Del en|En hemmer av NF-KB og en agonist av AMPK: Nettverksprediksjon og multi-omics-integrasjon for å utlede signalveier for akteosid mot Alzheimers sykdom

Del en|Acteosider: hvordan behandle Alzheimers sykdom som en av de effektive ingrediensene i Cistanche?

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1, Yuan-Yuan Shi2, Xiao-Li Jiang1, Shan-Shan Wu1, Ping Zhou1, Hui-Ying Wang1, Ping Li1* og Fei Li1,2 * 1 statsnøkkel Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing, Kina, 2 College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Kina

Alzheimers sykdom (AD) er den hyppigste typen demens.Acteosid (HANDLING) er en forbindelse isolert fraCistanche tubulosa, som har utmerkede nevrobeskyttende egenskaper. Imidlertid er den underliggende mekanismen tilHANDLINGved å regulere mikroglia forblir polarisering dårlig definert. Derfor ble det etablert en beregningsbasert nettverksmodell for å identifisere drivende mål forHANDLINGog forutsi mekanismen ved å integrere flere tilgjengelige databaser. Den AlCl3-induserte AD-modellen i sebrafisklarver ble konstruert for å demonstrere den terapeutiske effekten av ACT. Deretter avdekket LPS-induserte BV-2-celler den positive rollen til ACT i M1/M2-polarisering. NF-KB- og AMPK-veiene ble ytterligere bekreftet ved transkriptomisk analyse, metabolomikkanalyse, molekylærbiologiske teknikker og molekylær docking. Forskningen ga en infusiv mekanisme for ACT og avslørte sammenhengen mellom metabolisme og mikrogliapolarisering fra mitokondriell funksjons perspektiv. Enda viktigere, det ga en systematisk og omfattende tilnærming for oppdagelsen av medikamentmål, inkludert endringene i gener, metabolitter og proteiner.

Nøkkelord: akteosid, BV-2-celler, metabolisme, RNA-seq, mitokondrier, nevroinflammasjon

For mer informasjon, kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Klikk for å Cistanche DHT for minne

INTRODUKSJON

Med aldring og rask vekst av befolkningen har antallet demenstilfeller i verden vist en stigende trend.Alzheimers sykdom(AD) er en vanlig nevrodegenerativ sykdom ledsaget av kognitiv svikt og dyskinesi (Perea et al., 2020), som er den hyppigste typen demens. Det er preget av alvorlig nevronalt tap, senile plakk og nevrofibrillære floker (Shiao et al., 2017). Patogenesen avAlzheimers sykdomer flerdimensjonal og kobler til nevroinflammasjon. Nevroinflammasjon er drevet av aktivering av gliaceller, som er nært knyttet til forekomst og utvikling av AD (Hanslik og Ulland, 2020; Linnerbauer og Rothhammer, 2020). Under progresjonen og forverringen av nevroinflammasjon, anses mikroglia som en nøkkelfaktor. Mikroglia er de primære immuncellene i sentralnervesystemet, som er nært forbundet med en kaskade av prosesser som hjerneutvikling, vedlikehold av det nevrale miljøet, samt respons på skade og reparasjon (Perea et al., 2020). Dessuten kan mikroglia stimuleres til en M1-fenotype og øke uttrykket av pro-inflammatoriske cytokiner når nevroinflammasjonsrelaterte sykdommer som AD oppstår (Tsukahara et al., 2020). Studier viser også at polariseringen til M1-fenotypen ofte er ledsaget av metabolske forstyrrelser (Li L. et al., 2020), noe som fører til ubalanse i energimetabolismen og mitokondriell dysfunksjon (Agrawal og Jha, 2020). Disse negative endringene er avledet fra nevrodegenerasjon, til og med Alzheimers sykdom.

Acteosid (ACT), a fenyletanoid glykosid, er først og fremst avledet fraCistanche tubulosa. Økende bevis har antydet at ACT har en rekke farmakologiske aktiviteter, inkludertnevrobeskyttende(Wei et al., 2019),anti-inflammatorisk(Lai et al., 2019), ogantioksidant(Ji et al., 2019) effekter. Spesielt er det bevist at Acteoside kanforbedre læring og hukommelsesvekkelse samt oppregulere energimetabolismen hos streptozotocin-induserte rotter (Chen J. et al., 2020). I tillegg kan det også hemme neuronal apoptotisk celledød og mitokondriell skade i de eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt-musene (Li W. et al., 2020). Imidlertid er effekten av ACT på mikroglia M1/M2-polarisering og dens mekanisme sjelden rapportert. Frem til nå er mekanismene som reparasjon av mitokondrierfunksjon og regulering av cellemetabolisme uklare, og ytterligere vitenskapelig forskning er nødvendig for å avklare den eksakte mekanismen.

Formålet med denne rapporten er å undersøke den terapeutiske effekten av ACT så vel som den underliggende molekylære mekanismen til ACT på AD. Her etableres en systematisk in silico-metode for legemiddelmålidentifikasjon basert på de konsoliderte databasene. Vi undersøker videre de mulige mekanismene til ACT på molekylærbiologisk nivå ved å integrere RNA-sekvensering (RNA-seq) med metabolomiske metoder og molekylærbiologiske teknikker. Kombinasjonen av in silico, in vivo og in vitro systematiske screeningsstrategier gir en ny protokoll for objektivt å oppdage multi-target forbindelser av tradisjonell kinesisk medisin.

MATERIALER OG METODER

Nettverksmodellering

Fire nettplattformer ble kombinert for å forutsi og oppdage målene forActeosid, nemlig GeneCards1, likhetsensembletilnærming (SEA2), SwissTargetPrediction3 og PharmMapper4. Alle genassosiasjoner av AD ble uavhengig samlet inn fra DisGeNET5 og GeneCards. Etter mål-mål-interaksjonsanalysen utført av String database6, ble nettverket videre integrert av Cytoscape (versjon 3.8.2) programvare. GO- og KEGG-anrikingsanalyse ble utført på DAVID-databasen7 for å kommentere og utvinne nettverket.

Dyr og modellgruppering

Villtype sebrafisk (AB-stamme, 4 måneder gammel) ble valgt i denne studien (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De ble holdt under en 14/10-t lys/mørke-syklus ved 28◦C, etter den forrige metoden (Li YQ et al., 2020). Alle sebrafiskeksperimenter ble utført under tilsyn av Animal Ethics Committee ved China Pharmaceutical University. Sebrafisklarver ble delt inn i seks grupper og behandlet fra 3 dager etter befruktning (dpf) til 7 dpf: kontrollgruppe, modellgruppe, modell pluss donepezilhydroklorid (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) gruppe, og modell plussActeosid(HPLC renhet Større enn eller lik 98 prosent, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) grupper. Kontrollgruppen ble holdt i mediet med 0,2 prosent DMSO og modellgruppen ble behandlet med 150 µM AlCl3 (pH 5,8). Modellen pluss DPZ-gruppen ble samtidig behandlet med AlCl3 og 8 µM DPZ. Modellen plussActeosidgrupper ble behandlet med AlCl3 og forskjellige konsentrasjoner av ACT (200, 100 og 50 µM).

Atferdsanalyse

Sebrafisklarvenes bevegelser ble registrert av en ViewPoint atferdsanalysator (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ved 28◦C. Kort fortalt var atferdsparametrene og resultatbehandlingen i samsvar med metoden vi etablerte tidligere (Li YQ et al., 2020). Her ble gjennomsnittlig hastighet (AS), hastighetsendring (1S), restitusjonsrate for dyskinesi (DRR) og responseffektivitet (RE, prosent ) valgt for å evaluere restitusjon av dyskinesi hos sebrafisk.

Bestemmelse av acetylkolinesterase og kolinacetyltransferaseaktivitet

Etter behandling fra 3 til 7 dpf, ble sebrafisklarver samlet for å måle aktivitetene acetylkolinesterase (AChE) og kolinacetyltransferase (ChAT). Basert på produsentens protokoll ble aktiviteten oppdaget av de enzymkoblede immunosorbentanalysesettene (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina)

Cellekulturer og behandlinger

BV-2 cellelinje ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). De ble dyrket i DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kina). Mediet ble supplert med 10 prosent FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin, ledsaget av 95 prosent luft/5 prosent CO2 ved 37◦C. BV-2-celler ble inkubert med ACT (50, 25 og 12,5 µM) eller stimulert med lipopolysakkarid (LPS, 1 µg/ml; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 24 timer. Cellene ble observert under det omvendte mikroskopet (Nikon ECLIPSE Ti2, Japan).

Cellelevedyktighetsanalyse

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-analyse (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) ble brukt til å evaluere cellelevedyktighet. Kort fortalt ble absorbansen målt ved 450 nm med en mikroplateleser (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA).

Nitrogenoksid produksjonsanalyse

Nitrogenoksid (NO) ble bestemt ved å måle nitrittnivåer i BV-2 kultursupernatanten ved bruk av Griess-reagens. Kort fortalt ble mediet (100 ul) overført til en ny 96-brønnplate, det samme volumet av Griess-reagens ble tilsatt til hver brønn og reagerte i 15 minutter i mørket. Absorpsjonen ved 540 nm ble bestemt med en mikroplateavleser.

Inflammatoriske cytokinnivåer i supernatanten

Konsentrasjonene av TNF-, IL-1 og IL-10 i BV-2-cellesupernatanten ble bestemt med ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner.

Cellulær metabolismebestemmelse ved HPLC-Q-TOF-MS-analyse

BV{{0}}-celler ble sådd i en seks-brønns skål separat (n=6/gruppe). Etter behandling ble mediet fjernet, og cellene ble vasket tre ganger med kald PBS. De ble deretter umiddelbart utsatt for flytende nitrogen for å undertrykke cellemetabolismen. Cellene ble høstet med 8{{30}} prosent kald metanol. For å lette proteinutfelling ble cellene virvlet kraftig i 1 min og sentrifugert ved 13,000 rpm (15 min, 4◦C). Cellesuspensjonen ble tørket under en strøm av nitrogen. Den tørkede resten ble rekonstituert i 15 0 µl forhåndsavkjølt 25 prosent acetonitril. For å sikre stabiliteten og nøyaktigheten til sekvensanalysen, ble hver celleprøve med likt volum (10 µl) kombinert som kvalitetskontrollprøver. Under metabolittdeteksjon ble disse prøvene injisert etter hver sjette prøve for å bekrefte deres stabilitet. En 1-µl alikvot ble injisert for HPLC-Q-TOF-MS. Analysen ble utført på et Agilent 1290 HPLC-system koblet til Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separasjonen ble utført på en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonne (2,1 min x 100 mm, 1,7 µm). Den mobile fasen var sammensatt av 0,1 prosent maursyre-vann (v/v; A) og acetonitril (B). Felleshastigheten ble satt til 0,4 ml/min med følgende optimale gradientelueringsbetingelse: 0 til 2 minutter, 5 prosent B; 2 til 20 minutter, 5 til 95 prosent B (positiv ionmodus); 0 til 2 minutter, 5 prosent B; 2 til 20 min, 5 til 95 prosent B (negativ ionmodus). Driftsparametrene til massespektrometeret ble satt som følger: gasstemperatur, 320◦C; tørkegass, 10 l/min; forstøver, 35 psi; VCap, 4,000 V; fragment, 120 V. Rådataene ble operert under MassHunter Workstation Software versjon B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Rådataene ble forhåndsbehandlet av XCMS-plattformen. Hovedkomponentanalyse (PCA) og partiell minstekvadratdiskriminerende analyse (PLS-DA) av de normaliserte dataene ble utført med MetaboAnalyst8. Kombinert med litteraturen ble de differensielle metabolittene (VIP > 1, t-test p < 0,05)="" identifisert="" på="" hmdb9.="" til="" slutt="" ble="" veianalyse="" utført="" med="">

Måling av mitokondriell membranpotensial

Mitokondrielt membranpotensial (MMP) ble oppdaget ved bruk av FL fluorescerende probe JC-1 (Beyotime, Kina) i samsvar med produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble celler fra forskjellige grupper skylt med PBS og inkubert med JC-1-fargeløsning i 20 minutter ved 37◦C. Etter farging ble cellene vasket to ganger ved bruk av fargebuffer. Deretter ble FL-fluorescerende signaler oppdaget ved hjelp av andre cytometri (BD Accuri C6).

Måling av mitokondriell adenosin 50 -trifosfat

Adenosin 50 -trifosfat (ATP)-konsentrasjon i mitokondrier ble påvist av et ATP-analysesett (Beyotime, Kina). Kort fortalt ble kulturmediet til BV-2-celler fra forskjellige grupper kastet, og cellene ble homogenisert med lyseringsbuffer på is. Supernatanten oppnådd etter sentrifugering (12,000 g, 5 min) ble brukt for å bestemme ATP-konsentrasjonen. Luminescensen ble oppdaget av EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Måling av nivået av intracellulært reaktivt oksygenarter

Reaktive oksygenarter (ROS) analysesett (Beyotime, Kina) ble brukt til å måle ROS-nivåer. Cellene fra forskjellige grupper ble inkubert med DCFH-DA (10 µM) i 20 minutter ved 37◦C. Etter probelasting ble cellene vasket tre ganger med DMEM. Deretter ble FL-fluorescerende signaler oppdaget ved hjelp av andre cytometri (BD Accuri C6).

Transmisjonselektronmikroskopi

BV-2-celler ble sådd i en skål med seks brønner. Mediet ble fjernet og 1 ml 2,5% glutaraldehyd ble raskt tilsatt til hver brønn. Deretter ble cellene samlet og fiksert med ny 2,5 prosent glutaraldehyd ved 4◦C over natten. Etter fiksering, dehydrering og innebygging ble cellene observert med et HT7800 transmisjonselektronmikroskop (Hitachi, Tokyo, Japan).

RNA-Seq og bioinformatisk dataanalyse

Totalt RNA fra BV-2-celler ble ekstrahert ved bruk av Trizol-reagens (Vazyme Biotech, Kina). Alle analytiske prøver ble sendt til Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) for RNA-sekvensanalysen. Dataene ble analysert på nettplattformen til Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 ble brukt til å kvantifisere genoverflod. I hovedsak differensielt uttrykk

analyse ble utført ved bruk av DESeq2/DEGseq/EdgeR med Q-verdi mindre enn eller lik 0.05; DEG med|log2FC| > 1 og Q-verdi Mindre enn eller lik 0.05 (DESeq2 eller EdgeR)/Q-verdi Mindre enn eller lik 0,001 (DEGseq) ble ansett for å være signifikant forskjellige uttrykte gener. I tillegg ble funksjonelle berikelsesanalyser inkludert GO og KEGG utført for å identifisere hvilke DEG-er som ble betydelig beriket i GO-termer og -veier ved Bonferroni-korrigert p-verdi Mindre enn eller lik 0,05 sammenlignet med hele transkriptombakgrunnen. De originale sekvensdataene er sendt til databasen til NCBI Sequence Read Archive.

Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon

Det totale RNA-et til BV-2-celler ble høstet ved bruk av RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Kina), og revers transkripsjonsreaksjon ble utført med FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Kina). Reaksjoner ble utført i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble utsatt for kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjonsanalyser (qRT-PCR) med spesifikke primere og TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Kina). Primerne er oppført i tilleggstabell 1 og -aktin ble brukt som internkontroll. CT-metoden 22 1 1 ble brukt for kvantitativ analyse.

Western blot-analyse

BV-2-celler ble lysert av RIPA-lysebuffer (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kina) som inneholdt 1 prosent proteasehemmer-cocktail (Thermo Fisher) for å oppnå totalt protein. Proteinene ble separert med 10 prosent SDS-PAGE og overført til NC-membraner. Etter blokkering med 5 prosent skummet melk/BSA, ble membranene inkubert med AMPK (Proteintech), p-AMPK (Affiffiffinity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF- κB (ABclonal), eller GAPDH (ABclonal) antistoffer i 5 prosent TBST ved 4◦C over natten. Membranene ble inkubert med et sekundært pepperrotperoksidase-konjugert antistoff (ABclonal) ved romtemperatur i 1 time. High-sig ECL Western blotting-substratet (Tanon, Kina), gelbildesystemet (Tanon, Kina) og ImageJ-programvaren ble brukt til visualisering og kvantifisering.

Molekylær dokking

Molekylær dokkinganalyse ble utført ved bruk av Autodock-programvare (versjon 4.2). Affiniteten mellom ACT og proteiner ble observert av AutodockTools programvare. De tredimensjonale (3D) proteinstrukturene til AMPK (PDB ID: 5g5j) og NF-κB (PDB ID: 4q3j) ble hentet fra Protein Data Bank12.

Statistisk analyse

Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik og analysert med GraphPad Prism Software (versjon 8.0.1). Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA), etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest. p < 0.05="" ble="" ansett="" som="" statistisk="">

RESULTATER

ACT-AD retter seg mot interaksjonsnettverk og ruteprediksjon

Gjennom konsolidering av flere databaser ble 253 mål av ACT anskaffet, mens totalt 1697 mål relatert til AD ble samlet. Etter kartlegging av målnettverk ble totalt 70 mål absorbert i ACT-AD-målinteraksjonsnettverket (figur 1A). KEGG-anrikningsanalyse antydet at ACT kunne ha en bredspektret og multippel måleffekt (figur 1B). Det antydet også at ACT har flere veier, målpunkter og elementer i AD-behandling. Klassifiser disse veiene for å få en nøyaktig tolkning av mekanismene. ACT kan hovedsakelig korrelere med signaltransduksjon, det endokrine systemet, immunsystemet og cellevekst og død for å spille en konfronterende rolle mot AD (Figur 1C). Det er verdt å merke seg at de aller fleste av disse veiene er relatert til betennelsesreaksjoner. Det spekuleres i at den antiinflammatoriske virkningen av ACT kan være en uløselig del av dens konfronterende rolle mot AD.

ACT lindret dyskinesi og forbedret den kolinerge systemfunksjonen i AD sebrafisklarver

For å bekrefte nettverksmodellen ble den AlCl3-induserte AD-modellen i sebrafisklarver brukt for å demonstrere effekten av ACT. Sebrafisklarvenes bevegelse i lys/mørke sykluser ble observert, og svømmestiene deres ble registrert (Figur 1D). Resultatene viste at ACT effektivt økte AS og 1S til sebrafisk, og den synergistiske effekten økte med økningen av doser (Figur 1E). DRR og RE avdekket en mer intuitiv sammenligning av ACT og DPZ (Figur 1F). Følgelig lindret ACT dyskinesi, og viste lignende effekter som DPZ. Det er generelt enighet om at det kolinerge systemet spiller en viktig rolle i lærings- og hukommelsesprosesser. Dermed ble aktivitetene til AChE og ChAT brukt til å avsløre effekten av ACT. AlCl3-eksponering i sebrafisk ble gjengitt med kolinerg endring i hjernen (figur 1G). Det var signifikant at ACT-behandling undertrykte aktiviteten til AChE. I tillegg viste aktiviteten til ChAT en nedgang etter ACT-behandling. Derfor viste ACT en dyp innvirkning i AlCl3-induserte AD-sebrafisklarver.

ACT undertrykt M1-polarisering og fremmet M2-polarisering i LPS-induserte BV-2-celler

For ytterligere å bekrefte nettverket ble den antiinflammatoriske effekten av ACT studert in vitro ved bruk av BV-2 mikrogliaceller. Etter LPS-behandling i 24 timer, ble levedyktigheten til BV-2-celler redusert betydelig. Heldigvis økte ACT cellelevedyktigheten til LPS-induserte BV-2-celler (figur 2A). I tillegg ble morfologien til BV-2-celler observert. Etter 24 timer med LPS-stimulering viste det at BV-2-celler gjennomgikk en M1-polarisasjonstilstand. De morfologiske endringene ble forhindret ved ACT-sambehandling (figur 2B).

Dessuten indikerte resultatene at, i motsetning til BV-2-celler stimulert av LPS, undertrykte BV-2-celler sambehandlet med ACT signifikant TNF-, IL-1- og NO (Figur 2C) uttrykk i cellesupernatant. Dette er klassiske pro-inflammatoriske cytokiner som indikatorer på M1 mikroglia polarisering. I likhet med resultatene av ELISA, oppdaget resultatene av qPCR at TNF-, nitrogenoksidsyntase (iNOS), IL-1 og CD86 mRNA-uttrykk ble signifikant hemmet av ACT-behandling sammenlignet med LPS-gruppen (Figur 2D). Videre målte vi M2 mikroglia polarisasjonsnivå ved ELISA (Figur 2C) og qPCR (Figur 2E), og resultatene indikerte at ACT signifikant økte M2 mikroglia-relaterte markørekspresjonsnivåer (IL-10, CD206, TGF- og Arg-1). Kort sagt, disse resultatene viste detHANDLINGundertrykte M1 mikroglia-polarisering og fremmet M2-fenotypen.

ACT-regulert M1/M2-polarisering via inhibering av NF-KB-banen

Den transkriptomiske analysen ble utført av RNA-seq for å utforske mekanismen til ACT i BV-2-celler fra et overordnet nivå. PCA illustrerte at kontroll-, LPS- og ACT-gruppene kunne skilles godt fra hverandre (figur 3A). Den avslørte 899 differensielt uttrykte gener (DEG) mellom kontrollgruppen og LPS-gruppen, og 49 grader mellom LPS-gruppen og ACT-gruppen (figur 3B). Konsekvent avdekket GO (Figur 3C) og KEGG-anrikningsanalyse (Figur 3D) at effekten av ACT var involvert i NF-KB-veien. Settet med gener assosiert med NF-κB-banen ble ytterligere bekreftet, og homeostasen deres ble absolutt påvirket av LPS. Som forventet påvirket ACT uttrykkene deres betydelig (Figur 3E). NF-KB-veien er en klassisk vei for å regulere progresjonen av betennelse, noe som til slutt resulterer i frigjøring av pro-inflammatoriske faktorer. For å få mekanistisk støtte ble nøkkelproteinet til NF-KB-banen evaluert ved Western blot. LPS-stimulering førte til aktivering av NF-KB, assosiert med å fremme M1-polarisering. I samsvar med RNA-seq-analyse, hemmet ACT LPS-stimulert NF-KB-fosforylering (figur 3F). Derfor kan ACT lindre den LPS-induserte M1-polarisasjonen via NF-κB-banen i BV-2-celler.

ACT svekket argininbiosyntese samt pantotenat- og coA-biosyntese

Nettverksprediksjon av ACT avslørte at det var relatert til arginin (Arg) og prolinmetabolisme (figur 1B). RNA-seq demonstrerte at veiene påvirket av ACT også inkluderte Arg-biosyntese så vel som pantotenat- og CoA-biosyntese (figur 3D). Det har blitt antydet at metabolismeforstyrrelsene til BV-2-celler indusert av LPS-stimulering er assosiert med M1-polarisering (Orihuela et al., 2016). Således ble et ikke-målrettet cellemetabolom av HPLC-Q-TOF-MS brukt for å identifisere effekten av ACT på cellemetabolismen. PCA og PLS-DA (Figur 3G) illustrerte at kontroll-, LPS- og ACT-gruppene kunne skilles godt ut basert på intracellulære metabolitter. Nivåene av ulike metabolitter i LPS-induserte BV-2-celler ble endret etter ACT-behandling (figur 3H). Sammenlignet med kontrollgruppen var det 11 metabolitter som endret seg betydelig i LPS-gruppen (tilleggstabell 2), mens 14 metabolitter ble tydelig endret etter behandlingen av ACT (tilleggstabell 3), som involverte 11 metabolske veier (figur 3I). Effekten av ACT besto hovedsakelig av å regulere aminosyremetabolisme, nukleotidmetabolisme, energimetabolisme og metabolisme av kofaktorer og vitaminer. Interessant nok var de metabolske veiene oppnådd av metabolom i samsvar med nettverksprediksjon og RNA-seq, inkludert Arg-biosyntese så vel som pantotenat- og CoA-biosyntese. Ovennevnte viste at ACT kunne regulere Arg-biosyntese så vel som pantotenat- og CoA-biosyntese i LPS-stimulerte BV- 2-celler.

HANDLINGRedusert LPS-indusert BV-2 mitokondriell dysfunksjon

Mitokondrier er kjernen i metabolske veier. Utviklende bevis viser at mitokondrier er en nøkkelspiller i mikroglial M1/M2-polarisering. En oversikt over mitokondrierstatus i morfologi og cellefordeling ble bedømt ved TEM. Etter LPS-stimulering ble kromatinet til BV-2-celler kondensert, og cytoplasmaet og mitokondriene ble redusert (figur 4A). I tillegg ble mitokondrielle cristae i LPS-gruppen uordnet eller til og med forsvunnet, og viste delvis kristolyse, størrelsesreduksjon og rundformet morfologi. Interessant nok kan ACT-behandling lindre LPS-induserte morfologiske endringer i mitokondrier. Etter tur undersøkte vi mitokondriefunksjonen til LPS-behandlede BV-2-celler, inkludert MMP- og ATP-produksjon. MMP (Figur 4B) og ATP-produksjonen i mitokondrier (Figur 4C) ble betydelig forbedret i ACT-gruppen sammenlignet med de i LPS-gruppen. Mitokondriell dysfunksjon kan være relatert til økt nivå av ROS i cellen. Flowcytometrianalyse viste at innholdet av ROS var overbelastet i LPS-gruppen (Figur 4D). Heldigvis eliminerte ACT overdreven ROS. Det antyder at ACT kan gjenopprette mitokondriefunksjonen ved å fjerne ROS.

ACT gjenopprettet mitokondriefunksjon gjennom oppregulering av PGC-1 og UCP-2

Peroksisomproliferativ-aktivert reseptor-ko-aktivator-1 (PGC-1) spiller en viktig rolle i mitokondriell biogenese (Bi et al., 2019). Stimuleringen av LPS reduserte uttrykket av PGC-1, noe som viste mitokondriedysfunksjon. Bemerkelsesverdig nok ble PGC-1-gen-mRNA og proteinekspresjon betydelig reversert ved ACT-behandling i LPS-behandlede BV-2-celler (Figur 4E).

Det mitokondrielle frakoblingsproteinet-2 (UCP-2) var også kjent for å regulere mitokondriell funksjon. Som et nedstrøms protein av PGC-1 kan det kontrollere LPS-indusert MMP-depolarisering og ROS-produksjon. Nyere rapporter indikerer at det er sentralt i prosessen med mikroglial aktivering, med motsatt regulering av M1 og M2 polarisering (De Simone et al., 2015). Western blot-resultater viste at UCP-2-proteinnivået ble redusert etter LPS-stimulering. Samtidig behandling av LPS og ACT kan oppregulere uttrykket av UCP-2 sammenlignet med LPS-behandlingen. mRNA-ekspresjonsnivået til UCP-2 viste også lignende endringer (figur 4F). For å oppsummere, ACT gjenopprettet mitokondriefunksjonen gjennom oppregulering av PGC-1 og UCP-2.

ACT undertrykt Microglia M1

Polarisering via AMPK-aktivering

Som en sentral cellulær energisensor spiller AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) en viktig rolle i å opprettholde cellemetabolismebalansen. Samtidig er PGC-1 et nedstrømsprotein av AMPK. Som vist i analysen av nettverksmodellen,HANDLINGkan regulere AMPK-banen (figur 1B). Resultatene avdekket at LPS hemmet aktiveringen av AMPK, noe som resulterte i cellemetabolismeforstyrrelser og mitokondriell dysfunksjon. Det er bemerkelsesverdig at ACT doseavhengig kan øke proteinekspresjonen av p-AMPK (figur 5A). Det foreslås at ACT kan øke uttrykket av PGC-1 og gjenopprette mitokondriell funksjon ved å aktivere AMPK-signalveien. I denne studien, for å undersøke om aktiveringen av AMPK bidro til reguleringseffekten avHANDLINGpå M1/M2-polarisering ble forbindelse C (CC) brukt for å hemme effekten av AMPK. I motsetning til det nedregulerte NO-nivået i ACT-behandlingsgruppen, blokkerte CC delvis effekten av ACT på NO-nivået (Figur 5B). Basert på disse resultatene kan ACT regulere M1/M2-polarisering av BV-2-celler ved aktivering av AMPK.

HANDLINGBinding til og hemmet NF-κB samt aktivert AMPK

Molekylær dokking ble brukt for å bekrefte om ACT binder seg til NF-KB- og AMPK-proteinene. Funn viste at bindingsenergien tilHANDLINGog NF-kB var -8,4 kcal/mol, mens den påHANDLINGog AMPK var -10,8 kcal/mol. Signifikante affiniteter bekreftet at ACT er bundet til NF-KB og AMPK direkte (figur 5C, D, F, G). Deretter ble de mulige bindingsmåtene og interaksjonene i aminosyrelommene utforsket videre, inkludert 11 aminosyrerester av NF-KB (Figur 5E) samt 12 aminosyrerester av AMPK (Figur 5H). Disse resultatene indikerte at ACT direkte kan påvirke NF-κB og AMPK for å dempe BV-2 mikroglia M1-polarisering og fremme M2-fenotypen.