Del 1: En ny tilnærming for å forbedre det regenerative potensialet til sirkulerende endoteliale stamceller hos pasienter med nyresykdom i sluttstadiet

For mer info. ta kontakt medtina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Sirkulerende benmargsavledede endotelprogenitorceller (EPC) letter vaskulær reparasjon i flere organer inkludert nyrene, men reduseres gradvis i sluttstadietnyresykdom(ESKD) pasienter, som korrelerer med kardiovaskulære utfall og relatert dødelighet. Vi bestemte dermed om forbedring av de vevsreparative effektene av humane benmargsavledede mesenkymale stromaceller (BM-MSCs) med de vaskulogene effektene av rekombinant human relaxin (RLX) kunne fremme EPC-spredning og funksjon. CD34 pluss EPC-er ble isolert fra blodet til friske og ESKD-pasienter, dyrket til sent EPC-er hadde dannet seg, og deretter stimulert med BM-MSC-avledede tilstandsmedier (CM;25 prosent o), RLX(1 eller 10ng/ml), eller begge deler behandlinger kombinert. Mens RLX alene stimulerte EPC-proliferasjon, kapillærrørdannelse og sårheling in vitro, ble disse målene raskere og markant forbedret av de kombinerte effektene av BM-MSC-avledet CM og RLX i EPC-er avledet fra både friske og ESKD-pasienter. Disse funnene har viktige kliniske implikasjoner, etter å ha identifisert en ny kombinasjonsterapi som kan gjenopprette og forbedre EPC-nummer og funksjon hos ESKD-pasienter.

Nøkkelord: endoteliale stamceller; nyresykdom i sluttstadiet; benmargsavledede mesenkymale stamceller; relaxin; sårheling; angiogenese; regenerering

Klikk her for å lære mer om cistanche til salgs

1. Introduksjon

Kronisk nyre sykdom(CKD) er et globalt helseproblem, definert som en reduksjon i glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) Mindre enn eller lik 60mL/min/1,73m², som ofte fører til sluttstadiet (stadium V) nyresykdom (ESKD; definert som GFR Mindre enn eller lik 15 mL/min/1,73m2)[2]. De patologiske egenskapene til CKD inkluderer tubulær atrofi assosiert med reduksjoner i nyrekapillærer og podocytter, ødeleggelse av nyreendotelceller og utvikling avnyrefibrose[3,4]. Nyre-endotelet er kompromittert under disse prosessene, noe som fører til nedsatt angiogenese og nyrefunksjon [5]. Følgendenyreskade, benmargsavledede endotelprogenitorceller (EPCs) rekrutteres til skadesteder for å lette vevsreparasjon [6]. EPC-er spiller sentrale roller i modning og spredning av nyre-endotelceller, vaskulær integritet og reparasjon av det skadede endotelet. Imidlertid reduseres sirkulerende EPC-tall gradvis hos ESKD-pasienter [7-9], noe som korrelerer med uønskede kardiovaskulære utfall [9,10] og langtidsdødelighet.

Mesenkymale stromale celler (MSCs) har blitt rapportert å fremme angiogenese ved å stimulere EPC-programmering. Men mens MSC-er har blitt evaluert i ulike kliniske studier [13], har deres evne til å lette nyreendotelregenerering ikke blitt undersøkt. Nylige studier fra laboratoriet vårt har identifisert det forbedrede terapeutiske potensialet ved å kombinere humane benmargs(BM)-avledede MSCer med et anti-fibrotisk middel, nemlig rekombinant human(gen-2)relaksin (serelaxin; RLX[14) for å lindre nyreskader,betennelseog fibrose i prekliniske sykdomsmodeller. Selv om RLX alene kan stimulere humant blodavledet EPC-proliferasjon og nitrogenoksid (NO)-produksjon in vitro, og vaskulogenese hos mus in vivo[18], er det fortsatt ukjent om dets kombinerte effekter med BM-MSC-er kan akselerere og/eller forbedre EPC- avledet angiogenese og sårheling. Denne studien evaluerte dermed det terapeutiske potensialet ved å kombinere RLX og BM-MSC-avledet betinget media (CM) på sunn versus ESKD pasientavledet EPC-proliferasjon, angiogenese og sårheling in vitro.

2. Materialer og metoder

2.1.EPC-isolering og kultur fra perifert blod

Etter mottak av et signert samtykkeskjema for pasienter ble det samlet inn rundt {{0}} mL blod fra friske mannlige kontroller fra Australian Red Cross Blood Service. I motsetning til dette ble bare ~5 ml maksimalt av blodet til mannlige ESKD-pasienter samlet inn fra Monash Medical Center på grunn av deres helsetilstand. Alle blodprøver ble behandlet innen 24 timer etter innsamlingstiden. Alle blodprøver ble fortynnet med 1× Hanks balanserte saltløsning (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) til et totalt volum på 20 ml. Deretter ble blodet forsiktig lagt over 15 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) i et 50 ml Falcon-rør (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og sentrifugert ved 400× g i 40 minutter ved romtemperatur for å skille buffy coaten fra andre komponenter ved å bruke en tetthetsgradientseparasjonsmetode som tidligere beskrevet [19,20]. Etter gradientseparasjonen ble det øvre laget som inneholdt plasma og blodplater fjernet ved forsiktig å sette inn en serologisk pipette, slik at buffy coaten som inneholdt mononukleære celler fra perifert blod (PBMCs) ble stående uforstyrret, bestående av endoteliale stamceller (EPC). Pelleten ble resuspendert i 2 ml Endothelial Cell Growth Media (EGM)-2 Microvascular (MV) Bullet Kit (produkt #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); supplert med 5 prosent føtalt bovint serum (FBS), 0,04 prosent hydrokortison, 0,4 prosent human fibroblast growth factor (hFGF) og 0,1 prosent av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), R3-insulinlignende vekstfaktor (IGF) )-1, askorbinsyre, human epidermal vekstfaktor(hEGF) og gentamicinsulfat/amfotericin(GA-1000), til dyrking av isolerte EPC-er. Cellene ble talt ved å bruke en CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) før de ble sådd på fibronektinbelagte kulturplater/kolber.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 celler/koloni) ved å bruke analysen kolonidannende enhet (CFU).

2.2. Fremstilling av kondisjonert media (CM) fra Cultured BM-MSC

Siden tillegg av BM-MSC-er til EPC-kulturer ville kompromittere de EPC-assosierte endepunktene som skulle måles, ble det bestemt at det ville være bedre å analysere effekten av BM-MSC-avledet CM på EPC-funksjonen, som tidligere brukt for analysen av andre endepunkter [19]. Kort fortalt ble BM-MSC dyrket i Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia), supplert med 16 prosent føtalt bovint serum (FBS) og 1 prosent 200 mM L-glutamin, og 1 prosent penicillin/streptomycin. Så snart cellene nådde ~80 prosent konfluens, ble BM-MSC-er sub-dyrket videre og sådd ut i en 12-brønnplate med en tetthet på ~0,5×10 grader per brønn og holdt i kultur i 24-48 timer for å sikre mobiltilknytning. For å fremstille kondisjonerte medier (CM) fra BM-MSCs, ble cellene kort vasket tre ganger med forvarmet 1 ml 1 × HBSS. Etter vasketrinnene, 500 μL serum og vekstfaktor-fri endotelcelle basal media (EBM; Produkt #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) ble tilsatt til cellene og holdt i kultur ved 5 prosent CO, 37 grader i ytterligere 24 timer. På slutten av denne inkubasjonsperioden ble CM deretter samlet og sentrifugert ved 400 x g i 10 minutter for å fjerne eventuelle cellulære rusk. CM i 500 μL alikvoter ble lagret ved -80 grad til fremtidig bruk.

2.3. Funksjonelle analyser

2.3.1. Behandling av dyrkede sene EPC-er

Når de sene EPC-ene ble høstet, ble funksjonelle analyser utført. Alle eksperimenter ble utført i avsnitt 3-6. Funksjonelle analyser ble utført for å undersøke effekten av (i)25 prosent BM-MSC-avledet betinget media (25 prosent CM)[20];(ii)1 [RLX-1] eller 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX(representerer sirkulerende nivåer av H2-relaxin funnet hos gravide kvinner [21]); eller (i) de kombinerte effektene av 25 prosent CM og 1 eller 10 ng/mL RLX; (iv) 20 prosent FBS ble brukt som en positiv kontroll på spredning og tubedannelse (angiogenisk) potensialet til de sene EPC-ene avledet fra kontrollpasienter . Behandlingsgrupper ble sammenlignet med ubehandlede celler.

2.3.2. Levedyktighets- og spredningsanalyse

Levedyktigheten og spredningspotensialet til de sene EPC-ene ble bestemt ved å bruke {{0}}(4,5-dimethylhiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia). Kort fortalt ble ~5×103 celler per brønn sådd i 96-brønnplater (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia), deretter ble cellene behandlet med BM-MSC-avledet CM, RLX(10 ng/ mL), eller en kombinasjon av CM og RLXat 1 eller 10ng/ml i 24 timer. På slutten av inkubasjonsperioden ble 10 μL MTT-merkingsreagens tilsatt (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) og inkubert ved 37 grader Cand 5 prosent CO2 i ytterligere 4 timer. Cellene ble solubilisert ved tilsetning av 100 μL av solubiliseringsløsningen (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia), og spredningspotensialet til de sene EPC-ene ble bestemt ved å måle absorbansen til hver prøve ved 590 nm ved bruk av en mikroplate leser (Bio-strategi, Balwyn North, VIC, Australia) og analysert med SoftMax Pro-programvare for Windows OS (ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Hver av behandlingsgruppene ble utført og analysert i seks replikater.

2.3.3. Rørdannelsesanalyse

Effektene av de forskjellige behandlingene for å fremme det angiogene potensialet til de sene EPC-ene, ved bruk av en rørdannelsesanalyse, ble bestemt ved å bruke μ-angiogeneseanalysen (Abidi, Fitchburg, WI, USA). Kort fortalt ble 10 μL vekstfaktor-redusert (GFR) Matrigel (Produkt #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) tilsatt i den indre brønnen av μ-slide av angiogenese-analysesettet (Abidi, Fitchburg, WI, USA). ). Sammenflytende kulturer av de sene EPC-ene ble sådd på de belagte cellene og behandlet med BM-MSC-avledet CM, RLX (10 ng/mL), eller en kombinasjon av CM og RLX ved 10 ng/mL. Et totalt volum på 50 μL cellesuspensjon inneholdende ~1 × 104 celler ble påført hver brønn. Bildene ble umiddelbart tatt og merket som 0-timetidspunktet. Evnen til cellene under ulike behandlinger til

formrør ble observert og bilder ble tatt 2-24 timer etter cellesåding ved bruk av et lysmikroskop. Antall rør, rørlengde og antall forgreningspunkter ble bestemt ved å bruke ImageJ-programvaren.

2.3.4. Sårhelingsanalyse

Effektene av de forskjellige behandlingene på det regenerative potensialet til de sene EPC-ene ble bestemt ved bruk av en sårhelingsanalyse. For å utføre analysen ble ~1 × 10 celler suspendert i 50 μL vekstmedier og sådd inn i 2-brønns silikon i 35 mm skål for sårhelingsanalyse (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Kunstige sår i skålene ble skapt ved å forsiktig fjerne silikonbrønnene ved hjelp av en steril pinsett (mellomromsavstand=500±100μm). Skålene ble etterfylt med 2 mL 50 prosent EGM-2, med tillegg av forskjellige behandlinger inkludert BM-MSC-avledet CM, RLX(10 ng/ml), eller en kombinasjon av CM og RLX ved 1 eller 10ng/ml. Antall celler som migrerte for å lukke såret ble vurdert ved bruk av lysmikroskopi. Mikrofotografier av migrerte celler ble fanget opp 0-24 timer etter behandling. Prosentandelen av gapet lukket område ble bestemt ved hjelp av Image]-programvaren.

2.3.5.Bildeanalyser

Alle bildeanalyser for funksjonsanalysene ble utført ved bruk av ImageJ for MacOS (ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). For rørdannelsespotensialet til de sene EPC-ene ble bildene analysert ved bruk av angiogenese-analyseplugin, og fire forskjellige parametere ble registrert inkludert total lengde, antall masker, antall kryss og antall grener. For sårhelingsanalysen ble sårlukkingsområdet analysert ved å manuelt merke det cellefrie området ved hvert av tidspunktene. Alle målinger ble utført minst 3 ganger for å kontrollere for variasjon.

2.3.6. Immunfluorescens

Relaxin Family Peptide Receptor 1 (RXFP1; den beslektede RLX-reseptoren) proteinlokalisering i dyrkede sene EPC-er ble bestemt ved bruk av immunfluorescensfarging. For det første ble ~1×1{{20}} graders celler dyrket på et 13 mm dekkglass (belagt med poly-D-lysin) i en 12-brønnplate fiksert i 4 prosent PFA for 15 min ved romtemperatur. De fikserte cellene ble blokkert for ikke-spesifikk proteinbinding ved bruk av 1 prosent bovint serumalbumin (BSA) i 60 minutter ved romtemperatur. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene vasket i PBS i 5 minutter (3 ganger) og inkubert med et kanin polyklonalt RXFP1-antistoff (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Tyskland ) i 0,01 prosent BSA over natten ved 4 grader. Cellene ble vasket med PBS og inkubert med geit-anti-kanin Alexa-fluor 594 sekundært antistoff (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) i 0,01 prosent BSA i 2 timer ved romtemperatur. Kjernefysisk motfarging ble utført ved å tilsette 40 μL DAPI i Vectashield-monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og dekkglass. Immunoreaktivt RXFP1-protein ble visualisert ved hjelp av et fluorescensmikroskop ved × 40 forstørrelse (Olympus BX51) og bildene ble slått sammen ved hjelp av ImageJ-programvare.

2.4. Statistiske analyser

Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM og alle statistiske analyser ble utført ved bruk av GraphPad Prism'M (ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). En way-ANOVA ble brukt for å sammenligne effekten av ulike behandlinger på proliferasjon (MTT-analyse) og angiogent (rørdannelsesanalyse) potensial for de sene EPC-ene, etterfulgt av en Tukey's post-hoc-test for å tillate flere sammenligninger mellom behandlingsgruppene. En gjentatt måling-toveis-ANOVA ble brukt for å sammenligne effekten av de ulike behandlingene på sårlukking av de sene EPC-ene over tid, etterfulgt av Tukeys post-hoc-test for å sammenligne hver av behandlingsgruppene. En p-verdi på mindre enn 0.05 ble ansett som statistisk signifikant.