Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vennligst klikk her til del 1

Cistanche urt har en meget god nevrobeskyttende effekt

2.6. Anti-apoptotiske effekter av cytokininer bestemt av kaspase-3/7 aktivitetsmålinger

Som vist av PI-fargingsanalysene beskrevet ovenfor, induserte SAL økninger i SH-SY5Y-cellenes dødsrater. Siden SAL er assosiert med både apoptose og nekrose [51] undersøkte vi også aktiveringen av caspase-3 og 7 (casp-3/7) som en spesifikk markør for apoptose (utførelsesfasen) [52] etter å ha eksponert cellene for CK. Caspase-3/7 aktiviteter registrert etter behandling med hver av testforbindelsene ble normalisert med hensyn til de som ble registrert etter behandling med 50{{30}} uM SAL (sett til 100 prosent ). Som vist i figur 4, hemmet den velkjente kaspasehemmeren Ac-DEVD-CHO (inkludert som en spesifikk, apoptoserelatert kontroll) kraftig kaspase-3/7-aktivitet ved submikromolare konsentrasjoner (til 36,3 ± 2,66 og 25,2) ± 2,69 prosent av nivåene i celler behandlet med SAL alene ved henholdsvis 0,05 og 0,5 uM). Lignende nivåer av hemming har tidligere blitt observert [53] i forskjellige in vitro SH-SY5Y cellebaserte modeller for nevrodegenerasjon. Den positive kontrollen NAC reduserte også kaspase-3/7-aktiviteten signifikant, til 88,7 ± 1,87 prosent og 78,5 ± 2,56 prosent av SAL-induserte nivåer ved henholdsvis 100 uM og 1000 uM. De testede CK-ene hadde et bredt spekter av effekter på caspase-3/7-aktiviteter. Interessant nok fra CK-ribosidene var det bare cZR som hadde signifikante effekter på aktivitetene ved 0,1 uM (reduserte dem til henholdsvis 83,3 ± 4,33 prosent av SAL-induserte nivåer), mens iPR ved 1 uM ikke ga signifikant reduksjon av casp{{60} ,7. Til slutt reduserte K3G caspase-3/7-aktivitet med maksimal effekt ved 10 uM (til 81,7 ± 4,31 prosent av det SAL-induserte nivået). Totalt sett induserte SAL en 1.6- ganger økning i kaspase-3/7-aktivitet sammenlignet med friske kontrollceller (CTR, figur 4), i samsvar med resultatene fra en tidligere studie, der en lignende SAL-konsentrasjon (400 uM) og samme cellelinje ble brukt [54]. NAC er kjent for å påvirke caspase-3/7-aktivitet i flere modeller avnevronaldød [55–58]. Resultatene presentert her gir imidlertid den første demonstrasjonen av deres kaspase-3/7 i en SH-SY5Y cellebasert SAL-indusert modell avnevronaldød. Den positive kontrollen reduserte kaspase-3/7-aktiviteten indusert av 500 uM SAL på lignende måte som CK-er, men cZR og K3G var effektive selv ved submikromolare eller mikromolare konsentrasjoner. Andre studier med stressmodeller assosiert med PD (proteasomhemmer MG 132- eller H2O2-indusert toksisitet i SH-SY5Y-celler [17] og fibroblaster [15]) og Huntingtons sykdom (serumsultmodell i PC12-celler [19]) har også vist at CK-ene K og tZR kan ha anti-apoptotiske (caspase-3) aktiviteter [17], og at både K og tZR kan ha anti-senescens-aktiviteter [17,19] . Dessuten er assosiasjoner mellom avtagende casp-3,7 aktivering ognevrobeskyttendeaktivitet ble rapportert for SAL og SAL-relaterte modeller [54,59,60].

Figur 4. Caspase-3/7-aktivitet i den SAL-induserte modellen av PD. Treplikater på minst fire uavhengige dager. * P sammenlignet med kjøretøyet med 500 uM SAL, # P sammenlignet med kjøretøyet uten 500 uM SAL.

2.7. Identifikasjon av cytokinin nevroprotektiv aktivitet i den glutamatinduserte celledødsmodellen

Siden SH-SY5Y-celler ikke uttrykker alle NMDA-reseptorunderenheter [61], er den mest sannsynlige mekanismen for glutamat (Glu) toksisitet blokkering av cystin/glutamat Xc-antiporteren med massiv induksjon av oksidativt stress [62]. Tidligere forfattere har allerede vist en sammenheng mellom glutamatindusert celledød og nekroptose i SH-SY5Y-celler [63], og viktigheten av caspase-3-aktivering i glutamatindusert toksisitet overfor dem [62,64]. Flere studier har også vist forekomsten av jerndrevet celledød (ferroptose) etter glutamatforgiftning [62,65,66], og indikerte forekomsten av tre typer celledød (nekroptose, apoptose og ferroptose) etter blokkering av Xc. -antiporter system. For å fullføre en omfattende evaluering avnevrobeskyttendepotensialet til de testedecytokininer, ble det glutamatinduserte celledødsanalysesystemet inkludert i et analytisk panel med det kjentenevrobeskyttendejernkelator deferoksamin (DFO) og hemmer av nekroptose nekrostatin-1 (NEC-1) [67] som positive kontroller. Her ble SH-SY5Y-celler differensiert i 48 timer, deretter behandlet med 160 mM Glu eller i samtidig behandling med forskjelligcytokininkonsentrasjoner ({{0}}.1–10 uM) i 24 timer og farget med PI. I denne modellen var effekten av Glu på celledød 100 prosent PI-signal, så reduksjonen i celledød med testforbindelsene ble evaluert. Glu induserte nesten en 4- ganger økning i celledød sammenlignet med friske SH-SY5Y-kontroller (26,1 ± 0,42 prosent). Screening av positive kontroller ogcytokinineravslørte at både positive kontroller NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 prosent) og DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 prosent) reduserte celledøden indusert av glutamat. Som vist i figur 5A, fra panelet tilcytokininer, bare trecytokininerklarte å beskyttenevron-lignende SH-SY5Y-celler på lignende måte som positive kontroller. Den mest aktivecytokininervar trans-zeatin (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 prosent; 1 uM, 81,3 ± 2,77 prosent) og cis-zeatin (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29 prosent ; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 prosent ) og kinetin (K) (1 uM, 88,0 ± 3,76 prosent ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 prosent). For å bekrefte deres lovende aktivitet, ble en ortogonal analyse brukt for å belyse mer detaljert CKs biologiske effekter i denne modellen: En laktatdehydrogenase (LDH)-frigjøringsanalyse [68], som også viste en dramatisk (4-fold) økning i toksisitet etter Glu-behandling. Interessant nok tillot bestemmelsen av LDH-frigjøring oss å skille mellom aktivitetene til CK-er og de positive kontrollene (NEC-1 og DFO). CK-ene hadde moderat, men signifikant beskyttende aktivitet (tZ reduserte dødsratene til 91,9 ± 1,40 prosent ved 0,1 uM; cZ reduserte dem til 92,3 ± 1,15 prosent ved 0,1 uM og 91,7 prosent ± 1,56 prosent ved 1 uM; K2 reduserte dem til 92,3 ± 1,15 prosent ved 0,1 uM og 91,7 prosent ± 1,56 prosent ved 1 uM; 1,06 prosent ved 1 uM). De positive kontrollene NEC-1 og DFO hadde sterkere beskyttende effekter, men var effektive ved mye høyere konsentrasjoner (reduserte frekvensene til 76,9 ± 2,94 prosent og 81,6 ± 3,74 prosent ved henholdsvis 50 og 10 uM) (Figur 5B). LDH-analysen validerte indikasjonene oppnådd med PI-farging og de observerte effektene av de positive kontrollene var i samsvar med publiserte data [69,70]. Funn angående effekter av K i den Glu-induserte celledødsmodellen i HT22-celler [18] og våre observasjoner av effekter av representative CK-er som tZ, cZ og K viser at CK-er er lovende kandidater for behandling av nevrodegenerative sykdommer assosiert med oksidativt stress [ 71]. Til slutt ble tZ og cZ foretrukket fordi de var effektive ved lavere konsentrasjoner og ble valgt sammen med K for videre studier av deres effekter på nivåer av oksidativt stress og kaspase-3,7-aktivering.

cistancheanmeldelserpå virkningene avnevrobeskyttelse

2.8. Effekter av cytokininer på glu-indusert oksidativt stress i SH-SY5Y-celler

I motsetning til den forrige modellen, kan Glu indusere oksidativt stress i SH-SY5Y-celler ved forskjellige veier. Den ene er basert på blokkering av Cystin/glutamat (Xc-) antiporter, som fører til glutation (GSH) utarming og negative effekter på superoksiddismutase (SOD) aktivitet [62]. Glu-mediert celledød involverer også antatt Rac-NADPH-oksidase-drevet ROS (spesielt superoksidradikal) dannelse i SH-SY5Y-celler [72]. Disse funnene indikerer at den primære årsaken til celledød i den Glu-induserte modellen er OS. Innenfor modellen,nevron-lignende celler ble behandlet med Glu og testede forbindelser, farget med DHE og observert ved fluorescensmikroskopi. Som det kan sees i figur 6A, ble det observert en dramatisk økning i rød DHE-fluorescens i Glu-behandlede celler, som ble forbedret av de positive kontrollstoffene og testede CK-er. Basert på mikroskopiobservasjonen ble kvantifiseringen av superoksidnivåer utført i Glu-induserte celler på lignende måte, ved DHE-analysen, som de i SAL-induserte celler. Resultatene ble normalisert med hensyn til nivåer indusert av Glu alene (sett til 100 prosent ), noe som forårsaket en dramatisk, nesten 3-dobling av superoksidnivåer innen bare 4 timer inevron-lignende SH-SY5Y-celler i forhold til nivåer i friske kontrollceller (CTR: 33,79 ± 1,45 prosent). Som vist i figur 6B, reduserte CK-er som tZ, cZ og K superoksidnivået i glu-berusede celler signifikant: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM, og 10 uM K reduserte det til 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 og 83,8 ± 2,32 prosent av nivåene i celler behandlet med Glu alene. Disse nivåene er sammenlignbare med de oppnådd med nekroptosehemmeren NEC-1 (80,5 ± 3,19 prosent ved 5 uM og 80,4 ± 2,70 prosent ved 50 uM) og jernchelator DFO (80,2 ± 3,80 prosent ved 10 uM). Resultatene oppnådd med den Glu-induserte celledødsmodellen, spesielt effekten av positive kontroller, er i samsvar med tidligere rapporter [70,73]. Tidligere bevis på at CK-er har OS-reduserende effekter i Glu-induserte eller lignende modeller er begrenset til en demonstrasjon av at K er et potent OS-reduserende middel (ved omtrent 23 uM) i den HT22-cellebaserte Glu-induserte celledødsmodellen [18 ]. Vi fant at K hadde en OS-reduserende effekt ved lavere konsentrasjoner (1–10 uM) i SH-SY5Y-cellene våre. I tillegg har gunstige langsiktige effekter av tZ på humane fibroblaster, inkludert hydrogenperoksid-nedbrytende aktivitet, blitt observert [15], noe som tyder på at tZ og cZ kan ha indirekte OS-reduserende effekter i Glu-induserte celledødsmodeller. I tillegg påpekte andre rapporter assosiasjonene mellom CKs-mediert OS-reduserende effekt og beskyttende aktivitet [22,74–76]. Til sammen viste tZ, cZ og K overraskende sterke OS-reduserende effekter, sammenlignbare med positive kontroller, til tross for ulike styrker totalt settnevrobeskyttendeeffekt.

Figur 5. (A) Dødsrate pånevron-lignende SH-SY5Y-celler i glutamat (Glu)-indusert modell for celledød; (B) Glu-indusert toksisitet (LDH-frigjøring) avnevron-lignende SH-SY5Y-celler. Treplikater i løpet av minst tre uavhengige dager.* P sammenlignet med bæreren med 160 uM Glu, # P sammenlignet med bæreren uten 160 uM Glu.

Figur 6. (A) Glu-indusert oksidativt stress (OS) og OS-reduserende aktivitet av indikerte forbindelser hos menneskernevron-lignende SH-SY5Y-celler visualisert ved fluorescensmikroskopi etter merking av dihydroetidium (DHE). Barer=50 um. Bilder visernevron-lignende SH-SY5Y-celler behandlet med DMSO (kontroll), 160 mM glutamat (Glu) alene, og sammen med: 10 uM deferoksamin (pluss DFO), 50 uM nekrostatin{{6} } (pluss NEC-1), 0,1 uM tZ (pluss tZ) og 0,1 uM cZ (pluss cZ) i 4 timer, deretter farget med DHE. (B) Glu-indusert superoksidradikaldannelse inevron-lignende SH-SY5Y-celler etter 4 timer. Grafen viser kvantifiseringen av DHE-fargede celler ved hjelp av Infinite M200 Pro mikroplateleser (Tecan, Østerrike). Treplikater på fem uavhengige dager.

* P sammenlignet med kjøretøyet med 160 uM Glu, # P sammenlignet med kjøretøyet uten 160 uM Glu.

2.9. Effekter av cytokininer på kaspase-3/7-aktivitet i den glu-induserte celledødsmodellen

Glu har lignende toksiske effekter på SH-SY5Y-celler som tidligere rapporterte effekter på HT22-celler assosiert med Xc-antiporter-blokkering. Således er ikke-apoptotiske celledødsmekanismer (ferroptose, nekroptose, etc.) involvert i begge tilfeller [62] selv om ekspresjon av caspase-3 og til en viss grad NMDA-underenheten til NR1 kan forekomme sterkere i SH -SY5Y-celler [61]. Derfor kan sluttstadier av celledød i de to cellelinjene være forskjellige. En medvirkende rolle av kaspase-3-aktivitet har blitt observert i mange studier i den Glu-induserte modellen for celledød av SH-SY5Y-celler [62,77–79]. I denne analysen,nevron-lignende SH-SY5Y-celler ble behandlet her med 160 mM Glu, noe som fører til økning av caspase-3/7-aktivitet. I forsøk på å belyse rollen til apoptose i Glu-indusert død av SH-SY5Y-celler, ble en spesifikk caspase-3/7-hemmer, Ac-DEVD-CHO, brukt og funnet å ha en sterk hemmende effekt: Ved 50 nM det reduserte kaspase-3,7-aktiviteten til 23,70 ± 1,01 prosent av nivået i behandlede celler

med Glu alene og ved 0.5 uM blokkerte den aktiviteten nesten fullstendig (reduserte den til et normalisert nivå på bare 7,22 ± 1,05 prosent; sammenlignbar med nivået observert i friske celler:

7,8 ± 0,39 prosent ), som vist i figur 7. Anvendelse av positive kontroller resulterte i en gradvis doseavhengig reduksjon i kaspase-3,7-aktivitet. Interessant nok hadde NEC-1 en svak effekt med maksimal effekt ved 50 uM og DFO hadde mer robust hemmende aktivitet ved 10 uM (reduserte aktiviteten til 80,5 ± 1,85 og 75,8 ± 3 .00 prosent henholdsvis). På den annen side ble bare små, men signifikante effekter på casp-3,7 oppnådd ved tZ ved 1 uM (89,5 ± 2,50 prosent), cZ ved 0,1 uM (87,4 ± 1,62 prosent) og K ved 1 uM ( 91,0 ± 2,06 prosent). Samlet viser resultatene at begge de positive kontrollene hadde sterkere aktivitetsreduserende aktivitet i caspase-3/7 enn de testede CK-ene, men CK-ene hadde effekter ved mye lavere konsentrasjoner. Samlet sett indikerer resultatene at modulering av kaspase-3/7-aktivitet spiller en nøkkelrolle i den potentenevrobeskyttendeaktiviteten til midler som DFO [58] i den Glu-induserte modellen for celledød [79,80]. Som vist i denne delen hadde imidlertid NEC-1 ogsånevrobeskyttendeaktivitet, noe som tyder på at andre typer celledød kan være involvert i Glu-indusert død av nevronlignende SH-SY5Y-celler [63,67,81]. Indikasjoner på at caspase-uavhengige mekanismer er involvert i Glu-indusert celledød har også blitt oppnådd i analyser av effekter av NEC-1 [70], DFO [69] og K [18] på HT22-celler.

Figur 7. Caspase-3/7 aktivitet i Glu-modell av oksidativ skade avnevron-lignende SH-SY5Y-celler. Treplikater på minst fire uavhengige dager. * P sammenlignet med kjøretøyet med 160 uM Glu, # P sammenlignet med kjøretøyet uten 160 uM Glu.

3. Konklusjoner

Oppsummert viste studien vår at CK og deres metabolitter harnevrobeskyttendeaktiviteter i den SAL-induserte modellen avParkinsons sykdomog Glu-indusert oksidativ skade i menneskelig differensiert SH-SY5Ynevronalceller. K3G, cZR og iPR ble funnet å ha biologisk signifikantenevrobeskyttendeaktiviteter. Dessuten var de aktive CK-ene effektive ved lavere (submikromolare og mikromolare) konsentrasjoner enn det positive kontrollstoffet NAC. K3G, cZR og iPR hadde også positive effekter på levedyktighet, cytotoksisitet, oksidativt stress og caspase-3,7-aktivitet (unntatt iPR). De ortogonale demonstrasjonene indikerer sterkt at antioksidativ stressaktivitet spiller en nøkkelrolle i CKs beskyttende effekter i den SAL-induserte celledødsmodellen. Bare tre metabolitter i det testede panelet av CK-er (tZ, cZ og K) ble beskyttetnevron-lignende SH-SY5Y-celler i den Glu-induserte modellen for oksidativ skade på lignende måte som jernkelatoren NEC1 og nekroptosehemmeren DFO. For å bekrefte deres lovende aktivitet, testet vi effektene deres i ortogonal laktatdehydrogenase (LDH)-frigjøringsanalyse. CK-ene hadde moderat, men signifikant beskyttende aktivitet. Dette var svakere enn de tilsvarende aktivitetene til kontrollstoffene, men til tross for forskjellene i moduleringen avnevronalhelse stimulerte alle de tre testede CK-ene kraftige reduksjoner i dannelsen av superoksidradikaler, på samme måte som de positive kontrollstoffene. CK-ene hadde også sammenlignbare effekter på Glu-indusert oksidativt stress i SH-SY5Y-celler som NEC1 og DFO, men disse forbindelsene hadde sterkere hemmende effekter på caspase-3/7-aktivitet enn CK-ene. Siden Glu-indusert celledød ikke er avhengig av en caspase-avhengig vei, som vist i studier av effekter av DFO og NEC-1 på HT-22-celler [70], kan CK-er tilsynelatende modulere både caspase- avhengig og uavhengig celledød ved å redusere oksidativt stress [18,82]. I pågående studier, den detaljerte virkningsmekanismen til CK og/eller deres mitokondrielle effekter pånevronaleller astrocyttceller vil bli undersøkt.

cistancheerfaringforPDoghukommelse

4. Materialer og metoder

4.1. Kjemikalier og reagenser

Cytokininstandarder ble hentet fra OlChemIm (Olomouc, Tsjekkia). Calcein AM (1 mg/ml løsning), og LDH-frigjøringssett og et Neurite-utvekstsett ble kjøpt fra ThermoFisher. Propidiumjodid, dihydroetidium, komponenter av caspase- 3/7 analysebuffer, DMEM/F12 1:1 medium, føtalt bovint serum, trypsin, ATRA, salsolinolhydrobromid, glutamatmononatriumsalt, deferoksamin, N-acetylcystein , Ac-DEVD-CHO og DMSO for cellekulturer ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Merck). Ac-DEVD-AMC-substratet ble levert av Enzo Life Science.

4.2. ORAC Radical Scavenging Activity Assays

Forbindelsers evne til å rense frie radikaler in vitro ble bestemt ved hjelp av Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-analysen. Kort fortalt ble fluorescein (100 uL, 500 mM) og 25 uL av den testede forbindelsesløsningen tilsatt til en 96-brønn mikroplate pre-inkubert ved 37oC. Deretter 25 uL av 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y cellekultur

Den humane neuroblastomcellelinjen SH-SY5Y kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle's Medium og Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM: F-12, 1:1 ), supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS) og 1 prosent penicillin og streptomycin ved 37 oC i en fuktet 5 prosent CO2-atmosfære. Celler ble passert opptil 20 ganger og media ble skiftet to eller tre ganger i uken. Celletettheten ble satt som passende for den planlagte analysen (5000, 7000, 10 000 eller 20 000 celler per brønn) i 96-flerbrønnsplater i 100 uL totale volumer av medium for hver eksperiment. Dagen etter såingen ble ATRA i 1 prosent FBS DMEM/F12-medium tilsatt til cellene til en sluttkonsentrasjon på 10 uM, og inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere 48 timer for å indusere differensiering, tillate dannelse av lengre neuritter og redusere spredning.

4.4. Mikroskopi

Mikrofotografier avnevron-lignende SH-SY5Y-celler ble oppnådd ved bruk av et DM IL LED-fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Mannheim, Tyskland) med et passende eksitasjonsfilter for analysen, eller et lysfeltoppsett med et DP73 høyytelses digitalkamera (Olympus, Tokyo, Japan ). Siden signal-til-støy-forholdet for farging var moderat, ble kontrasten justert litt i ImageJ-programvaren (Fiji) uten å påvirke den resulterende observasjonen. Originalbilder er inkludert i tilleggsmaterialet.

4.5. Cellemembranfarging (Neurite Outgrowth-sett, Invitrogen™)

Nevron-lignende SH-SY5Y-celler (5000 celler per brønn) oppnådd ved 48 timers differensieringsprosedyre ble farget med et Neurite-utvekstsett (Invitrogen™) i henhold til produsentens anbefalinger med mindre modifikasjoner. Cellene ble vasket med PBS, merket med en løsning av membranfargestoffet som fulgte med settet (følger protokollen for 96 multibrønnplater) i PBS i 20 minutter ved 37 oC, vasket igjen med PBS og sett under et fluorescensmikroskop ( med henholdsvis 533 og 585 nm eksitasjons- og emisjonsbølgelengder).

4.6. Cellebehandling

Etter differensieringsprosedyren ble differensieringsmediet endret til 1 prosent DMEM/F12-medium supplert med testforbindelser i konsentrasjoner på 0.1, 1 og 10 uM (med 7000 celler per brønn for cytotoksisitetstester), eller sammen med toksinet SAL ved 500 uM (med 7000–10 000 celler per brønn) eller 160 mM Glu (med 20 000 celler per brønn) for en passende varighet for analysetypen (levedyktighet, celledød, etc.). Kontrollceller ble behandlet med et medium inneholdende 0,0,1 prosent DMSO.

4.7. Cellelevedyktighet og celledød

Levedyktigheten tilnevron-lignende SH-SY5Y-celler som vokste i 96-brønnsmikroplater (med ca. 7000 celler per brønn) etter 24 timers behandlinger ble evaluert med Calcein AM-analysen med mindre modifikasjoner [31]. Calcein AM-løsningen i PBS som ble brukt hadde 0,75 uM konsentrasjon og inkubasjonstiden ble satt til 50 min. Antall levende celler i hver brønn ble bestemt ved å bruke en Infinite M200 Pro mikroplateleser (Tecan, Østerrike), med henholdsvis 495 og 517 nm eksitasjons- og emisjonsbølgelengder.

Celledød avnevron-lignende celler (SAL-modell: 10,000 celler per brønn; Glu-modell: 20,000 celler per brønn) ble bestemt ved PI-analyse som rapportert av Stone et al. 2003 med små modifikasjoner [83]. Kort fortalt ble mediet til den SAL-induserte modellen aspirert og endret til en 1 ug/mL løsning av PI i PBS, men celler utsatt for Glu-induksjon har svakere adherens, så en 1 mg/ml løsning av PI i PBS ble tilsatt til gi en sluttkonsentrasjon på 1 ug/ml. I begge tilfeller ble cellene inkubert i ytterligere 15–25 minutter ved romtemperatur, deretter ble PI-fluorescens målt med en Infinite M200 Pro-leser (Tecan, Grödig, Østerrike) med henholdsvis 535 og 617 eksitasjons- og emisjonsbølgelengder. Den resulterende PI-fluorescensen oppnådd med toksiner alene ble satt til 100 prosent celledød.

4.8. Måling av oksidativt stress ved hjelp av dihydroetidium (DHE)-analysen

Celler ble differensiert og behandlet som beskrevet i forrige avsnitt for SAL-induksjon (10,000 celler per brønn, 24 timer eller Glu-induksjon (20,000 celler per brønn, 4 timer). Etter behandlingene ble cellene sentrifugert ved 500 xg i 330 s, deretter ble kulturmediet erstattet (etter aspirasjon) med 10 uM DHE-løsning i PBS. 96-flerbrønnsplater med celler ble inkubert i mørket i 30 minutter i rom temperatur, deretter ble DHE-fluorescens målt med en Infinite M200 Pro-mikroplateleser (Tecan, Grödig, Østerrike) med henholdsvis 500 og 580 nm eksitasjons- og emisjonsbølgelengder. Den resulterende DHE-fluorescensen ble oppnådd med SAL- eller Glukose-prosent alene. Illustrative fluorescensmikrofotografier av DHE-fargede celler ble oppnådd etter DHE-måling med mikroplateleseren.

Cistanche-planten har en veldig god nevrobeskyttende effekt

4.9. Måling av Caspase-3/7-aktivitet

Ett-trinns kaspase-3/7-analyser ble utført i henhold til en tidligere publisert prosedyre [84]. For kulturer utsatt for SAL-induksjon og Glu-induksjon ble reaksjonsblandingene (caspase-3,7-buffer og komponenter med celler i 96-flerbrønnsplater) inkubert i 2 timer og 3 timer ved 37 oC, hhv. Caspase-3/7-aktivitet ble deretter målt med en Infinite M200 Pro mikroplateleser (Tecan, Østerrike) med henholdsvis 346 og 438 nm eksitasjons- og emisjonsbølgelengder.

4.10. Statistisk analyse

Eksperimenter ble utført i triplikater og gjentatt i løpet av tre til fem (n {{0}}–5) uavhengige dager. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Verdier for alle målte variabler er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, som ble beregnet ved hjelp av Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), som også ble brukt til å generere figurene. Den statistiske analysen ble utført av PAST (ver. 1.97) programvarepakke [85]. For differensieringseksperimentet ble Student t-testen brukt. Resten av eksperimentene ble evaluert ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-test med Mann-Whitney post hoc-test med sekvensiell Bonferroni-korreksjon. En verdi på p < 0,05="" ble="" ansett="" som="">

Tilleggsmateriale: Originalbilder er tilgjengelige på nettet.

Forfatterbidrag: Bidrag fra forfatterne var som følger: Undersøkelse, metodikk, validering, dataanalyse, GG, CWD og JG; skriving – original utkast til forberedelse GG, CWD og MS; datakurering, finansieringsinnhenting, veiledning, skriving – gjennomgang og redigering, CWD, MS og PK Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering: Dette arbeidet ble delvis støttet finansielt av tilskudd fra Internal Grant Agency ved Palacky University i Olomouc, Tsjekkia (IGA{{0}}PrF_2020_021), det tsjekkiske tilskuddsbyrået ({{ 2}}S), og European Regional Development Fund – Project ENOCH (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) og et studentstipend fra Palacky University's Endowment Fund.

Uttalelse fra institusjonell vurderingskomité: Ikke aktuelt.

Informert samtykkeerklæring: Ikke relevant.

Datatilgjengelighetserklæring: Data finnes i artikkelen eller tilleggsmaterialet.

Anerkjennelser: Forfattere takker Dita Jordovd, Jana Hrubešovd og Lucie Koplikovd for utmerket teknisk assistanse. I tillegg takker forfatterne Sees-editing Ltd., Storbritannia for den engelske redigeringen av manuskriptet.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Prøvetilgjengelighet: Prøver av forbindelsene er ikke tilgjengelige fra forfatterne.