Del 2: Bioaktive forbindelser fra Ephedra Fragilis: ekstraksjonsoptimalisering, kjemisk karakterisering, antioksidant- og antiglykasjonsaktiviteter
Mar 26, 2022
For mer info. ta kontakt medtina.xiang@wecistanche.com
2.7.Antiglykeringsaktivitet
2.7.1.UV-synlig analyse
UV-vis-spekteret er en rask, konsistent og enkel teknikk som vanligvis brukes for å oppdage proteinkonformasjonsendringer og kompleksdannelse. Absorpsjonsspektra for nativ og glykert BSA inkubert i 15 dager i nærvær eller fravær av CEE/fraksjoner samtquercetin(positiv kontroll) er presentert i figur 3A.
Det ble tydelig vist at den native BSA viser en karakteristisk topp ved 入2s0 nm, som hovedsakelig skyldes de aromatiske aminosyrene, inkludert tyrosin, tryptofan og fenylalanin [47].
Ved modifikasjon med glukose var absorbansen ved λ280 nm 60,57 prosent mer hyperkrom enn naturlig BSA. Den økte absorpsjonsintensiteten ved 入2s0 nm kan tilskrives den glykasjonsinduserte utfoldingen av proteinhelixen, som kan påvirke dens normale fysiologiske funksjon.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, som var 1.82,1.71,1.57,1.35,1.28 og 1.13-gang lavere enn glykert BSA. Likevel var denne aktiviteten markant lavere enn forquercetinbrukes som en positiv kontroll (2.24- ganger lavere enn glykert BSA). Så det kan tydelig konkluderes fra absorpsjonsstudier at EAF fra E.fragilis har en beskyttende effekt mot BSA-utfoldelse indusert av proteinglykering.
2.7.2. Hemming av proteinglykering i BSA-Glu-modellen
AGE er en heterogen gruppe forbindelser med fluorescensegenskaper ved λ440 nm når de eksiteres ved ± 370 nm. Evnen til CEE og dets forskjellige fraksjoner fra E. fragilis til å hemme AGE-dannelsen ble evaluert ved å bruke BSA-glukoseanalysen, og resultatene er presentert i figur 3B.
Som vist fra figur 3B, viste AGEs-hemmingshastigheten for alle testede prøver en oppadgående trend med økningen av konsentrasjoner. Ved 1 mg/ml hemmet CCE, HE, DME EAE, WBF, WF og quercetin AGE-dannelsen med henholdsvis 53.26,39.83,54.82,76.68,69.09.48.83 og 97.84 prosent etter kubasjon, hhv. i 15 dager. EAF(ICs =0.375±0.034 mg/ml) var den mest effektive AGE-hemmeren blant alle fraksjoner, etterfulgt av WBF, DMF, CCE og WF med IC5 0 verdier på 0.595 ± {{30}}.047, 0.857 ± 0.018, 0.951 ± 0.099 og 1.044± 0,032 mg/ml, henholdsvis. HF viste den svakeste aktiviteten med ICso-verdien på 1,212±0,063 mg/ml.
Høydenantiglykeringpotensialet til EAF kan skyldes den høye mengden fenol- og flavonoidinnhold, som har blitt beskrevet som svært gode hemmere av AGE-dannelse [48]. Høyere antiglysering av EAF av Liquidambar formosana Hance bladekstrakt ble også rapportert av Zhang et al. [31] sammenlignet med diklormetan-, n-butanol- og vannfraksjonene.
Som gitt i tabell 5 var AGEs-hemming sterkt korrelert på en positiv måte til både TF(r=0.950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914,r=0.983, r=0.975,r=0.923,og r=0.963 (s.<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">fjerning av frie radikalerogantioksidantkapasiteter.
2.7.3. Effekter på glykeringsindusert proteinoksidasjon
Glykering av proteiner (Maillard-reaksjon) er en reaksjon startet av den kovalente bindingen av reduserende sukker til en aminogruppe av proteiner (hovedsakelig lysin- og argininrester), som fører til å produsere et ustabilt og reversibelt produkt, dvs. Schiffs base som videre gjennomgår Amadori-omorganisering for å danne mer stabile ketamins navngitte Amadori-produkter. Deretter gjennomgår Amadori-produkter en endiol-reaksjon for å produsere karbonylerte proteiner [48]. Nedbrytningen av dette ketaminet kan genererefrie radikalerslik som superoksidradikaler, som videre omdannes til HO·via Fenton-reaksjon, forårsaker oksidativ og cellulær skade [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
Effektene av CEE/fraksjoner på glykasjonsindusert proteintioloksidasjon er presentert i figur 3D. I naturlig BSA var nivået av proteintiol 1.06± 0.086nmol/mg protein, som ble redusert med mer enn tre ganger(0 0,34±0,021 nmol/mg protein) i glykert protein. I nærvær av CEE/fraksjoner ble nivået av tiolgruppen betydelig økt på en doseavhengig måte fra 0,1 til 1 mg/ml. Dessuten økte nivået av proteintiol i følgende rekkefølge: HF<><><><>
Lignende resultater ble observert i planten Teucrium polium siden EAF var mer effektiv enn de andre fraksjonene (dietyleter og vannfraksjoner) mot glykasjonsmediert proteinoksidasjon [51]. I sin studie rapporterte Golshahi og Bahramikia [52] også lignende resultater ved bruk av flere løsemidler med økende polaritet (dietyleter og vann) i spaltningen av en medisinplante Trachyspermum copticum. I følge disse forfatterne har EAF den mest potente beskyttende effekten mot glykasjonsmediert proteinoksidasjon, fjernt etterfulgt av dietyleter og vann. Dette demonstrerer tilstedeværelsen i EAF av slike forbindelser som kan ha en forebyggende effekt mot hyperglykemi-induserte oksidative skader på protein, som antas å skje under glyoksidasjonsprosessene ved å redusere proteinkarbonyldannelse og beskytte proteintioler mot oksidasjon som antydet av data.
2.8. Identifiserte fenoliske forbindelser i EAF
EAF, som viste den høyeste biologiske aktiviteten fra andre fraksjoner, ble valgt for identifisering av de viktigste bioaktive forbindelsene ved hjelp av RP-HPLC. Et totalt antall på seks forbindelser ble identifisert ved å sammenligne deres retensjonstid med referansestandardene. De identifiserte fenoliske forbindelsene er presentert i figur 4. Galliske, vanilliske, koffeinsyrer og ferulsyrer ble identifisert som fenolsyrer, mens bare to forbindelser, nemlig rutin og quercetin, ble identifisert som flavonoider. Ifølge en studie av Soumaya et al. [53], ferulinsyre, luteolin-7-O-glukosid, myricetin og kaempferol 3-O-rutinosid ble identifisert som tilstede i EAF i luftdeler av tunisisk E.fragilis, mens tilstedeværelsen av rutin , quercetin, gallussyre og koffeinsyre ble bare oppdaget for første gang i vår studie. Ulikheten i den kjemiske sammensetningen til EAF oppnådd fra samme planteart kan variere i forskjellige deler av en plante, planteutviklingsstadiet, vekstforholdene (f.eks. jord, lys, temperatur, vann, fuktighet og gjødsel), høstetid, tørkesystemet og ekstraksjonsprosedyren [54]. De oppnådde resultatene fra den fytokjemiske fingeravtrykksprofilen viste en god mengde E.fragilis som hadde flere fenoliske forbindelser som anses som viktige bidragsytere til frie radikaler og antioksidantaktiviteter [55]. I tillegg er disse forbindelsene kjent for deres kraftige antiglykeringsevne [48]. Flere studier har avslørt den direkte sammenhengen mellom antioksidantaktivitetene til fenoliske forbindelser og deres antiglykeringsevne.
2.9. Molekylær dokkingstudie av identifiserte forbindelser
For å tydelig visualisere den detaljerte mekanismen som de identifiserte forbindelsene i EAF av E. fragilis binder med BSA og RAGE, utførte vi en molekylær docking-studie. Dokkingresultater er presentert i tabell 6, mens interaksjoner mellom den mest aktive forbindelsen og målene er vist i figur 5. Resultatene viste at quercetin passet tett inn i bindingsstedet, lokalisert i det hydrofobe hulrommet til subdomene IB av BSA med den laveste bindingsenergien på{ {2}}.7 kcal/mol (Figur 5A). I motsetning til dette ble mindre bindingsenergi oppnådd med ferulinsyre, vanillinsyre, koffeinsyre, gallussyre og rutin (-6.35,{{7} }.05, -5.84,-5.25 og -4.41 kcal/mol, henholdsvis). Vanligvis er en høy grad av negativitet av bindingsenergi mer effektiv, og forbindelsen vil bli brukt til å kontrollere glykeringsprosessene. Fra figur 5B er det klart at quercetin danner åtte hydrogenbindinger med SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 og ARG458 av BSA, og fire hydrofobe interaksjoner mediert av de alifatiske aminosyrene (L4)1414,414,4,4) . Fire aminosyrer (ASP108, HIS145, LEU189 og LEU462) som omgir quercetin samhandlet også via van der Waals krefter. Det er rapportert at lysin og arginin er de viktigste aminosyrerestene som er involvert i glykeringsprosessen [56]. Derfor kan maskering av quercetin til lysin- og argininrester være en av de mulige mekanismene til E. fragilis for å hemme proteinglykering i et innledende stadium.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
Engasjement av AGEs-produkter med RAGE er kjent for å utløse, gjennom ROS-dannelse via NADPH-oksidase og mitokondrier [57], aktivering av flere intracellulære signalveier (inkludert JAK/STAT, fosfoinositol-3-kinase, rho GTPaser, SAPK/INK MAP-kinaser, p38 og erk1/2 (p44/p42) MAP-kinaser), og kulminerte i aktiveringen av NF-kB-transkripsjonsfaktorene [58], noe som fører til patogenesen av diabetes og aldringsassosierte lidelser [5]. Derfor kan blokkering av AGEs-RAGE-interaksjoner undertrykke stress-provoserende signaloverføring, som anses som en terapeutisk strategi for å hemme glykering på et senere stadium. Dokkingresultater med RAGE, som vist i tabell 6, viste at gallussyre har den høyeste dokkingscore (G=-6.8 kcal/mol) sammenlignet med de for vanillinsyre, ferulinsyre, koffeinsyre, quercetin og rutin(-6.68,-5.94,-5.89,-5.58 og -4,89 kcal/mol, henholdsvis). Dessuten viste 2D-modellering av gallussyre og RAGE at gallussyre dannet fem konvensjonelle hydrogenbindinger med CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 og SER83 av RAGE (Figur 5C, D). LYS37 og LYS43 var også ansvarlige for de hydrofobe interaksjonene mellom gallussyre og RAGE. Fem aminosyrer som omgir gallussyre (GLU32, LYS39, PR042, ASN81 og GLY82) ble festet av van der Waals krefter, og stabiliserte dermed gallussyre-RAGE-komplekset ved å gi et sterkt sammenhengende miljø. Oppsummert har den nåværende studien vist at den effektive interaksjonen mellom visse bioaktive forbindelser i EAF til E. fragilis med målproteinene til BSA og RAGE.E.fragilis kan være en kilde til potensielle konkurrenter til glukose og AGE, som kan motstå deres binding mot henholdsvis BSA og RAGE, og reduserer derfor den påfølgende utviklingen av oksidativt stress og betennelse (Figur 6).
3. Materialer og metoder
3.1. Kjemikalier og reagenser
22-azinobis-(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre)(ABTS), butylert hydroksy-toluen (BHT), natriumazid, guanidinhydroklorid, tween-40,1,{ {7}}difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin Ciocalteau-reagens, -karoten, linolsyre, glukose, 2,4-dinitrofenylhydrazin(DNPH),5,5'-Dithiobis-({{16 }}Nitrobenzoic Acid)(DTNB), ammoniummolybdat og polyfenolstandarder ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hydrogenperoksid (H2O2) ble kjøpt fra Fluka (Basel, Sveits). Aluminiumklorid (AICl3), natriumkarbonat (NazCO3), jern(III)klorid (FeCl3), kaliumpersulfat (K2S2Os), kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6), svovelsyre og alle løsningsmidler ble hentet fra Merck Life Science (Darmstadt, Tyskland) ). Askorbinsyre og trikloreddiksyre (TCA) ble oppnådd fra Scharlau (Barcelona, Spania).
3.2. Plantematerialer
E. fragilis (luftdeler) ble samlet inn fra Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Marokko (breddegrad, 30 grader 24'0"N; lengdegrad,9 grader 12'36"W) i løpet av mai 2019. Det ble identifisert av professor Najat ELKHIATI, en botaniker fra vårt institutt, hvor en samling av kupongprøver ble deponert. Planten ble skylt med destillert vann, lufttørket, pulverisert i en blender og lagret ved 49C frem til bruk.
3.3.Eksperimentell design
3.3.1.Valg av variabler
Mange parametere er kjent for å ha betydelige effekter på ekstraksjon av fenoliske forbindelser, slik som type løsningsmiddel, løsningsmiddelkonsentrasjon, ekstraksjonstid og ekstraksjonstemperatur [59]. Ulike løsningsmidler som aceton, metanol og etanol er egnet for ekstraksjon av forskjellige fenoliske forbindelser [16], men etanol ble valgt som løsningsmiddel i denne studien, på grunn av dens spiselige sikkerhet og grønne produksjon [60]. Derfor ble alle faktorer, inkludert etanolkonsentrasjon (X), ekstraksjonstemperatur (X2) og ekstraksjonstid (X3) valgt som variabler.
3.3.2. BBD for ekstraksjonsoptimalisering
En optimaliseringsprosedyre ble utviklet ved bruk av RSM for å bestemme effekten av ekstraksjonsfaktorer og velge de optimale eksperimentelle ekstraksjonsforholdene for fenolforbindelsen E. fragilis. En tre-nivå, tre-faktor BBD ble utført for å undersøke virkningen av tre uavhengige faktorer inkludert X1 (etanolkonsentrasjon, prosent), X, (ekstraksjonstemperatur, grad) og X3 (ekstraksjonstid, h) på TP- og TF-innhold av E, fragilis-ekstrakter [17]. For optimaliseringsformål ble et totalt antall på 15 forsøk inkludert tre midtpunkter utført tilfeldig (tabell 1). Basert på vårt foreløpige enkeltfaktoreksperiment (data ikke vist), ble alle variabler satt på tre nivåer (-1,0 og pluss 1), med X,(40,60 og 80 prosent ), X ,(25,42,5 og 60 grader), og X3(6, 15 og 24 timer)(tabell 1). Følgende andreordens polynomligning (ligning (1)) ble brukt for å passe til responsvariablene:
hvor Y er den forutsagte responsen; o, ; jeg og ; er regresjonskoeffisientene for henholdsvis avskjærings-, lineære, kvadratiske og interaksjonsledd; og X;, og X; er de uavhengige variablene (i ≠ j).
3.3.3. Utvinningsprosedyre
Den pulveriserte prøven (10 g) ble ekstrahert ved maserasjonsmetode i en beregnet etanolkonsentrasjon (40-80 prosent ;1:10, w/v), ved varierende temperaturer (25-60 grader ) i forskjellige perioder ({ {5}} h) på en orbital shaker inkubator (160 rpm). Gaze og Whatman filterpapir nr. 1 ble brukt for å fjerne den uløselige massen. Filtratet ble deretter tørket ved 40 grader under lavt trykk ved bruk av R-3 Rotavapor(Büchi) for å gi det rå etanoliske ekstraktet (CEE).
3.4. Fraksjonering av CEE oppnådd under optimale forhold
CEE oppnådd under optimale betingelser ble oppløst i destillert vann (100 ml), og væske-væske-ekstraksjon ble utført med forskjellige løsemidler med økende polaritet for å gi heksanfraksjon (HF, 3 × 100 ml), diklormetanfraksjon (DMF, 3 × 100 ml), etylacetatfraksjon (EAF.3×100 ml), en vannmettet n-butanolfraksjon (WBF, 3×100 ml),
og den gjenværende vannfraksjonen (WF). Disse fraksjonene ble deretter filtrert og tørket som beskrevet ovenfor, og ekstraksjonsutbyttet ble registrert i henhold til ligning (2):
Were Wo og W er vekten av tørkede CEE/fraksjoner og startvekten av E.fragilis-pulver; hhv.
3.5. Fytokjemisk analyse
De spektrofotometriske teknikkene som brukes for å evaluere det fytokjemiske innholdet av E. fragilis-ekstrakter er beskrevet i tilleggsmaterialene [61,62].
3.6. Biologiske aktiviteter
Detaljer om antioksidanttestene [43,63-67] og antiglykeringsaktivitetene [68-70] in vitro ble gitt i tilleggsmaterialene.
3.7.RP-HPLC Analyse av EAF
Analyse av fenoliske forbindelser i EAF ble utført med Agilent 1100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) utstyrt med en ZORBAX Eclipse SB-C18 omvendt-fase analytisk kolonne på 100×4 mm og 3,5 um partikkelstørrelse [71]. Kolonnetemperaturen ble holdt konstant på 48 grader. Isokratisk eluering med acetonitril, 0,1 prosent eddiksyre i vann (12:88, v/v) som mobil fase, og 1 ml/min strømningshastighet sikret god separasjon av polyfenoler i EAF til E.fragilis. Det injiserte volumet var 10 μL og kromatogrammene ble målt ved 330 nm. Retensjonstidene for fenoliske forbindelser i EAF ble sammenlignet med de for rent tilgjengelige standarder for å identifisere dem.
3.8. Molekylær dokking
AutoDock Tools (ADT) versjon 1.5.6 ble brukt til å utføre en molekylær docking-studie. SDF-format av alle forbindelser ble hentet fra PubChem-databasen og deretter konvertert til 3Dpdb-fil ved bruk av Open Babel GUI (versjon 2.4.1). Krystallstrukturene til BSA(PDB ID:4ORO) og RAGE(PDB ID:4LP5) ble samlet inn fra RCSB Protein Data Bank (PDB). Kort fortalt ble proteinene først forberedt for dokking ved (i) å fjerne alle heteroatomer og vannmolekyler, (i) tilsette polare hydrogenatomer og (ii) tildele Kollman-ladninger. Rutenettkassedimensjonen ble satt til x{{10}},y=126,z=126 og x=80,y=80.Z{{ 15}} med rutenettsenter på×=8.415,y=21.626,z=106.57 andx=37.98,y=-43.581 ,z=9.371 med en rutenettavstand på 0,375A opprettet rundt bindingsstedet til henholdsvis BSA og RAGE. Dokkingprogramvaren ble kjørt 100 ganger ved hjelp av Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) for å finne den beste bindingsposisjonen. Liganden med lavest bindingsenergiscore ble valgt for videre undersøkelse. Discovery Studio-programvareversjon 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, USA) ble brukt for å visualisere dokkingresultater.
3.9. Statistisk analyse
Design-Expert programvareversjon 119 (Stat-Ease Inc., og Minneapolis, MN, USA) ble brukt til å utføre RSM. Dataanalyse ble utført ved enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Duncans post-hoc-test ved bruk av SPSS 26.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4. Konklusjoner
RSM med en BBD ble brukt for å sette de optimaliserte parameterne for utvinning av de bioaktive forbindelsene fra den marokkanske medisinske urten E. fragilis. Den optimale etanolkonsentrasjonen, ekstraksjonstemperaturen og ekstraksjonstiden ble forutsagt for maksimum
ekstraksjonsutbytte av fenoliske forbindelser og viste seg å være henholdsvis 61,93 prosent, 44,43 grader C og 15,84 timer. CEE oppnådd under optimale ekstraksjonsforhold og dets forskjellige fraksjoner ble analysert for deres TP- og TF-innhold, samt deresantioksidantog antiglykeringsaktiviteter. EAF-fraksjonen viser det høyeste TP- og TF-innholdet og de sterkeste antioksidantaktivitetene sammenlignet med andre fraksjoner. Evalueringen av flere biomarkører som UV-vis absorpsjonsspektrum, spesifikk AGEs fluorescens, karbonylinnhold og frie tioler gruppe, viste også den største beskyttende effekten av EAF mot glykering mediert av glukose. Videre ble det observert en signifikant positiv sammenheng mellom antioksidantkapasiteten til fenoliske forbindelser og deres antiglykerende aktiviteter. Dette indikerer at fenolforbindelser kan være de viktigste dominerende komponentene som er ansvarlige for både antioksidant- og antiglykeringsaktiviteter. De bioaktive forbindelsene i EAF ble karakterisert ved RP-HPLC-analyse og et totalt antall på seks forbindelser ble identifisert. I silico molekylær docking-analyse viste også en effektiv interaksjon mellom quercetin og gallussyre med henholdsvis BSA og RAGE som målproteiner. Samlet antyder denne studien at E.fragilis kan være en potensiell kilde til naturlige bioaktive forbindelser med kraftige antioksidant- og antiglykeringsaktiviteter og bør brukes i behandling og forebygging av aldring og glykasjonsassosierte komplikasjoner. Ytterligere studier på isolering av bioaktive forbindelser og farmakologisk screening (dvs. cytotoksisitetsstudie) må utføres for å utforske fytokjemien og virkningsmekanismene til de farmakologiske egenskapene til E. fragilis.
Referanser
1. Martins, N.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, M.; Ferreira, ICFR avkok, infusjon og hydroalkoholisk ekstrakt av dyrket timian: antioksidanter og antibakterielle aktiviteter, og fenolisk karakterisering. Food Chem. 2015, 167, 131–137. [CrossRef]
2. Deetae, P.; Parichanon, P.; Trakunleewatthana, P.; Chanseetis, C.; Lertsiri, S. Antioksidant- og anti-glykeringsegenskaper til thailandsk urtete sammenlignet med konvensjonell te. Food Chem. 2012, 133, 953–959. [CrossRef]
3. Yao, Q.; Liang, Y.; Shao, Y.; Bian, W.; Fu, H.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, B.; Li, M. Avansert glykeringssluttproduktkonsentrasjoner i follikulærvæske hos kvinner som gjennomgår IVF/ICSI med en GnRH-agonistprotokoll. Reprod. Biomed. Online 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]
4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, M.; Weber, D.; Höhn, A.; Grune, T. Advanced-Glycation-End-Product-Induced Formation of Immunoproteasomes: Involvering of RAGE og Jak2/STAT1. Biochem. J. 2012, 448, 127–139. [CrossRef]
5. Meenatchi, P.; Purushothaman, A.; Manneemegalai, S. Antioxidant, Antiglycation and Insulinotrophic Properties of Coccinia Grandis (L.) in Vitro: Mulig rolle i forebygging av diabetiske komplikasjoner. J. Tradit. Komplement. Med. 2017, 7, 54–64. [CrossRef] [PubMed]
6. Nakagawa, T.; Yokozawa, T.; Terasawa, K.; Shu, S.; Juneja, LR Beskyttende aktivitet av grønn te mot frie radikaler- og glukosemediert proteinskade. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2418–2422. [CrossRef] [PubMed]