Del Ⅰ Smad3-mangel forbedrer øybasert terapi for diabetes og diabetisk nyreskade ved å fremme celleproliferasjon via den E2F3-avhengige mekanismen
May 25, 2023
Abstrakt
1. Begrunnelse
Dårlig celleproliferasjon er en av de skadelige faktorene som hindrer øycelleerstatningsterapi for pasienter med diabetes. Smad3 er en viktig transkripsjonsfaktor for TGF-signalering og har vist seg å fremme diabetes ved å hemme celleproliferasjon. Derfor antar vi at Smad3-mangelfulle holmer kan være en ny celleerstatningsterapi for diabetes.
2. Metoder
Vi undersøkte denne hypotesen i streptozocininduserte type-1 diabetiske mus og type-2 diabetiske db/db mus ved å transplantere henholdsvis Smad3 knockout (KO) og villtype (WT) øyer under nyrekapselen. Effektene av Smad3KO versus WT-øyerstatningsterapi på diabetes og diabetisk nyreskade ble undersøkt. I tillegg ble RNA-seq brukt for å identifisere nedstrøms målgenet som ligger til grunn for Smad3-regulert celleproliferasjon i Smad3KO-db/db versus Smad3WT-db/db museøyer.
3. Resultater
Sammenlignet med Smad3WT-øyterapi ga behandling med Smad3KO-øyer en mye bedre terapeutisk effekt på både type-1 og type-2 diabetes ved å redusere serumnivået av blodsukker og HbA1c betydelig og beskytte mot diabetiske nyreskader ved å forhindre en økning i serumkreatinin og utvikling av proteinuri, mesangial matriseutvidelse og fibrose. Disse var assosiert med en betydelig økning i proliferasjon av transplanterte celler og blodinsulinnivåer, noe som resulterte i forbedret glukoseintoleranse. Mekanistisk avslørte RNA-seq at sammenlignet med Smad3WT-db/db museøyer, oppregulerte sletting av Smad3 fra db/db museøyer E2F3, en sentral regulator for cellesyklus G1/S-inngang. Ytterligere studier fant at Smad3 kunne binde seg til promoteren til E2F3, og dermed hemme celleproliferasjon via en E2F3-avhengig mekanisme ettersom demping av E2F3 opphevet den proliferative effekten på Smad3KO-celler.
4. Konklusjon
Smad3-mangelfull øyerstatningsterapi kan forbedre både type-1 og type-2 diabetes og beskytte mot diabetisk nyreskade, som formidles av en ny mekanisme av E2F3-avhengig celleproliferasjon.
Nøkkelord
Smad3, øytransplantasjon, diabetes, E2F3, cellesyklus.
Klikk her for å fåCistanche-fordeler
Introduksjon
type-1 og 2 diabetes mellitus (T1DM og T2DM). celle- eller øytransplantasjon er en attraktiv terapi og har blitt brukt med suksess hos pasienter med T1DM. Øyene eller cellene som brukes til transplantasjon er vanligvis fra kadaveriske donorer eller induserte pluripotente stamceller (iPSC) [1, 2]. Mer enn 1500 tilfeller av klinisk øytransplantasjon har blitt fullført hos pasienter med T1DM etter den veletablerte Edmonton-protokollen [1]. Selv om omtrent 50 prosent av pasientene har insulinuavhengighet i 5 år etter transplantasjon, er transplantasjonssvikt en vanlig bekymring klinisk. En av faktorene som hindrer øytransplantasjon er den ekstremt lave proliferasjonsraten til de podede øycellene [3]. I tillegg kan de farlige stimuli fra graftmikromiljøet som betennelse, immunallograftavvisning og metabolsk stress føre til at transplanterte celler gjennomgår apoptose og nekrose, noe som resulterer i progressivt grafttap [1]. Derfor er forbedring av den transplanterte celleproliferasjonen avgjørende for suksessen til øytransplantasjonsbasert behandling for diabetes.
Transformerende vekstfaktor-beta (TGF-) signalering spiller pleiotrope roller i mange biologiske prosesser. Signaltransduksjonen starter ved binding av TGF-liganden til dens type 2 reseptor TGFBR2. Sistnevnte rekrutterer og aktiverer type 1 reseptor TGFBR1 ved fosforylering. Aktivert TGFBR1 fosforylerer videre de reseptorregulerte Smad-proteinene (R-Smads), Smad2 og Smad3. R-Smads danner et kompleks med Smad4, som translokerer inn i kjernen for å transkripsjonelt regulere målgener [4, 5]. Det er rapportert at bukspyttkjertelholmen opprettholder universelt aktivert TGF-signalering som avslørt av et relativt høyt nivå av fosforylert Smad2/3 under de fysiologiske forholdene. Imidlertid, som svar på insulinbehov, reduseres TGF-signalaktiviteten, ledsaget av økt celleproliferasjon [6]. I tillegg fremmer farmakologisk hemming av TGF-signalering celleproliferasjon in vitro og in vivo [7, 8]. Enda viktigere er at slettingen av Smad3 resulterer i mer robust celleproliferasjon sammenlignet med slettingen av Smad2 hos mus med delvis pankreatektomi, noe som indikerer at Smad3, men ikke Smad2, er den primære effektoren nedstrøms for TGF-signalering for å regulere celleproliferasjon [6]. Senere studier viser at Smad3 undertrykker celleproliferasjon ved å indusere ekspresjonen av syklinavhengige kinasehemmere (CDKI), inkludert p16, p21 og p57 [7, 8].
Vårt nylige arbeid fant også at sletting av Smad3 i db/db-mus (Smad3KO-db/db) forhindrer utbruddet av åpenlys diabetes uten fedme, hyperglykemi, insulinresistens og glukoseintoleranse. Interessant nok viser Smad3KO-db/db-mus øyhyperplasi med betydelig økt celleproliferasjon og vedvarende hyperinsulinemi [9]. Dette innebærer at Smad3 er patogen ved diabetes og målretting av Smad3 i celler kan representere en ny celle- eller øyerstatningsterapi for diabetes. Dette ble undersøkt i denne studien ved å bruke Smad3 knockout (Smad3KO) øytransplantasjon i streptozocin (STZ)-induserte type -1 diabetiske mus og i type-2 diabetiske db/db mus.
Cistanche kosttilskudd
Resultater
1. Smad3KO-øytransplantasjon ga en bedre terapeutisk effekt på STZ-indusert type-1 diabetes
For å sammenligne den terapeutiske effekten av Smad3KO versus Smad3WT-holmen på diabetes, utførte vi først syngenisk øytransplantasjon under nyrekapselen til STZ-induserte diabetiske mus der hyperglykemi er forårsaket av cellemangel. Diabetiske mus på dag 7 etter STZ-injeksjon ble transplantert med 3 doser øyer (50, 100 og 200 øyer per mus) som ble nylig isolert fra Smad3WT- eller Smad3KO-mus. Både tilfeldig blodsukker (RBG) og fastende blodsukkernivå (FBG) ble overvåket ukentlig i 16 uker. Transplantasjonsdosene ble valgt basert på de tidligere funnene om at transplantasjon av 300 øyer er tilstrekkelig for å gjenopprette euglykemi i celleutarmede mus raskt [10]. Som vist i figurene 1A til D utviklet de diabetiske musene med falsk operasjon vedvarende hyperglykemi over 16 uker. Transplantasjon med en lav dose (50 øyer) av Smad3KO- eller WT-øyer klarte ikke å redusere både RBG- og FBG-nivåer. Diabetiske mus som fikk 100 Smad3KO-øyer, men ikke den samme dosen av Smad3WT-øyer, gjenvunnet imidlertid gradvis normal RBG og FBG tilsvarende de som fikk 200 Smad3KO- eller WT-øyer. Vi fant også at den blodsukkersenkende effekten utelukkende tilskrives de transplanterte øyene da hyperglykemi gjentok seg umiddelbart etter at den holmebærende nyren ble fjernet fra 16 uker og utover (pil, figur 1A).
Nedsatt glukosetoleranse ble også utviklet hos de sham-opererte diabetiske musene, som ble betydelig lindret ved å transplantere den høye dosen (200) av Smad3KO- eller WT-øyer og 100 Smad3KO-øyer, men ikke med den lave dosen på 50 Smad3KO- eller WT-øyer og 100 Smad3WT-holmer (Figur 1E og G). Som forventet utviklet STZ-induserte diabetiske mus ikke insulinresistens.
I motsetning til dette ble forlenget respons på insulin observert hos hyperglykemiske mus med falsk operasjon eller ineffektiv terapi med 50 Smad3WT- eller KO-øyer og 100 Smad3WT-øyer (Figur 1F og H). I tråd med gjenvunnet euglykemi og forbedret glukoseintoleranse, viste diabetiske mus som fikk 200 Smad3KO- eller WT-øyer og 100 Smad3KO-øyer, men ikke 50 Smad3KO- eller WT-øyer og 100 Smad3WT-øyer, redusert blodnivå HbA1c-nivå 1 ledsaget av økt insulinnivå IFigur. og J). Videre forårsaket STZ-indusert diabetes veksthemming, som delvis ble gjenvunnet hos mus transplantert med 200 Smad3KO- eller WT-øyer og 100 Smad3KO-øyer (Figur S1). I tillegg utviklet STZ-induserte diabetiske mus også diabetisk nefropati ved 16 uker som demonstrert ved mesangial ekspansjon, interstitiell fibrose, proteinuri og økt serumkreatinin (figur 2). Interessant nok resulterte behandling med 100 Smad3KO-øyer, men ikke 100 Smad3WT-øyer, i beskyttelse mot utvikling av diabetisk nyresykdom, selv om dette også var bemerkelsesverdig hos diabetiske mus behandlet med den høye dosen på 200 Smad3KO- eller WT-øyer (Figur 2). Disse funnene viser en bedre terapeutisk effekt av Smad3KO-øyer på STZ-indusert diabetes og antyder omtrent 50 prosent reduksjon av øyene som trengs for å oppnå kompetent glykemisk kontroll og beskyttelse mot diabetisk nyreskade ved å bruke Smad3-mangelfull holmerstatningsterapi for diabetes.
2. Smad3KO-øytransplantasjon ga en bedre terapeutisk effekt på type-2 diabetes hos db/db-mus
Det har blitt rapportert at øytransplantasjon forbedrer T2DM i en diettforet musmodell med høyt fettinnhold utfordret med en lav dose STZ [11]. Vi undersøkte deretter om transplantasjon av Smad3KO-øyer også gir en bedre terapeutisk effekt på T2DM ved å behandle db/db-mus med 250 Smad3KO- eller WT-øyer fra pre-diabetisk alder fra uke 4 til uke 12. Vi fant at transplantasjon med enten Smad3KO eller WT øyer påvirket ikke veksten av mottaker-db/db-mus (figur S2). Selv om db/db-mus som mottok Smad3WT-øytransplantasjon viste en trendreduksjon av RBG og FBG sammenlignet med de sham-opererte db/db-musene, viste db/db-mus transplantert med tilsvarende dose av Smad3KO-øyer en signifikant reduksjon i RBG og FBG (figur 3A og B). Glukoseintoleranse utviklet i db/db-mus ble betydelig forbedret av Smad3KO, men ikke Smad3WT-øytransplantasjon, selv om insulinresistens ikke ble endret (figur 3C-F). Sammenlignet med Smad3WT-øytransplantasjon eller falsk operasjon, viste db/db-mus behandlet med Smad3KO-øytransplantasjon også en signifikant reduksjon i HbA1c-nivåer i blodet, som ble ledsaget av en merkbar økning i nivåer av blodinsulin (Figur 3G og H). Videre svekket behandling med 250 Smad3KO-øyer den glomerulære mesangiale ekspansjonen betydelig (Figur 4). Siden ingen signifikante endringer i serumkreatinin, proteinuri og nyrefibrose ble påvist hos db/db-mus i en alder av 12 uker, ble det imidlertid ikke funnet noen åpenbare endringer i disse parameterne hos db/db-mus behandlet med Smad3KO- eller WT-øyer (figur 4). Samlet indikerer disse dataene igjen at transplantasjon av Smad3KO-øyer gir en bedre behandling enn Smad3WT-øyer i type-2 diabetiske db/db-mus.
3. Smad3-mangel fremmer celleproliferasjon i de podede øyene i både STZ-induserte diabetiske mus og db/db-mus.
Vi undersøkte deretter de potensielle mekanismene der transplantasjon av Smad3KO-øyer gir en bedre terapeutisk effekt på både T1DM og T2DM. Vi undersøkte først cellemassen i de podede øyene ved immunfarging med insulin. Ved STZ-indusert diabetes klarte vi ikke å oppdage eksistensen av insulinpositive celler under nyrekapselen hos mus podet med 50 Smad3KO- eller WT-øyer i uke 16 etter transplantasjon, noe som indikerer tap av celler. Uventet viste diabetiske mus som mottok 100 Smad3WT-øyer bare noen få spredte insulinproduserende celleklynger, men dette ble i stor grad økt hos diabetiske mus behandlet med 100 Smad3KO-øyer, noe som resulterte i nesten en 17-dobling i cellemassen (figur 5A og B). Interessant nok viste diabetiske mus gitt en høy dose på 200 Smad3KO- eller WT-øyer en lignende cellemasse (figur 5A og B). Disse funnene stemte overens med den doseavhengige effekten av øytransplantasjon på hyperglykemi som vist i figur 1A og B.
Vi undersøkte deretter om den økte cellemassen i Smad3KO øytransplantater er assosiert med forbedret celleproliferasjon. Tofarget immunfluorescens viste at ved uke 16 etter øytransplantasjon, viste musene behandlet med 100 Smad3WT-øyer upåviselige eller sjeldne PCNA pluss insulin pluss-celler, som først og fremst ble økt hos de som fikk 100 Smad3KO-øyer eller en høy dose på 200 Smad3KO eller W. holmer (Figur 5C og D). Vi undersøkte deretter om Smad3 kontrollerer den tidlige celleproliferasjonen i de podede øyene under progressive diabetiske forhold ved BrdU-merking på dag 7 etter øytransplantasjon når nivåene av blodsukker forble høye. BrdU-merking avslørte en 3-dobling av BrdU pluss insulin pluss celler i 100 Smad3KO øytransplantater sammenlignet med samme dose Smad3WT øytransplantater (Figur 5E og F). Dette funnet indikerer at Smad3-mangel i stor grad fremmer celleproliferasjon gjennom S-fase-cellesyklusen under hyperglykemiske forhold, noe som bidrar til en 17-dobling av cellemassen som sett ved uke 16 etter øytransplantasjon (Figur 5A og B) . Til sammen antyder alle disse funnene at Smad3-mangel i stor grad fremmer celleproliferasjon, og gjenoppretter dermed euglykemi ved STZ-indusert type-1 diabetes.
På samme måte ble høye celleproliferative aktiviteter også påvist i Smad3KO-øytransplantater i type-2 diabetiske db/db-mus som vist ved en 5-dobling av cellemassen sammenlignet med de med Smad3WT-øytransplantater ved alder på uke 12 etter øytransplantasjon (figur 6A og B), som var assosiert med en 2.5- ganger økning i insulin pluss PCNA pluss celler (figur 6C og D). Ved å bruke BrdU-merking oppdaget vi også en 3-dobling av insulin pluss BrdU pluss-celler i Smad3KO-øytransplantater på dag 7 etter transplantasjon i 12-ukegamle db/db-mus (Figur 6E og F). Dette funnet bekrefter igjen at celler som mangler Smad3 er resistente mot hyperglykemi og forblir svært proliferative for å opprettholde cellemassen for å forbedre T2DM.
4. Smad3-mangel fremmer celleproliferasjon in vitro
Det er rapportert at farmakologisk hemming av TGFBR1 fremmer celleproliferasjon in vitro [7, 8]. Vi undersøkte derfor om den genetiske slettingen av Smad3 også fremmer celleproliferasjon ved å dyrke Smad3KO- og WT-øycellene etterfulgt av BrdU-merking. Dobbel immunfluorescens viste at øyceller som mangler Smad3 viste et betydelig høyere nivå av BrdU-positive celler (5,7 prosent) sammenlignet med Smad3WT-øyceller (2,4 prosent) (figur 7A og B). Den økte spredningen av Smad3KO-celler ble også demonstrert ved økt ekspresjon av PCNA som avslørt ved Western blot-analyse (figur 7C), som bekrefter den sentrale regulatoriske rollen til Smad3 i celleproliferasjon.
5. RNA-seq identifiserer E2F3 som et Smad3-målgen som regulerer celleproliferasjon
For å avdekke nedstrømsmekanismen til Smad3 for å regulere celleproliferasjon, utførte vi RNA-seq i øyer isolert fra db/m eller db/db mus med eller uten sletting av Smad3-genet inkludert Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m, og Smad3KO-db/m mus som tidligere beskrevet [9]. Baneanrikningsanalyse ble utført blant de differensielt uttrykte genene (DEG) mellom Smad3WT- og Smad3KO-øyer i db/m- eller db/db-bakgrunn. I den genetiske bakgrunnen til db/db resulterte Smad3KO i betydelige endringer i cellesyklusrelaterte gener eller veier som avslørt av GO- og KEGG-analyse (figur 8A og figur S3). Gitt de individuelle genene, avslørte RNA-seq-analyse en økning i ekspresjonen av gener som involverer cyclin, cyclin-dependent kinaser (CDKs) og celledelingssyklus (CDC) proteinfamilien i Smad3KO-db/db øyer sammenlignet med Smad3WT-db /db-øyer, som ble ytterligere validert i dyrkede Smad3KO-øyceller ved RT-PCR (figur S4 A og C). I kontrast, i den genetiske bakgrunnen til db/m, forårsaket Smad3KO ingen bemerkelsesverdig innflytelse på cellesyklusrelaterte gener eller veier (figur S3B og C). Det er rapportert at TGF-/Smad3-signalering negativt regulerer cellesyklusen ved å indusere de syklinavhengige kinasehemmergenene (CDKIs) [7, 8, 12]. Overraskende nok ble ingen av disse CDKI-genenes uttrykk undertrykt i Smad3KO-db/db-øyer in vivo og dyrkede Smad3KO-øyceller som avslørt av henholdsvis RNA-seq og RT-PCR (figur S4B og C). I kontrast ble ekspresjonsnivåene til flere CDKI-gener som p16, p18 og p57 til og med oppregulert i dyrkede Smad3KO-øyceller (figur S4C). Dette innebærer at det finnes en alternativ mekanisme i Smad3-regulert celleproliferasjon.
Vi analyserte dermed Smad3-bindingspotensialet for promotersekvensene til 224 DEG i GO-termen til cellesyklusen med ECR-nettleserprogramvaren (Figur 8A). Blant dem fikk et gen ved navn E2F3 vår oppmerksomhet, da det er en nøkkel og terminal eksekutør som regulerer G1/S-inngang i cellesyklusen [13, 14]. Vi fant et potensielt Smad3-bindingssted i promoteren til muse-E2F3-lokuset som også er bevart hos mennesker (figur 8B).
Cistanche tubulosa
For å undersøke om E2F3 er essensielt for Smad3-regulert celleproliferasjon, undersøkte vi sammenhengen mellom E2F3 og Smad3 i øyer. I samsvar med RNA-seq, oppdaget immunhistokjemi at ekspresjonen av E2F3 i stor grad ble redusert i øyene til Smad3WT-db/db-mus, men økt kraftig i Smad3KO-db/db-mus (figur 8C). Videre ble økt E2F3-ekspresjon også observert i dyrkede Smad3KO-øyceller på både RNA- og proteinnivåer (Figur 8 DF). Derimot opphevet adenovirus-mediert stillhet av E2F3 den proliferative aktiviteten til celler (insulinPlusBrdUPlus) i Smad3KO-øyceller (figur 9), og avslører en viktig rolle for E2F3 i Smad3-regulert celleproliferasjon.
For ytterligere å bekrefte den forutsagte bindingen av Smad3 i E2F3-promotoren, utførte vi kromatin-immunutfelling (ChIP) i isolerte museøyer (Figur 10A). Spesifisiteten til Smad3-antistoffet brukt for ChIP ble opprinnelig validert ved immunutfelling i museøyer (figur 10B). ChIP PCR bekreftet bindingen av Smad3 til E2F3-promotoren som anti-Smad3-antistoffet, men ingen ikke-spesifikk IgG-isotype presipiterte kromatinfragmentet som tilsvarer E2F3-promotoren (Figur 10C). Kvantitativ RT-PCR avslørte en 6-dobbelt anrikning av E2F3-promotersekvensen i ChIP-analysen med Smad3-antistoffet sammenlignet med IgG-isotypen (figur 10D), noe som demonstrerte at Smad3 kan binde seg til promoterregionen til det genomiske E2F3-lokuset .
For å validere den funksjonelle betydningen av Smad3-binding på E2F3-promoteren, konstruerte vi en luciferase-reportervektor drevet av en muse-E2F3-promoter som huser Smad3-bindingsstedet eller dets mutantform (Figur 10E). Dual-luciferase-analyse i HEK293T-celler avslørte en robust transkripsjon av luciferase drevet av den klonede E2F3-promotoren, som ble betydelig hemmet ved å overuttrykke Smad3. Imidlertid opphevet mutasjon av Smad3-bindingsstedet den hemmende effekten til Smad3 (figur 10F). Disse funnene ga direkte bevis for den undertrykkende rollen til Smad3 i E2F3-transkripsjon ved å binde seg til promotoren.
I denne studien viste vi at transplantasjon av Smad3-mangelfulle holmer ga en bedre terapeutisk effekt på diabetes og diabetisk nyreskade hos STZ-induserte diabetiske mus og db/db-mus. Ved STZ-indusert diabetes resulterte transplantasjon av 100 Smad3KO, men ikke 100 Smad3WT-øyer i en 17-dobling av cellemasse, som var assosiert med en signifikant økning i blodinsulinnivåer og dermed forbedret glukoseintoleranse og gjenvunnet euglykemi, noe som resulterte i i beskyttelse mot diabetisk nyreskade.
Lignende resultater ble også funnet i T2DM i db/db-mus der transplantasjon med 250 Smad3KO-øyer, men ikke den samme dosen av Smad3WT-øyer, også økte en 5-fold cellemasse og ga en bedre glykemisk kontroll. Disse funnene tyder på at Smad3-mangel er motstandsdyktig mot diabetiske mikromiljøer og i stor grad fremmer utvidelsen av podede øyceller og insulinproduksjon for å vise bedre glykemisk kontroll. Interessant nok fant vi også at behandling med 100 Smad3KO-øyer kunne gi lik glykemisk kontroll som bruken av 200 Smad3WT- eller KO-øyer ved STZ-indusert diabetes. Denne observasjonen antyder at Smad3-mangel i stor grad kan redusere (minst 50 prosent) antallet holmer som kreves for vellykket etablering av insulinuavhengighet i øycelleerstatningsterapi for T1DM. Disse funnene er i tråd med den forrige rapporten om at forbehandling av øyene med SB-431542, en hemmer av TGFBR1, fremmer spredning og funksjon av celler etter transplantasjon [15]. Men siden Smad2 også spiller en viktig rolle i den glukosestimulerte frigjøringen av insulin i celler [16], kan målretting mot Smad3, men ikke oppstrøms TGFBR1 i øyer (celler), være mer gunstig for celleerstatningsbehandling av diabetes. Dermed kan Smad3-mangelfull øytransplantasjon representere en ny terapi for både T1DM og T2DM klinisk. I tillegg kan behandling med Smad3KO-øyer også beskytte mot diabetisk nyreskade ved 16 uker med T1DM, selv om dette ikke er dyptgripende ved T2DM på grunn av den minimale diabetiske nyreskaden som oppstår hos db/db-mus i en alder av uke 12.
Mekanistisk fant vi at Smad3 fungerer ved å undertrykke E2F3 for å hemme celleproliferasjon. Dette støttes av bevisene på at E2F3-promotoren inneholder et funksjonelt Smad3-bindingssted som bekreftet av ChIP og luciferase-reporteranalyse. Øyceller som mangler Smad3 viste forbedret spredning i en E2F3-avhengig mekanisme ettersom knockdown av E2F3 opphevet denne pro-proliferative aktiviteten. E2F3 tilhører E2F-familien og er en kritisk komponent i Rb-E2F-maskineriet som styrer G1/S-cellesyklusinngang [13]. E2F-er er transkripsjonsfaktorene og de endelige utførerne for å regulere gener som orkestrerer cellesyklusfremgang [14]. Overekspresjon av E2F3 har vist seg å fremme celleproliferasjon i øyer fra gnagere og mennesker [17]. Funnene om at Smad3 transkripsjonelt retter seg mot E2F3 for å undertrykke cellesyklusen i celler, gir en ny reguleringsmekanisme for celleproliferasjon. Således fremmer forstyrrelse av Smad3 i øyceller E2F3-avhengig celleproliferasjon som demonstrert av en markant økning i insulinproduserende PCNA pluss- eller BrdU pluss-celler, noe som tyder på at behandling med en subterapeutisk dose av Smad3KO-øyer er tilstrekkelig til å utvide cellen masse og hemmer både T1DM i STZ-induserte mus og T2DM i db/db mus.
Herba CistancheogCistanche ekstrakt
Det er rapportert at TGF-signalering spiller en kritisk rolle i utvikling og funksjon av bukspyttkjerteløyer, stopper cellesyklusen og forårsaker celleapoptose ved å indusere CDKIer [7, 8, 18]. Til vår overraskelse avslørte både in vivo- og in vitro-eksperimenter at transkripsjonen av CDKI-er ikke ble endret eller til og med oppregulert i Smad3KO-øyer (Figur S4). Dette avviket kan tilskrives de forskjellige eksperimentelle forholdene. Resultatene i den nåværende studien ble hentet fra Smad3KO-mus (holmer). Imidlertid er de tidligere studiene basert på den farmakologiske hemmingen av TGFBR1, som skal påvirke hele TGF-signaleringen [7, 8]. Videre brukte vi holmeprøver fra unge voksne mus (alder på 8-10 uker), mens holmer fra relativt gamle dyr eller kadaveriske donorer fra eldre mennesker ble brukt i tidligere studier [7, 8]. Ettersom øyceller viser aldersassosiert akkumulering av CDKI-er [19], kan CDKI-er i gamle celler være mer følsomme for TGF-signalhemming.
Det var flere begrensninger i denne studien. Først blir effekten av øytransplantasjon undersøkt i den STZ-induserte diabetiske musemodellen uten autoimmun reaksjon. Derfor bør fordelen med Smad3KO fremfor Smad3WT-øyterapi for diabetes også verifiseres i en autentisk T1DM-modell i fremtiden. For det andre er funnene fra denne studien basert på helholmen, men ikke cellespesifikk Smad3KO-celleterapi. Det er uklart om andre celletyper enn celler i holmen vil utføre en Smad3-avhengig rolle for å modulere celleproliferasjon ved intercellulære krysstaleveier. Dermed er ytterligere studier med cellespesifikk Smad3KO berettiget. Videre må funn fra denne studien verifiseres i prøver fra menneskelige øyer for å bevise deres kliniske betydning.
Referanser
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinisk transplantasjon av bukspyttkjerteløyer. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Menneskelig pluripotent stamcelledifferensiering til funksjonelle bukspyttkjertelceller for diabetesbehandlinger: Innovasjoner, utfordringer og fremtidige retninger. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histologisk graftvurdering etter klinisk øytransplantasjon. Transplantasjon. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Ulike roller til TGF-beta/Smads i nyrefibrose og betennelse. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad-signalering ved nyrefibrose. Front Physiol. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Et dårlig signalnettverk regulerer spredning av øyceller. Diabetes. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibering av TGF-beta-signalering fremmer beta-celle-replikasjon i bukspyttkjertelen. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombinert hemming av DYRK1A-, SMAD- og Trithorax-baner synergerer for å indusere robust replikering i voksne menneskelige betaceller. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Smad3-mangel fremmer betacelleproliferasjon og funksjon i db/db-mus via gjenoppretting av Pax6-ekspresjon. Teranostikk. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. En metode for murin øyisolasjon og subkapsulær nyretransplantasjon. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Islet-transplantasjon forbedrer insulinfølsomheten i en murin modell av type 2-diabetes. Endokrine. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Induksjon av p16ink4a og p19ARF av TGFbeta1 bidrar til vekststopp og senescensrespons i musekeratinocytter. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Regulerer spredning under retinal utvikling. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Reguleringen av E2F av pRB-familieproteiner. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Forbigående undertrykkelse av TGFbeta-reseptorsignalering letter transplantasjon av menneskelige øyer. Endokrinologi. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2-forstyrrelse i beta-celler fra bukspyttkjertelen hos mus fører til øyhyperplasi og svekket insulinsekresjon på grunn av svekkelse av ATP-sensitiv K pluss-kanalaktivitet. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Overekspresjon av E2F3 fremmer spredning av funksjonelle humane betaceller uten induksjon av apoptose. Cellesyklus. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta familiesignalering i kontroll av celleproliferasjon og overlevelse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--fremskritt og utfordringer i menneskelig beta-celleproliferasjon. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Målrettet forstyrrelse av SMAD3 resulterer i svekket slimhinneimmunitet og redusert T-cellerespons på TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. En protokoll for øyisolasjon fra musebukspyttkjertelen. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantasjon av bukspyttkjerteløyer inn i nyrekapselen til diabetiske mus. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Sletting av Smad3 forhindrer nyrefibrose og betennelse ved type 2 diabetisk nefropati. Metabolisme. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 og Hui-Yao Lan2,7
1 Forskningssenter for integrert medisin og avdeling for nefrologi, tilknyttet sykehus for tradisjonell kinesisk medisin ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
2. Institutt for medisin og terapi, og Li Ka Shing Institute of Health Sciences, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.
3. Guangdong-Hong Kong felles laboratorium for immunologiske og genetiske nyresykdommer, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.
4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kina.
5. Nøkkellaboratorium for forebygging og behandling av kronisk nyresykdom i Zhanjiang City, Institute of Nephrology, Tilknyttet sykehus ved Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.
6. Nasjonal klinisk forskningsbase for tradisjonell kinesisk medisin, tilknyttet sykehus for tradisjonell kinesisk medisin ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.
7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Felles forskningslaboratorium for immunologiske og genetiske nyresykdommer, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.
