Del 2: Integrert nettverksfarmakologi og sebrafiskmodell for å undersøke dobbelteffektkomponenter av Cistanche Tubulosa for behandling av både osteoporose og Alzheimers sykdom

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

KLIKK HER FOR DEL 1

3. Resultater

3.1 Kandidatforbindelser og Poforeløpige mål

I forskning på CT-kjemiske bestanddeler ble totalt 75 ingredienser hentet fra TCMSP. Deretter ble PCA utført for å visualisere den kjemiske fordelingen av CT. Som vist i figur 1, var ingrediensene i CT mangfoldige i kjemisk rom, og 28 av dem tilfredsstilte Lipinskis femteregel (Lipinski, 2003). Interessant nok var det mange overlappende deler mellom ingrediensene i CT og godkjente småmolekylære legemidler for OP/AD. Det illustrerte at mange forbindelser i CT hadde potensiell medisinerbarhet på OP/AD. For ytterligere å evaluere deres medisinerbarhet, ble 43 forbindelser screenet av DL. Etter målprediksjon ble 26 kandidatforbindelser valgt for den påfølgende analysen. Og de kan dokkes med totalt 847 målproteiner.

cistamchehar en anti-Alzheimers sykdom effekt.

Genoppføringene relatert til OP eller AD ble samlet inn fra databasene DisGeNET og GeneCards. Som et resultat ble det samlet inn henholdsvis 3052 og 8042 genoppføringer. Vi tok i bruk de to skårene fra DisGeNET- og GeneCards-databasene som evalueringspoeng, og screenet den øverste femtedelen av målene. En femtedel-forholdet ble bestemt ved forhåndseksperimenter. Deretter ble 211 OP-ED vanlige mål bevart for å matche målene til 26 kandidatforbindelser. Til slutt ble totalt 81 proteinmål (tilleggstabell S2) som forbinder med 22 kandidatforbindelser (tilleggstabell S3) valgt for molekylære mekanismer for handlingsanalyse, og dannet et protein-protein-interaksjonsnettverk (PPI) vist i figur 2.

De 22 forbindelsene ble delt inn i 11 kategorier: 5 fenyletanoidglykosider (PhGs) (Decaffeoylacteosid, Cistanoside E, etc.), 3 fenylakryloligosakkarider (Cistanoside H, Cistanoside F, etc.), 3 iridoider og iridoid glycosid, etc.), 3 lignaner og lignanglykosider (Yangambin, (pluss)-Pinoresinol-O- -D-glukopyranosid, etc.), 2 flavonoider (quercetin, genistein), 1 alkaloid, 1 terpen, 1 sterol, 1 fettalkohol, 1 fettsyre og annet. I følge tidligere rapporter er disse forbindelsene hovedkomponentene eller aktive funksjonelle ingrediensene i CT (Fu et al., 2018).

I figur 2 ble totalt 81 vanlige mål funnet å ha korrelasjoner med OP og AD. Graden av PPI ble tatt i bruk som en karakteristisk parameter for å definere betydningen av potensielle mål. De 5 beste antatte målproteinene assosiert med OP og AD var albumin (ALB), insulin (INS), interleukin 6 (IL6), TNF-alfa (TNF) og epidermal vekstfaktor (EGF).

Figur 1.Kjemisk fordeling basert på hovedkomponentanalyse (PCA).

3.2 Integrert og klassifisert nettverksanalyse

81 antatte målproteiner i tabell S2 ble valgt for å starte GO- og KEGG-baneanrikningsanalyse. Etter filtrering etter p-verdi (GO cut-off på mindre enn eller lik 0.05, KEGG pathway cut-off på mindre enn eller lik 0,01), 15 GO termer og 66 KEGG banetermer ble returnert, som vist i figur 3 og 4. Totalt 16 GO-termer er inkludert: 5 for molekylær funksjon, 5 for biologiske prosesser og 6 for cellekomponentene. Siden denne studien var rettet mot å oppdage den potensielle vanlige patogenesen til OP og AD, fjernet vi banebetingelsene direkte relatert til andre sykdommer og klassifiserte resten i forskjellige funksjonelle kategorier. Det antydet at de 22 aktive ingrediensene i CT kan regulere totalt 66 veier som hovedsakelig korrelerte med signaltransduksjon, endokrine system, immunsystem, cellevekst og død for å spille en konfronterende rolle mot OP og AD.

For å avsløre forskjellene i virkningen av forskjellige typer forbindelser, ble PPI-nettverket konstruert i figur 2 analysert i henhold til deres kategorier i tabell S3. Figur 5 illustrerte at 5 PhG, 2 flavonoider, 1 terpen og 1 sterol, spesielt flavonoider, kan være viktigere enn andre ingredienser i CT mot OP og AD. Etter det ble disse 4 seriene med aktive forbindelser valgt for å avdekke deres komprimerte veier. Som det kan sees fra figur 6, fungerte PhG, flavonoider, terpen og sterol sammen eller alene på 27 veier, inneholdende 11 moduler: cellevekst og død, endokrine system, immunsystem, signaltransduksjon, utvikling og andre. Resultatene antydet at disse forbindelsene kan spille en synergistisk rolle i de positive effektene av CT på OP og AD. Det er verdt å merke seg at de beskyttende effektene av PhGs kan være mer bemerkelsesverdige enn flavonoider ved nevrodegenerativ sykdom siden PhGs hadde direkte interaksjoner med Alzheimers sykdomsvei mens flavonoider var relatert til signalmolekyler og interaksjon. Bare sterol og terpen var relatert til lipidmetabolisme og ekskresjonssystemet. I tillegg viste PhG, terpen og flavonoider en potensiell sammenheng med endokrine og metabolske sykdommer.

I følge PPI-illustrasjonen ble 2 flavonoider (GE, QU), 1 terpen (AA) og 1 sterol (BSS) tatt i bruk som verdifulle forbindelser for videre forskning på molekylære mekanismer. Interessant nok fant vi at de alle er relatert til MAPK-signalveien og TGF-beta-signalveien. Og p-verdien til de to banene var også mye høyere. Putative mål for 4 verdifulle forbindelser og fordelingen av deres berørte proteiner i de to banene ble demonstrert i figur 7.

3.3 Verdifulle forbindelser Effektvalidering

I denne nettverksanalysen etablert i 3.2 fanget vi 4 verdifulle forbindelser for farmakologisk aktivitetsvalidering. Ved den topologisk strukturelle analysemetoden i denne studien fant vi at genistein (GE, C9, DL=0.21), quercetin (QU, C11, DL=0.28), abietinsyre (AA, C19, DL=0.28) og -sitosterol (BSS, C20, DL=0.21) viste mulig samspill mot OP og AD. I denne delen ble sebrafisklarver in vivo-modeller indusert av henholdsvis Pre eller AlCl3 etablert for å evaluere de beskyttende effektene av 4 forbindelser mot OP og AD.

3.3.1. Effekt av 4 forbindelser på OP

For å oppdage om 4 forbindelser har beskyttende effekter mot OP, ble Pre brukt til å etablere OP-sebrafiskmodellen. Utviklingen av osteoblaster ble først undersøkt med alizarin rødfarging for å undersøke den direkte effekten av 4 forbindelser på beindannelse. Sammenlignet med kontrollsebrafisken induserte Pre tilsynelatende en endring i beinmorfologi og bentetthet av sebrafiskhodeskaller i modellgruppen (Figur 8). Nedgang i fargeområdet og IOD i Pre-gruppen og den motsatte trenden i Ed-gruppen viste også visuelt suksessen til OP-modellen. Dessuten ble fargeområdet og 2 IOD av sebrafiskhodeskaller i BSS/GE/QU/AA-grupper betydelig økt sammenlignet med modellgruppen (Figur 9). De typiske markørene for bendannelse og resorpsjon som ALP og TRAP ble analysert for ytterligere å evaluere anti-osteoporose-effekten til de 4 forbindelsene. Som vist i figur 10, reduserte Pre signifikant ALP-aktivitet og økte TRAP-aktivitet i motsetning til kontrollgruppen. Omvendt viste Ed og 4-forbindelser signifikant motsatt trend til Pre-gruppen i ALP- og TRAP-aktivitetene til sebrafisk. Disse resultatene kombinert bekreftet at BSS, QU, GE og AA kan spille positive roller i beindannelse i pre-indusert OP-sebrafisk.

3.3.2. Effekt av 4 forbindelser på AD

For å evaluere de beskyttende effektene mot AD av 4 forbindelser, har den velkjente AlCl3--induserte AD-sebrafiskmodellen blitt brukt. For denne modellen av AD dyskinesi ble atferdsanalysatoren brukt til å spore bevegelsen til sebrafisk. Som vist i figur 11 var AS-en til AlCl3-gruppen betydelig lavere enn for kontrollgruppen, mens for DPZ og alle 4 forbindelsene var AS-ene nær kontrollen. DRR og RE ble oppført i tabell S4. Resultatene viste at ulike konsentrasjoner av GE, BSS, QU og AA økte DRR med 2.37-37.64 prosent , 60.18-103.92 prosent , 70.{{14 }}.61 prosent , 2.37-42.64 prosent , henholdsvis med partiell signifikant (p-verdi < 0.001-0.01).="" ∆s-ene="" i="" en="" kontrollgruppe,="" alcl3-gruppe="" og="" dpz-gruppe="" støttet="" videre="" at="" konstruksjonen="" av="" ad-modellen="" var="" vellykket.="" re="" for="" ge,="" bss,="" qu="" og="" aa="" var="" 13.12-50.45="" prosent="" ,="" 11.41-63.09="" prosent="" ,="" 1.63-66.89="" prosent="" ,="" 13.{{34}="" },09="" prosent,="" henholdsvis.="" disse="" resultatene="" med="" betydelige="" forskjeller="" viste="" at="" ge,="" bss,="" qu="" og="" aa="" kan="" forbedre="" dyskinesi="" hos="" sebrafisk="" til="" en="" viss="" grad.="" bestemmelse="" av="" nerveledningsmarkører="" (ache="" og="" chat)="" aktiviteter="" i="" gruppene="" ble="" vist="" i="" figur="" 12.="" alcl3="" økte="" signifikant="" ache-aktivitet="" og="" reduserte="" chat-aktivitet="" sammenlignet="" med="" kontrollgruppen.="" men="" dpz="" og="" 4-forbindelser="" viste="" evnen="" til="" delvis="" å="" gjenopprette="" endringene="" forårsaket="" av="" alcl3="" i="" ache-="" og="" chat-aktiviteter.="" det="" er="" i="" samsvar="" med="" resultatene="" av="" rehabiliteringseffekt="" dyskinesievaluering.="" som="" konklusjon="" kan="" ge,="" bss,="" qu="" og="" aa="" ha="" potensial="" til="" å="" bli="" fremtredende="">

3.4 Validering av antatte mål

For å verifisere antatte mål som ble spådd i dette arbeidet, ble mål relatert til MAPK og TGF-beta signalveier valgt for qRT-PCR-analyse. Deres relative mRNA-ekspresjonsnivåer i OP-modellen ble vist i figur 13. Sammenlignet med Pre-gruppen økte GE nivåene av mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 og reduserte nivåene av tp53, TNF- , jun, tgfbr1 og c-fos . QU økte nivåene av mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2, og reduserte nivåene av tp53, jun og il1b. BSS viste bare reduserende effekter på tp53, TNF- og mapk3. Som vist i figur 14, i AD-modellen, reduserte GE, QU, BSS og AA mRNA-ekspresjonsnivået til tp53. GE og QU reduserte begge nivåene av TNF-, bmp2, tgfbr1, sp1, tgfb2 og ifn, og økte nivåene av jun, mens GE og AA økte nivåene av mapk3. Bare GE så ut til å reversere økningen av mapk14a, fgfr1b, fgfr1a og igf1ra. Dessuten reduserte QU de høye nivåene av il1b og EGF. De relative mRNA-ekspresjonsnivåene til gener inkludert tp53, TNF-, mapk14a, mapk3, fgfr1b, bmp2, jun, il1b og tgfbr1 endret seg signifikant i motsetning til kontrollgruppen i hver modell. Disse resultatene antydet at de kan tjene som en kobling mellom de to sykdommene. I tillegg antydet disse resultatene også muligheten for synergistiske effekter av 4 forbindelser.

4. Diskusjon

OP og AD er de vanligste kliniske sykdommene forbundet med aldring. Deres komplekse patofysiologiske mekanismer har begrenset effektiv behandling av to sykdommer i årevis. Risikofaktorene for OP og AD viste at den mottakelige gruppen av begge sykdommene er delvis like, slik som eldre kvinner (Abraham et al., 2013; Patel, 2017), diabetikere (Vieira et al., 2018; Xia et al., 2012), langtidsrøykere (Franic og Verdenik, 2018; Zhong et al., 2015) og inaktive individer (Koedijk et al., 2017; Sofi et al., 2011). Videre har nåværende studier identifisert at noen nøkkelproteiner i AD også hadde funksjoner i benmetabolismen (Li et al., 2016; Pan et al., 2018). Det er grunner til å tro at OP og AD ikke er helt uavhengige, til og med har noen potensielle sammenhenger. Dette antydet en potensiell homoterapi for heteropati, som betyr å behandle OP og AD med samme terapi.

På grunnlag av de terapeutiske målene og prinsippene for TCM, kan feiltilpasning i en sykdom klassifiseres i flere "mønstre". Så flere sykdommer som OP og AD kan dele ett "mønster" og bli behandlet av de samme TCM-ene (Jiang, 2005). Som en nyrestyrkende urt er CT mye brukt i OP- og AD-behandling. Moderne studier har gitt noen kompakte bevis på at CT har positive farmakologiske virkninger på skjelettet og nervesystemet. Imidlertid trenger det fortsatt mer detaljerte studier for å avdekke mekanismene til CT.

cistanche og tongkat alihapositive farmakologiske virkningerpåskjelett og nervesystem.

I denne studien, for en klar forståelse av effekten av CT på OP og AD, ble det satt opp en nettverksfarmakologisk tilnærming for å forutsi mulige aktive ingredienser og analysere relaterte veier. Det er forskjellig fra tidligere nettverksfarmakologistudier på CT (Liu et al., 2017). Molekylærnettverket "ett medikament - to sykdommer" ble gjennomført for første gang, i stedet for kun å fokusere på én sykdom. På den ene siden oppdaget integrert nettverksanalyse totalt 22 aktive forbindelser av CT med doble effekter for behandling av både OP og AD. På den annen side ga mønstrene til de to sykdommene støtte for å avsløre koblingene deres. Klassifisert analyse viste at disse aktive forbindelsene kan ha synergistiske effekter på mange biologiske funksjonsmoduler og PhG, flavonoider, terpen og sterol viste bedre effektivitet. For å verifisere gjennomførbarheten og egnetheten til dette utførte nettverket, ble sebrafisk brukt til å konstruere OP- og AD-modeller in vivo og evaluerte effektiviteten til fire forbindelser. Og antatt validering av mål ble brukt for å avsløre deres potensielle synergier. Disse kombinerte studiene i silico og in vivo ga et nytt utgangspunkt for å avsløre den beskyttende effekten av CT på to sykdommer. Det kan gi nye ledetråder til korrelasjonen mellom OP- og AD-patogenese, samt hjelp til fremtidig utvikling av terapeutiske strategier for to sykdommer. Ikke desto mindre trenger metoden fortsatt forbedring og perfeksjon for å fullstendig utforske synergetiske mekanismer for CT for behandling av OP og AD. I denne studien ble bare visse forbindelser valgt for validering. Det er nødvendig å ytterligere verifisere de andre 18 aktive bestanddelene med underliggende mål og veier ved eksperimenter. Og fellestrekkene mellom OP og AD må fortsatt utforskes og oppdages ytterligere, spesielt fra behandlingsperspektivet.

hvor du kan kjøpe cistanche

I vår studie ble BSS, GE, AA og QU bevist å ha beskyttende effekter på OP og AD hos sebrafisk. Mer herlig er at disse verdifulle komponentene også har blitt eksperimentelt validert i annen litteratur og viste farmakologiske aktiviteter i samsvar med det i denne artikkelen (Ayaz et al., 2017; Chauhan et al., 2018; King et al., 2015; Ramnath et al. , 2018; Thummuri et al., 2018; Vargas-Restrepo et al., 2018; Wang et al., 2019; Yuan et al., 2018). Det beviste ytterligere effektiviteten og rasjonaliteten til dette nettverket og indikerte de doble effektene av de resterende 18 forbindelsene. Når det gjelder validering av antatte mål, ble 9 effektive mål bestående av TP53, JUN, TNF, IL1B, MAPK14, MAPK3, FGFR1, BMP2 og TGFBR1 screenet som vanlige mål for OP og AD til slutt. TP53 er en nøkkeltumorundertrykker, og aktiveringen kan indusere neuronal apoptose (Xiao et al., 2019). TP 53, JUN og SP1 er aktive transkripsjonsfaktorer i primær OP (Xie et al., 2015). TNF og IL1B er vanlige inflammatoriske cytokiner med funksjoner for å fremme osteoklastogenese (Geissler et al., 2018) og bentap (Sang et al., 2017). Videre er de begge terapeutiske mål for AD gjennom hemming av nevroinflammasjon for å beskytte nevroner (Liu et al., 2017). TGFB1, TGFB2, TGFBR1 og TGFBR1 har komplekse effekter på nevronal betennelse (Lippa et al., 1998) og osteolyse (Quinn et al., 2001). Benmorfogenetiske proteiner (BMP) er en av faktorene som er involvert i glialdifferensieringen av nevrale stamceller (Kwak et al., 2014). Det oppregulerte uttrykket av BMP2 har vist seg å tjene en viktig rolle i osteoblastdifferensiering (Li et al., 2017). I tillegg til disse eksperimentelt validerte målene, ble de 81 vanlige målene oppført i tabell S2 også forventet å være terapeutiske mål, men har ikke blitt undersøkt eller har hatt foreløpige studier i annen forskning.

Det er spesielt bemerkelsesverdig at disse verdifulle målene alle er relatert til MAPK- og TGF-beta-signalveier basert på KEGG-anrikningsanalysen. MAPK signalvei regulerer celleproliferasjon, differensiering, overlevelse eller apoptose, betennelse og medfødt immunitet. Det har blitt rapportert at den kompromitterte MAPK-signalveien bidro til patologien til nevrodegenerasjon som AD (Kim og Choi, 2015) i tillegg til å hemme osteoblaster direkte (Xiao et al., 2019). Når det gjelder TGF-familiemedlemmer, spilte de forskjellige roller i skjelettet med direkte effekter på beinsvekkelse (Sun et al., 2016), mens aktiveringen av neuronal TGF-beta-signalering øker nevrodegenerative lidelser og AD-lignende sykdom (Tesseur et al. ., 2006). Dermed kan MAPK og TGF-beta signalveier forventes å bli delte mekanismer for å avsløre patogenesen til OP og AD eller bremse progresjonen. I tillegg til de to veiene, regulerte de 22 aktive forbindelsene totalt 66 veier, spesielt veiene med høyest p-verdi, slik som prolaktin-signalveien, FoxO-signalveien og Th17-celledifferensiering vil også være verdt oppmerksomhet og forskning og som nøkkelen til å avdekke sammenhengen mellom OP og AD. Til slutt kan de oppsummerte funnene antyde sammenhengen mellom de to sykdommene i immunsystemet og det endokrine systemet.

5. Konklusjon

I dette arbeidet foreslo vi en nettverksfarmakologisk tilnærming, som kombinerer PCA-analyse, DL-screening, innsamling og prediksjon av flere mål, PPI-nettverkskonstruksjon, samt GO- og KEGG-baneanalyse for å undersøke effektiviteten til CT for behandling av OP og AD. Resultatene våre antydet at de 22 aktive ingrediensene i CT hovedsakelig kan regulere signaltransduksjon, det endokrine systemet, immunsystemet, cellevekst og død for å spille en viktig rolle i behandlingen av OP og AD. For å få en bedre forståelse av mekanismene til CT, ble dette nettverket dypt gravd ut og analysert avhengig av typen forbindelser. Til slutt brukte vi sebrafisk OP- og AD-modeller separat for å identifisere 4 verdifulle forbindelser og relaterte mål, noe som ga en gjennomførbar metode for å koble genomet med farmakodynamikk og finne forbindelser med doble effekter.

Alzheimers nevronsykdomer relatert tilimmunforsvar.

For mer informasjon, vennligst klikk her.