol. 2005;16(tillegg 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Klinisk manifestasjon og naturlig historie av diabetisk nefropati. Bidra Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-års oppfølging av intensiv glukosekontroll ved type 2 diabetes. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Mikroalbuminuri og risiko for tidlig progredierende nyrefunksjon ved type 1 diabetes. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Risiko for progresjon av normoalbuminurisk CKD til nyresykdom i sluttstadiet hos personer med diabetes: CRIC-studien (Chronic Renal Insufficiency Cohort). Am J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Behovet for tidlige prediktorer for risiko for diabetisk nefropati: er albuminutskillelseshastigheten tilstrekkelig? Diabetes. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Lav glomerulær filtrasjonshastighet hos normoalbuminuriske type 1 diabetespasienter: en indikator på mer avanserte glomerulære lesjoner. Diabetes. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Progressiv nyresvikt: det nye paradigmet for diabetisk nefropati ved type 1 diabetes. Diabetes omsorg. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Ikke-proteinurisk diabetisk nefropati. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Utvikling og progresjon av nefropati ved type 2 diabetes: Storbritannias prospektive diabetesstudie (UKPDS 64). Nyre Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Urinbiomarkører ved vurdering av tidlig diabetisk nefropati. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Urin-IgG4 og Smad1 er spesifikke biomarkører for nyrenes strukturelle og funksjonelle endringer i de tidlige stadiene av diabetisk nefropati. Diabetes. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Eksocytosemediert utskillelse av megalin i full lengde i urin er knyttet til patogenesen av diabetisk nefropati. Diabetes. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glykogensyntase kinase 3b dikterer podocyttmotilitet og fokal adhesjonsomsetning ved å modulere paxillinaktivitet: implikasjoner for den beskyttende effekten av lavdose litium ved podocytopati. Am J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glykogensyntasekinase-3: egenskaper, funksjoner og regulering. Chem Rev. 2001;101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glykogensyntasekinase-3 (GSK3): regulering, handlinger og sykdommer. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. b-isoformen av GSK3 medierer autonom podocyttskade ved proteinurisk glomerulopati. J Pathol. 2016;239:23.