Del 2: Magnesiumutstrømning fra Drosophila Kenyon-celler er kritisk for normal og diettforbedret langtidshukommelse

for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Vennligst klikk henne til del 1

Vennligst klikk henne til del 3

Klikk for åCistanche tubulosa pulver for minne

En rolle for uex i soppkroppene

For å lokalisere uex i hjernen benyttet vi først VT23256-GAL4 transgene fluer, der GAL4 drives av en 853 bp-sekvens fra det første intronet til uex (Kvon et al., 2014). VT23256-drevet UAS-EGFP avslørte begrenset uttrykk i ab KCs med spesielt sterk merke i ab-kjerne (abc) nevroner (figur 3A). Vi brukte også CRISPR for å sette inn en C-terminal HA-epitop-tag i den uex åpne leserammen (Figur 3—Figurtillegg 1A). Disse fluene var levedyktige som homozygoter, noe som indikerer at det resulterende UEX::HA-fusjonsproteinet beholder funksjonen. Immunfargede fluer som huser denne uex:: HA-lokus med et anti-HA-antistoff avslørte fremtredende merking av alle de store KC-klassene i MB, i tillegg til lavere uttrykk i hele hjernen (Figur 3B). Denne uex-ekspresjonsprofilen støttes også av enkeltcellesekvenseringsanalyser (Figur 3 – figurtillegg 1B; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). Gitt den etablerte rollen for ab KCs i olfactory LTM (Pascual og Pre´at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes et al., 2007; Krashes og Waddell, 2008), begrunnet vi at en mnemonisk rolle for UEX kan innebære uttrykk i KCs.

Vi brukte deretter GAL4-rettet ekspresjon av RNAi for å teste om 24 timerhukommelseytelse som kreves uex i MB. Fluer som uttrykker uexRNAi (Perkins et al., 2015) i alle ab KCs (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse et al., 2013) eller bare i abc KCs (NP7175- GAL4; Tanaka et al., 2008) viste normal umiddelbarhukommelsemen betydelig svekket 24-timers hukommelse (figur 3C). I kontrast, uexRNAi-uttrykk i ab overflate (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) eller a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) endret ikke umiddelbar ytelse eller LTM-ytelse vesentlig. Normal 24 timers appetitthukommelseytelse er derfor spesielt følsom for uex-uttrykk i abc-nevroner. For å redusere sannsynligheten for at den uexRNAi-assosierte minnedefekten skyldes en utviklingsmessig konsekvens, begrenset vi også UAS-uexRNAi-uttrykk til voksen alder ved å bruke GAL80ts-mediert tidskontroll (McGuire et al., 2003). Ved permissive 18˚C binder GAL80ts seg til GAL4 og undertrykker dens transkripsjonelle aktivatorfunksjon. Ved restriktiv 30˚C kan ikke GAL80ts lenger binde seg til GAL4, noe som frigjør GAL4 til direkte ekspresjon av UAS-uexRNAi-transgenet. Fluer ble oppdrettet gjennom utvikling ved 18˚C og flyttet til 30˚C etter eclosion. Begrensning av UAS-uexRNAi-uttrykk til ab KCs i voksne fluer ved bruk av c739-GAL4 med GAL80ts ga en lignende 24-timers spesifikkhukommelsedefekt til det som ble observert da UAS-uexRNAi ble uttrykt uten tidskontroll (figur 3D–F). Vi vurderte effekten av UAS-uexRNAi knockdown ved å bruke vårt merkede uex::HA-lokus. Hjerner fra heterozygote uex::HA-fluer som uttrykker uexRNAi i ab og g KCs med MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) ble immunfarget med anti-HA-antistoff. Sammenligning av intensiteten av immunmerking i hjerner fra uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi flyr med det fra uex::HA; MB247-GAL4/ pluss-fluer viste at uexRNAi-ekspresjon betydelig reduserte anti-HA-signalet i ab- og g-KC-ene (figur 3G og H). Dette resultatet demonstrerer effektiviteten til uexRNAi-transgenet og nytten av det CRISPR/Cas9-redigerte uex::HA-lokuset.

Vi testet deretter om uttrykk i spesifikke KC-er av et UAS-uex-transgen kunne gjenopprette 24 timerhukommelsekapasitet til å uexMI01943 flyr.Hukommelseytelsen til uexMI{{10}}1943-fluer som uttrykker UAS-uex i ab og g KCs (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) eller bare ab KCs (c{{5 }}GAL4) ble betydelig forbedret i forhold til uexMI01943-fluer og var statistisk umulig å skille fra kontrollene med et intakt uex-lokus (figur 4A). I kontrast gjenopprettet ikke UAS-uex-uttrykk i a0 b0 , abc eller abs KC-erhukommelseytelse til uexMI01943 fluer, og overuttrykk av uex i ab KCs av villtype fluer økte ikke 24 timers minne (figur 4A og B). Normalt 24 timerhukommelseytelsen kan også gjenopprettes til uexMI01943-fluer hvis UAS-uex-uttrykk var begrenset til c739-GAL4-nevroner (alle ab KCs) i voksen alder ved å bruke GAL80ts-mediert tidskontroll (figur 4C og D). Sammen fastslår disse tap-av-funksjon RNAi og restaureringseksperimenter at UEX spiller en viktig rolle i voksne

Figur 3. Å slå ned uex-uttrykk i ab Kenyon-celler (KCs) svekker LTM. (A) Et uex-promotorfragment-GAL4 styrer GFP-ekspresjon i abc KCs. Anti-GFP immunfarget uex-GAL4 (VT23256); UAS-EGFP linje. (B) Anti-HA-immunfarging av hjerner som huser det CRISPR/Cas9-redigerte uex::HA-lokuset

viser sterk merking av UEX i alle de viktigste underavdelingene av soppkroppen (MB). Skalastaver 20 mm. (C) RNAi knockdown av uex i alle ab (c739- GAL4) eller bare abc (NP7175-GAL4) KCs spesifikt svekket 24 timerhukommelse. abs ({{0}}GAL4) eller a0 b0 (c305a-GAL4) KC-uttrykk hadde ingen effekt (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 for umiddelbar og n=8–14 i 24 timerhukommelse). (D) Defekt LTM ble observert hvis uexRNAi-uttrykk var begrenset til ab KCs av voksne fluer ved bruk av GAL80ts-mediert tidskontroll. (E) LTM-ytelsen ble upåvirket hvis uexRNAi ble holdt undertrykt hele veien og (F) LTM-ytelsen ble gjenopprettet til normale nivåer hvis uttrykket av uexRNAi ble re-undertrykt i 3 dager (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Figurtillegg 1. Konstruksjonsskjema for uex::HA-linjen og tSNE-plottene for uex-uttrykk.

ab KCs. Å finne at abc RNAi knockdown av uex produserer enhukommelsedefekt (figur 3C), men UAS-uex-uttrykk i abc redder ikke uexMI01943-mutantdefekten (figur 4A) antyder at UEX-funksjon i abc-KC-er er avgjørende for appetittfull LTM, mens både abc- og abs-KC-er må ha funksjonell UEX for å støtte LTM. I tillegg gir muligheten til UAS-uex å gjenopprette ytelsen til uexMI0194 flyr ytterligere støtte som uex er ansvarlig forhukommelseverdifall i uexMI01943 fluer.

uex-uttrykk i MB støtter Mg2 pluss -forbedrethukommelse

Vi undersøkte deretter om Mg2 pluss fôring (4 dager med 80 mM MgCl2) kunne forbedreshukommelseytelse i fluer med kompromittert uex-funksjon. Fluer som bærer uexMI01943-allelen (figur 4F) eller de som uttrykker UAS-uexRNAi i ab KCs med c739-GAL4 (figur 4E) viste ikke forbedrethukommelsenår matet med 80 mM MgCl2, sammenlignet med fluer matet med 1 mM MgCl2. Dessuten ble det Mg2 pluss-forbedrede minnet gjenvunnet i uexMI01943 mutante fluer da uex-uttrykk ble gjenopprettet til ab KC-ene (figur 4F). Alle kontrollfluer (c739-GAL4, UAS-uexRNAi og UAS-uex) med uforstyrret uex-uttrykk viste betydelig forbedrethukommelsenår matet med 80 mM sammenlignet med 1 mM MgCl2. Overuttrykk av UAS-uex i ab KCs med c739-GAL4 i fluer med en villtype genetisk bakgrunn verken forbedret vanlige 24 timerhukommelse(Figur 4B), eller det i fluer matet i 4 dager med 40 eller 80 mM MgCl2 (Figur 4G). Vi testet også om 4 dager med 80 mM MgCl2-tilskudd forbedret 24-timers minneytelse etter aversiv avstandstrening. Igjen, denhukommelseav villtype, men ikke uexMI01943 mutante fluer viste forbedring (figur 4 - figur supplement 1). Sammen indikerer disse resultatene at det er optimalthukommelseforbedring med Mg2 pluss fôring krever, og kan støttes fullt ut av, UEX-funksjon i ab KCs.

UEX er en funksjonelt konservert magnesiumtransportør

Gitt den sterke sekvensbevaringen av UEX med pattedyr CNNM2/4 testet vi om CNNM2 funksjonelt kunne erstatte UEX og gjenopprette LTM-defekten til uexMI01943-fluer. Flere punktmutasjoner i CNNM2 er identifisert hos menneskelige pasienter med hypomagnesemi, som er assosiert med hjernemisdannelse og intellektuell funksjonshemming (Arjona et al., 2014). Introduksjon av tilsvarende mutasjoner i muse-CNNM2 (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W og CNNM2E122K) viste at disse pasientavledede lesjonene svekker magnesiumtransport (Arjona et al., 2014). Vi konstruerte fluer som bar villtype og denne mutante varianten UAS-CNNM2 transgener (figur 5A). Farging for en assosiert C-terminal HA-tag avslørte tydelig uttrykk for alle UAS-CNNM2::HA-varianter i ab-neuroner når de ble drevet med c739-GAL4 (Figur 5—Figurtillegg 1). Imidlertid bare uttrykk for villtype CNNM2, og ikke punktmutante former, i ab KCs av uexMI01943

mutante fluer gjenopprettet 24 timerhukommelseytelse (Figur 5B).

Vi testet også om UEX kan formidle Mg2 pluss ekstrudering. UEX uttrykt i HEK293-celler lokalisert til plasmamembranen og celler lastet med Mg2 pluss og Mg2 pluss-indikatoren Magnesium Green viste rask Mg2 pluss utstrømning (figur 5—figur supplement 2 og video 1), sammenlignet med celler transfektert med tom vektor. Mg2 pluss ekstrudering drevet av UEX var merkbart mindre effektiv enn i celler som uttrykker Human CNNM4 (Figur 5—Figur supplement 2), som er kjent for å ha lignende effektivitet som CNNM2 (Hirata et al., 2014). Imidlertid vet vi ikke om UEX- og CNNM4-uttrykk er ekvivalente. Ikke desto mindre definerer demonstrasjon av kryssartskomplementering og Mg2 pluss effluksaktivitet UEX som en funksjonell homolog av pattedyr CNNM2/4.

Figur 4. Redning av LTM-defekten i uexMI01943-fluer. Gjenoppretter uttrykk av UAS-uex i ab og g (MB247-GAL4) eller ab Kenyon-celler (KCs) reddet 24 timerhukommelseytelsen til uexMI01943-fluer, mens uttrykk i abc, abs eller a0 b0 KCs ikke gjorde det (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">hukommelseytelse i villtypefluer (ANOVA, n=8–12). (C) Defekt LTM ble reddet hvis UAS-uex uttrykk var begrenset til ab KCs av voksne fluer ved bruk av GAL80ts mediert tidskontroll (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

i 24 timerhukommelse) men (D) forble defekt hvis UAS-uex-uttrykk ikke ble frigitt. (E)Hukommelseforbedring med diett Mg2 plus støttes av UEX in ab KCs. Minnet til fluer som uttrykker UAS-uexRNAi i ab KCs kan ikke forbedres med Mg2 pluss fôring (t-test, n=8). (F) Minnet til uexMI01943 mutante fluer kan ikke forbedres med Mg2 pluss fôring, men forbedring ble gjenopprettet ved å uttrykke UAS-uex i ab KCs (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Hukommelseble forbedret hvis fluene ble matet med 80 mM MgCl2, men ikke med suboptimal 40 mM MgCl2 (p<0.05, anova,="" n="">

Nettversjonen av denne artikkelen inkluderer følgende figurtillegg for figur 4:

Figur supplement 1. Mg2 pluss fôring av forbedret LTM etter aversiv avstandstrening i villtype, men ikke uexMI01943 mutantfluer.

Et intakt CNBH-domene kreves forhukommelse

Gitt den etablerte rollen for cAMP-signalering ihukommelse-relevant plastisitet hos virvelløse dyr og pattedyr (Kandel, 2012), testet vi viktigheten av CNBH-domenet i UEX. Vi konstruerte fluer som bar et punktmutert CNBH UAS-uexR622K transgen (Figur 6A). Den ekvivalente R622K-aminosyresubstitusjonen opphever cAMP-binding i den regulatoriske underenheten til cAMP-avhengig proteinkinase, PKA (Bubis et al., 1988). Å uttrykke UAS-uexR622K i ab-neuroner med c739-GAL4 gjenopprettet ikke 24-timers minneytelse, eller endret den umiddelbarehukommelseytelse, av uexMI01943 mutante fluer (Figur 6B).

Vi brukte også CRISPR for å forsøke å introdusere R622K-mutasjonen i CNBH til det opprinnelige uex-lokuset (Bassett et al., 2013; Gratz et al., 2013; Yu et al., 2013). Uventet introduserte ikke denne tilnærmingen R622K-substitusjonen, men erstattet i stedet T626 i CNBH med NRR. Tilfeldigvis var fluer homozygote for denne uexT626NRR-allelen levedyktige som voksne, i motsetning til de homozygote for uexD, noe som tyder på at den uexT626NRR-kodede UEX beholder funksjonen. Fluer homozygote for uexT626NRR eller heterozygote uexT626NRR/uexMI01943 fluer viste imidlertid en sterk 24 timershukommelsedefekt (Figur 6C). Umiddelbarhukommelsevar også svekket i homozygote uexT626NRR-fluer, i motsetning til fluer som bærer alle andre kombinasjoner av uex-alleler. i tillegghukommelseav uexT626NRR fluer kunne ikke forbedres med Mg2 pluss fôring (Figur 6D). UexT626NRR-mutasjonen frakobler derfor det essensielle

Figur 5. uex koder for en evolusjonært konservert Mg2 pluss transportør. (A) Modell av CNNM2-proteinstruktur som viser klinisk relevante punktmutasjoner.

Tilpasset og modifisert fra Arjona et al., 2014. (B) Overekspresjon av villtype, men ikke mutant, CNNM2 i ab Kenyon-celler redderhukommelsedefekt av uexMI01943 mutante fluer (s<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Nettversjonen av denne artikkelen inkluderer følgende figurtillegg for figur 5:

Figur supplement 1. Transgen ekspresjon av mutante varianter av CNNM2.

Figur supplement 2. UEX-avhengig Mg2 pluss effluks i HEK293 celler.

rolle for uex fra en funksjon ihukommelseog foreslår at syklisk nukleotidregulert aktivitet er avgjørende for at UEX skal støtte normal og Mg2 pluss-forsterkethukommelse. Selv om vi bekreftet ved bruk av western blotting at et protein i full lengde kommer til uttrykk i uexT622NRR-fluer (figur 6E), tillot ikke antistoffet vårt oss å verifisere at UEXT626NRR-proteinet lokaliserer seg riktig i hjernen. Ytterligere arbeid er derfor nødvendig for å karakterisere den cellulære lokaliseringen, cAMP-bindingen og Mg2 pluss transportfunksjonen til proteinet kodet av denne serendipitøse uexT626NRR-allelen.

Kronisk cAMP-manipulasjon endrer UEX-lokalisering i KC-er

Vi testet om cAMP akutt kunne endre UEX-aktivitet ved å bruke forskolin på UEX-uttrykkende HEK293-celler. Imidlertid ble ingen åpenbar endring i den UEX-avhengige Mg2 pluss effluksdynamikken observert (data ikke vist). Vi testet derfor om KC-uttrykk av UEX:: HA ble endret i fluer med kroniske endringer av

cAMP-metabolisme, ved å introdusere læringsrelevante mutasjoner i den rutabaga-kodede Ca2 plus-stimulerte adenylatsyklasen, eller den dunce-kodede cAMP-spesifikke fosfodiesterase. Anti-HA immunfarging av hjerner fra rut2080; uex::HA og dnc1; uex::HA-fluer avslørte en slående endring i UEX-lokalisering (figur 7A og B og video 2–4). Mens UEX::HA vanligvis påvises i lappene til alle KC-er på et omtrent ekvivalent nivå i villtypefluer, var merkingen lavere i MB g-lappen og mer uttalt i abc-KC-ene i rut2080 og dnc1-mutantbakgrunn (figur 7C) , selv om det generelle MB-uttrykket av UEX::HA er likt mellom villtype- og mutantfluer (figur 7D). I tillegg avslørte ikke western blot-analyser av protein ekstrahert fra hodene til disse fluene en signifikant forskjell i generelle UEX::HA-ekspresjonsnivåer (data ikke vist). Disse dataene stemmer derfor overens med cAMP som regulerer UEX-funksjonen og kanskje dens cellulære lokalisering i KC-er.

UEX er nødvendig for å opprettholde en fluktuerende [Mg2 pluss ]i i ab KCs

Selv om MagFRET kan rapportere [Mg2 pluss], reagerer den ikke raskt nok til å registrere stimulus-fremkalte signaler. Vi konstruerte derfor fluer som inneholder UAS-transgener for to nyere genetisk kodede Mg2 pluss-sensorer, MagIC (ikke-FRET-basert; Koldenkova et al., 2015) og MARIO (FRET-basert; Maeshima et al., 2018). Vi klarte ikke å oppdage UAS-MARIO-uttrykk i fluehjernen og kunne derfor bare bruke UAS-MagIC. MagIC ble rapportert å reagere sterkest på Mg2 pluss, men også i mindre grad på Ca2 pluss (Koldenkova et al., 2015). Vi verifiserte derfor først spesifisiteten til MagIC-responser i et cellepermeabilisert ex vivo-fluehjernepreparat. Hjerner ble fjernet fra fluer som uttrykker UAS-MagIC i ab KCs med c739-GAL4 (Figur 8A), inkubert i en skål med saltvann (Barnstedt et al., 2016) og endringer i fluorescens ble overvåket før og etter badpåføring - sjon av kjemikalier. Mens påføring av MgCl2 fremkalte en doseavhengig økning i MagIC-responsen, ga chelering av Mg2 pluss med EDTA en doseavhengig reduksjon (Figur 8B og Video 5 og 6). Til sammenligning registrerte CaCl2 bare en liten økning ved de høyeste konsentrasjonene, mens den mer Ca2 pluss-selektive chelatoren EGTA hadde liten effekt (Figur 8B). Disse resultatene viser at UAS-MagIC kan overvåke [Mg2 pluss]i i ab KCs i fluehjernen.

Økning av intracellulær cAMP har vist seg å fremkalle Mg2 pluss fluks fra pattedyrceller (Romani og Scarpa, 2000; Vormann og Gu¨nther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani og Scarpa, 1990b; Romani og Scarpa, 1990a; Gu¨nther, 1987; Gu¨nther et al., 1990; Howarth et al., 1994). Siden våre eksperimenter også indikerte at cAMP kan regulere UEX, testet vi deretter om stimulering av cAMP-syntese med forskolin (FSK) kan endre MagIC-signaler i ab

Figur 6. Det sykliske nukleotidbindende homologi (CNBH) domenet til UEX er nødvendig for minne. (A) Skjematisk som viser sekvensdetaljer av CNBH-domenet i UEX, og aminosyreendringene gjort i uexR622K og uexT626NRR. (B) Å uttrykke et UAS-uexR622K-transgen i ab Kenyon-celler reddet ikke LTM-defekten til uexMI01943 mutante fluer (s.<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Figur 6 fortsetter

(D) Dietary Mg2 plus forbedret ikke hukommelsen til homozygote uexT626NRR/uexT626NRR fluer (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. For disse eksperimentene brukte vi igjen et ex vivo hjernepreparat, men denne gangen ble ikke cellene permeabilisert. 30 mM FSK har vist seg å fremkalle en toppøkning i cAMP i KC-er som tilnærmer seg det som ble observert etter appetittbehandling (Louis et al., 2018). Påføring av 30 mM FSK til c739-GAL4; UAS-MagIC-hjerner fremkalte en konsekvent dynamikk i MagIC-fluorescens. Etter en kraftig innledende økning, avtok responsene sakte tilbake mot grunnlinjen før de igjen steg sakte til et punkt der signalet begynte å svinge. (Figur 8C og D og video 7). Nøkkelsignaturene til denne responsen ble bare registrert i det Mg2 pluss-sensitive Venus-signalet (Figur 8D). I motsetning til dette svingte ikke mCherry-fluorescensen, men avtok jevnt over tidsforløpet til opptaket (sannsynligvis et resultat av fotobleking), noe som demonstrerer at fluktuasjonen i Venus-signalet ikke er en bevegelsesartefakt (Figur 8E). Det er viktig at FSK-induserte MagIC-responser var større enn de etter påføring av saltvann (figur 8 - figur supplement 1A). Imidlertid utviklet en fluktuerende respons også etter påføring av saltvann (figur 8—figur supplement 1B) som antyder at det rytmiske MagIC-signalet kan være en generell respons på en økning i [Mg2 pluss]i som følger cellulær forstyrrelse.

Drosophila MB har tidligere blitt rapportert å vise en langsom (0.004 Hz) Ca2 pluss oscillasjon i ex vivo hjerner, mens en mye raskere 20 Hz oscillasjon fremkalles av lukt i gresshoppen MB (Laurent og Naraghi, 1994; Rosay et al., 2001). Selv om vår første karakterisering av MagIC i fluehjernen indikerte en foretrukket respons på Mg2 pluss (Figur 8B), testet vi likevel eksplisitt om FSK induserte fluktuasjon av [Ca2 pluss]i av ab KCs, ved å bruke uttrykk av UAS-GCaMP6f (Chen et al., 2013). FSK induserte en forsinket økning i GCaMP-responsen, men ingen tydelig oscillerende aktivitet ble observert (Figur 8 – figurtillegg 1C–E).

Til slutt testet vi om de observerte MagIC-responsene var følsomme for statusen til uex-genet. Vi genererte uexMI01943-fluer som også inneholdt c379-GAL4 og UAS-MagIC og sammenlignet deres FSK- og saltvann-induserte MagIC-responser med fluer med et villtype uex-lokus. UexMI01943-mutantfluene viste en økt FSK-respons på den fra villtypefluer, mens saltvannsfremkalte responser ikke kunne skilles fra hverandre (figur 8F og G). Svar fremkalt av den inaktive FSK-analogen, ddFSK, var også ufølsomme for statusen til uex (Figur 8—Figurtillegg 1F). Mutasjon av uex øker derfor selektivt gjennomsnittlige FSK-fremkalte MagIC-responser.

Vi la også merke til at MagIC-spor fra uex-mutante fluer ikke viste et svingende signal (Figur 8H og Figur 8—Figurtillegg 1G). For å kvantifisere denne forskjellen beregnet vi gjennomsnittlig kraftspektraltetthet (PSD) av spor fra uexMI01943 og villtypefluer behandlet med FSK eller saltvann. I begge forholdene ble gjennomsnittlig PSD signifikant forskjøvet til venstre mot lavere frekvenser i uexMI01943-mutantene sammenlignet med villtypekontrollene (figur 8I). Villtype fluehjerner hadde betydelig mer oscillerende aktivitet sentrert rundt 0,015 Hz enn de fra uexMI01943-mutanter. Disse dataene tyder derfor på at UEX er nødvendig for langsom rytmisk vedlikehold av KC [Mg2 pluss]i. Viktigere, å finne at MagIC-signaler er forhøyet og endret i uex-mutanter bekrefter at de observerte MagIC-responsene er Mg2 pluss-avhengige. Videre antyder de at KC uttrykte UEX-grenser Mg2 pluss akkumulering, i samsvar med en rolle i ekstrudering.

Diskusjon

Vi observerte en forbedring av olfaktorisk LTM-ytelse når fluer ble matet i 4 dager før trening med mat supplert med 80 mM [Mg2 pluss]. Dette resultatet ligner det som ble rapportert hos rotter, selv om lengre perioder med fôring var nødvendig for å heve hjernen [Mg2 pluss] til minneforbedrende nivåer (Slutsky et al., 2010). En forskjell i optimal fôringstid kan reflektere størrelsen på dyret og kanskje den større biotilgjengeligheten av kosttilskudd Mg2 pluss i Drosophila. Mens Mg2 pluss -L-treonat (MgT) var et mer effektivt middel for å levere Mg2 pluss enn magnesiumklorid hos rotter (Slutsky et al., 2010), observerte vi en lignende forbedring av minneytelsen når fluer ble matet med magnesiumklorid magnesiumsulfat eller MgT (data ikke vist).

Figur 7. Kenyon celle (KC) uex uttrykk er endret i rutabaga og dunce mutant fluer. (A) Anti-HA-fargede hjerner avslører UEX::HA-proteinlokalisering er endret i rut2080; uex::HA og dnc1; uex::HA fluer, blir mer fremtredende i abc KCs (piler). Skalastaver 20 mm. (B) Forstørrede bilder av sopplegemene (MBs) som fremhever abc KC-uttrykk i rut2080 og dnc1 mutantfluer, sammenlignet med villtype uex::HA-fluer. Skalastaver 20 mm. (C) Kvantifisering av fluorescensintensitet. Til venstre, mikrofotografi med en målelinje gjennom a-lappspissen og rektangulære ROI-er for g-loben og et kontrollområde. Mellomste, relative fluorescensintensitetsprofiler over lappspissen viser betydelig høyere signal i rut2080 og dnc1 mutantfluer i senterregionen okkupert av ab-kjerne-KC-ene (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Heving av [Mg2 pluss]e i rottehjernen fører til en kompenserende oppregulering av uttrykket av NR2B-underenheten til NMDAR og derfor en økning i andelen postsynaptiske NR2B-holdige NMDARer. Denne klassen av NMDAR-er har en lengre åpningstid (Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005), noe som tyder på at denne bryteren i underenhetssammensetning representerer en homeostatisk plastisitetsmekanisme (Turrigiano, 2008) for å imøtekomme den økte NMDAR-blokken pålagt av økende [Mg2 pluss ]e. Dessuten kan overuttrykk av NR2B i museforhjernen forbedre synaptisk tilrettelegging og læring oghukommelseytelse (Tang et al., 1999), som støtter en økning i NR2B som en viktig faktor i Mg2 pluss-forbedrethukommelse. Men selv i den originale in vitro-studien av Mg2 pluss-forbedret synaptisk plastisitet (Slutsky et al., 2004), ble det bemerket at NMDAR-strømmer var utilstrekkelige til å forklare de observerte endringene fullt ut.

Våre NMDAR underenhet tap av funksjon studier i Drosophila KCs svekket ikke vanlig eller Mg2 pluss-forbedrethukommelse. Videre oppdaget vi ikke en åpenbar endring i nivåene av hjerneomfattende ekspresjon av glutamatreseptorunderenheter i Mg2 pluss-matede fluer. Selv om NMDAR-aktivitet tidligere har vært implisert i Drosophila olfactoryhukommelse, ble effektene for det meste tilskrevet funksjon utenfor MB (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). I tillegg endret ikke overuttrykk av Nmdar1 i alle nevroner, eller spesifikt i alle KC-er, STM eller LTM. Ektopisk overekspresjon i MB av en NMDARN631Q-versjon, som ikke kan blokkeres av Mg2 plus, svekket LTM (Miyashita et al., 2012). Imidlertid tillater denne mutasjonen ligand-gated Ca2 pluss-inngang, uten behov for korrelert nevronal depolarisering, noe som kan forstyrre KC-funksjonen på uventede måter. Det er kanskje mest bemerkelsesverdig at læringsrelevant synaptisk depresjon i MB kan drives av dopaminerge undervisningssignaler levert til kolinerge utgangssynapser fra luktresponsive KC-er til spesifikke MBON-er (Claridge-Chang et al., 2009; Aso et al., 2012 ; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Owald et al., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Owald og Waddell, 2015; Handler et al., 2019). Det er tenkelig at KC-er mottar glutamat, fra en kilde som ennå ikke er identifisert, men det er foreløpig ingen åpenbar plass i MB-nettverket for NMDAR-avhengig plastisitet. Bevis tyder derfor på at normal og Mg2 pluss-forsterket Drosophila LTM er uavhengig av NMDAR-signalering i KC. I tillegg indikerer våre MagFRET-målinger at Mg2 pluss fôring også øker [Mg2 pluss ]i av ab KCs med ca.

omtrent 50 mM.

Vi identifiserte en rolle for uex, enkeltflueortologen til den evolusjonært konserverte familien av CNNM-type Mg2 pluss efflukstransportører (Ishii et al., 2016). Det er fire distinkte CNNM-gener i mus og mennesker, fem i C. elegans, og to i sebrafisk (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Uex-lokuset produserer fire alternativt spleisede mRNA-transkripter, men alle koder for det samme 834 aa-proteinet. Den nøyaktige rollen til CNNM-proteiner i Mg2 pluss-transport er noe omstridt (Funato et al., 2018a; Arjona og de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime´nez-Mascarell et al., 2019). Noen foreslår at CNNM-proteiner er direkte Mg2 pluss transportører, mens andre favoriserer at de fungerer som sensorer for intracellulær Mg2 pluss konsentrasjon [Mg2 pluss]i og/eller regulatorer av andre Mg2 pluss transportører. Vi fant at ektopisk ekspresjon av Drosophila UEX øker Mg2 pluss efflux i HEK293-celler og at endogen UEX begrenser [Mg2 pluss]i i ab KCs i fluehjernen. Derfor, hvis UEX ikke i seg selv er en Mg2 pluss transportør, må det være det

i stand til å samhandle effektivt med humane Mg2 pluss efflukstransportører og å påvirke Mg2 pluss ekstrudering i Drosophila. Siden UEX er det eneste CNNM-proteinet i fluen, kan det tjene alle rollene til de fire individuelle pattedyr-CNNMene. Men evnen til musen CNNM2 til å gjenopprettehukommelsekapasitet til å uex mutante fluer antyder athukommelse-relevant UEX-funksjon kan erstattes av CNNM2.

Interessant nok var ingen av de sykdomsrelevante variantene av CNNM2 i stand til å utfyllehukommelsedefekt av uex mutante fluer. CNNM2 T568I-varianten erstatter en enkelt aminosyre i det andre CBS-domenet (Arjona et al., 2014). De onkogene proteintyrosinfosfatasene fra PRL-familien (fosfatase av regenererende lever) binder seg til CBS-domenene til CNNM2 og CNNM3 og kan hemme deres Mg2 pluss transportfunksjon (Hardy et al., 2015; Gime´nez-Mascarell et al., 2017. ; Zhang et al., 2017). Det vil derfor være av interesse å teste rollen til UEX CBS-domenene og om fly PRL{10}} regulerer UEX-aktivitet.

RNA-seq-analyse avslører at uex er sterkt uttrykt i larve og voksne flues fordøyelseskanal og nervesystem, så vel som eggstokkene (Gelbart og Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018) noe som tyder på at mange uex-mutasjoner vil være pleiotrope. Vår uexD-allel, som sletter 272 aminosyrer (inkludert en del av den andre CBS og hele CNBH-domenet) fra UEX C-terminalen, resulterer i utviklingsdødelighet når den er homozygot, noe som viser at uex er et essensielt gen. Pattedyr CNNM4 er lokalisert til den basolaterale membranen til intestinale epitelceller (Yamazaki et al., 2013). Der antas det å fungere i transcellulær Mg2 pluss-transport ved å bytte ut intracellulær Mg2 pluss med ekstracellulær Na pluss etter apikal inngang gjennom TRPM7-kanaler. Dødelighet i Drosophila kan derfor oppstå fra manglende evne til å absorbere tilstrekkelig Mg2 pluss gjennom larvetarmen. Nevronalt begrenset uttrykk av uexRNAi med elav-GAL4 resulterer imidlertid også i larvedødelighet (data ikke vist), noe som tyder på at UEX har en ekstra rolle i tidlig utvikling av nervesystemet, som CNNM2 hos mennesker og sebrafisk (Arjona et al., 2014; Accogli et al., 2019). Kanskje overraskende, fluer som bærer homozygote eller trans-heterozygote kombinasjoner av flere hypomorfe uex-alleler har defekt appetitt og aversivehukommelseytelse, men de virker ellers upåvirket.

Genmanipulering av uex-lokuset for å legge til en C-terminal HA-tag til UEX-proteinet tillot oss å lokalisere uttrykket i hjernen. Merking er spesielt fremtredende i alle hovedklasser av KC-er. Begrensning av knockdown av uex-uttrykk til alle ab KC-er av voksne fluer, eller til og med bare abc-undergruppen, reproduserte LTM-defekten. LTM-svekkelsen var tydelig hvis uexRNAi-ekspresjon i ab-nevroner

Figur 8. UEX begrenser en økning i [Mg2 pluss]i og støtter en langsom oscillasjon i ab Kenyon-celler (KCs). (A) Ekplantat fluehjerne som uttrykker UAS-MagIC drevet av c739-GAL4. Øvre panel, fasekontrastvisning med vidfelt; midtpaneler, fluorescerende utsikt over Venus og mCherry-kanaler; nedre panel, en konfokal seksjon på nivå med KC-somata som viser Venus- og mCherry-kanaler. Skalastaver 20 mm. (B) MagIC reagerer selektivt på endringer i [Mg2 pluss]i i KCs. Spor av MagIC-forhold etter badpåføring av 10, 20 eller 40 mM MgCl2 eller CaCl2; 5, 10 eller 20 mM EDTA eller EGTA. (C) Representativt spor av figur 8 fortsatte på neste - figur 8 fortsatte

MagIC ratio etter påføring av FSK viser en innledende bølge etterfulgt av en gradvis økning og utvikling av en langsom oscillasjon. (D) De primære responsene skyldes endringer i det Mg2 pluss-sensitive Venus-signalet. (E) mCherry-signalet viser en jevn nedgang. (F) FSK-fremkalte MagIC-responser er større i uex-mutante fluer. Gjennomsnittlige MagIC-svar viser at FSK induserte en betydelig større økning i uexMI01943-mutant enn i villtypefluer. (G). Gjennomsnittlige saltvannsfremkalte MagIC-responser ble ikke signifikant endret i uex-mutante fluer. (H) Individuelle Venus (grønn) og mCherry (rød) kanalspor viser at den langsomme oscillasjonen bare er tydelig i Venus-kanalen til villtype, men ikke uex mutant, fluer. (I) Power Spectral Density (PSD) analyse av tidsserien fra 200 til 900 s av alle data viser at spor fra villtypefluer har betydelig mer oscillerende aktivitet, sentrert rundt 0,015 Hz, enn spor fra uex mutantfluer.

Nettversjonen av denne artikkelen inkluderer følgende figurtillegg for figur 8:

Figurtillegg 1. Individuelle spor for MagIC- og GCaMP-avbildning.