Innhold av fenolforbindelser og genetisk mangfold på populasjonsnivå over det naturlige utbredelsesområdet for bjørnebær (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) på den iberiske halvøy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:Bjørnebær (Arctostaphylos uva-ursi) er en medisinplante som tradisjonelt brukes til behandling av urinveisinfeksjoner på grunn av det høye innholdet avarbutin(hydrokinon -D-glukosid), som nå hovedsakelig brukes som et naturlig hudblekende middel i kosmetikk. Bearberry har også blitt foreslått som en naturligantioksidantadditiv på grunn av det høye innholdet av fenoliske forbindelser i bladene. Vi studerte variasjonen på fenoliske forbindelser i 42 ville populasjoner av bjørnebær, med sikte på å avklare om iboende biologiske, klimatiske og/eller geografiske faktorer påvirker fenolinnholdet over dens naturlige distribusjon på den iberiske halvøy. Bjørnebærblader ble samlet i løpet av høsten over en treårsperiode (2014–2016) i bestander over en breddegrad og høydegradient. Metanolekstrakter viste et bredt spekter av variasjoner i totalt fenolinnhold, og forskjellige fenolprofiler mht.arbutin(nivåene av denne hovedbestanddelen varierte fra 87 til 232 mg/g dr wt), men også innholdet av katekiner og myricetin, som ble påvirket av geografiske og klimatiske faktorer. Moderate nivåer av variasjon på genomstørrelse - vurdert ved flowcytometri - og på to plastid-DNA-regioner ble også påvist blant populasjoner. Genetisk og cytogenetisk differensiering av populasjoner var svak, men signifikant assosiert med fytokjemisk mangfold. Elite bjørnebærgenotyper med høyereantioksidantkapasitet ble deretter identifisert.

Nøkkelord: arbutin; genetisk og fytokjemisk variasjon; genomstørrelse; haplotyper; naturligantioksidanter

cistanche er naturlige antioksidanter

1. Introduksjon

Syntesen av plantespesialiserte metabolitter varierer i tid (dvs. ontogeni, fenologi og indusert forsvar), og rom, da den spiller en avgjørende rolle i plantens tilpasning til miljøforhold, mens også genetisk variasjon står for kjemikalier [1]. Blant disse forbindelsene har fenol et mangfoldig utvalg av mono- og polymere strukturer som oppfyller et bredt spekter av fysiologiske roller [2]. Biosyntesen av spesialiserte metabolitter er sterkt påvirket av miljøfaktorer som temperatur, nedbør eller solstråling, som igjen ofte blir utsatt for breddegradienter, langsgående eller høydegradienter. Spesielt er akkumulering av fenoliske forbindelser en generell respons på økte nivåer av UV-B (280–315 nm) stråling. Spesifikk sammensetningsvariasjon er rapportert i planter som vokser i Middelhavsregionen om sommeren og i store høyder, hvor en høyere forekomst av UV-B forekommer og kanelsyrer og flavonoider viste de høyeste UV-absorpsjonsratene [3].

Arbutin(hydrokinon -D-glukosid) er en enkel fenolforbindelse med begrenset forekomst i bladene til noen arter som tilhører slekter som Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus eller Vaccinium. Den viktigste naturlige kilden til arbutin, bjørnebær (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) har blitt brukt i århundrer for å behandle urinveisinfeksjoner og andre nyresykdommer [4], og urteformuleringer tilberedes fortsatt i dag [5]. I løpet av de siste årene har spekteret av anvendelser avarbutinhar utvidet seg, for det meste som et naturlig hudblekende middel i kosmetikkindustrien [6] og i kliniske terapier på grunn av detsantioksidant, antibiotiske, antiinflammatoriske og antitumoregenskaper [7]. Følgelig er det en økende interesse for å finne flere naturlige kilder tilarbutin, samt bioteknologiske prosesser som kan erstatte kjemisk syntese [8,9]. I denne sammenhengen har in vitro produksjon av arbutin ved bruk av Datura inoxia cellekulturer nådd pilotskalaen [10].

I tillegg tilarbutin, bidrar andre fenoliske forbindelser til A. uva-ursi aktive egenskaper, som flavonoider og tanniner [11,12], hvorfra henholdsvis katekin og corilagin er de mest relevante inleaves [13]. I næringsmiddelindustrien erstatter naturlige forbindelser som plantefenoler syntetiskeantioksidantkonserveringsmidler [14]. A. uva-ursi har blitt brukt som tilsetningsstoff, spesielt i kjøttprodukter [15–19] men også i aktiv emballasje [20]. Endelig har potensialet til A. uva-ursi som en kilde til garvemidler for lærindustrien nylig blitt foreslått [21].

"Bearberry leaf"-monografien til European Medicines Agency [5] foreslo minimum 7 prosent avarbutininnhold i tørkede blader som krav til urtepreparater. Studier utført i løpet av de siste tiårene beskrev arbutininnhold i bjørnebærblader som varierer fra 0 prosent til 18 prosent , forklart av analytiske prosedyrer, naturlig variasjon, vekstforhold og høstingsdato [4]. Arbutininnholdet bestemmes vanligvis ved høyytelses væskekromatografi [4,12,22–24], og tidligere studier oppdaget høyerearbutininnhold i bjørnebærplanter samlet om høsten enn i de samlet om våren [4]. Mangfoldige bjørnebærkjemotyper er beskrevet, assosiert med den geografiske distribusjonen og til den intraspesifikke differensieringen i underarter av A. uva-ursi. Den mest slående fytokjemiske variasjonen som er rapportert er fraværet av arbutin i A. uva-ursi subsp. stipitata Packer og Denford, men også forskjeller i innhold av metylarbutin, ellaginsyre eller myricetin har blitt referert. Quercetin er også tilstede i bjørnebærblader, der både aglykoner, så vel som deres 3-O-glykosider er de vanligste flavonoidene [4]. Imidlertid ble de fleste av disse studiene utført for flere tiår siden, og i dag anses intraspesifikk variasjon i bjørnebær å være kontinuerlig. De 14 underartene som er beskrevet, inkludert en fra Spania (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre,Alcaraz og MB Crespo), er for tiden ikke-aksepterte navn og synonyme med A. uva-ursi [ 25]. Nye undersøkelser er derfor nødvendig for å forbedre vår kunnskap om forbindelsene som faktisk finnes i råmaterialet høstet fra forskjellige steder for industrielle formål, siden den kjemiske profilen til A. uva-ursi-blader har blitt beskrevet til å inkludere et mangfoldig utvalg av fenoler, tanniner, og flavonoidsin nyere studier utført for å undersøke forskjeller på interspesifikke nivåer [23,26,27].

Genetisk (inkludert cytogenetisk) mangfold på populasjonsnivå fremmer tilpasning til ulike miljøforhold [28]. Effektene av polyploidisering på produksjonen av spesialiserte metabolitter i medisinske og aromatiske planter ble nylig gjennomgått [29]. I denne sammenhengen er genomstørrelse en mye brukt parameter i plantevariabilitetsvurderinger, siden den intraspesifikke variasjonen ofte blir oppdaget ([30], og referanser deri), korrelert med mange andre biologiske egenskaper, og spiller en relevant rolle i evolusjonære prosesser [31–35 ]. Studier som tar for seg sammenhengen mellom kjernefysisk DNA-mengde (dvs. genomstørrelse) og fytokjemisk mangfold er imidlertid svært knappe [36,37]. Forholdet mellom fytokjemisk og genetisk mangfold har blitt vurdert ved bruk av kjernefysiske, men spesielt plastidDNA-markører [38], spesielt i medisinske [39] og dyrkede [40] plantearter.

Bjørnebær er vidt utbredt i det omkringliggende området, men de fleste av de innsamlede villpopulasjonene i Europa er lokalisert i de østlige landene, Østerrike, Sveits, Italia og Spania. Arctostaphylos uva-ursi vokser i den østlige midtdelen av Spania, i fjell, i høyder fra 550 til 2350 m over havet. Det er mer vanlig i nord siden populasjoner som ligger på lavere breddegrader er sjeldnere og har vanligvis færre individer. De eksisterende studiene angående variasjonen i arbutininnhold i Spania refererte til verdier som spenner fra 8 prosent i nord-østlige populasjoner [41] og 19 prosent i spansk plantemateriale evaluert i en studie utført i Tyskland [42]. Vår studie tar sikte på å klargjøre faktorer, inkludert genomstørrelse og genetisk mangfold, som forklarer fytokjemisk variasjon over den naturlige distribusjonen av bjørnebær i Spania. Resultatene våre kan bidra til valg av plantemateriale for farmasøytisk, kosmetikk og næringsmiddelindustrien.

hudblekende mat:CISATNCHE

2. Resultater og diskusjon

2.1. Kjemisk mangfoldsanalyse

Bjørnebærblader tatt fra totalt 249 planter som vokste på 42 spanske steder, og over en treårsperiode, 2014–2016 (Figur 1, Tabell S1), viste forskjellige tørrvektprosenter (dr wt), alt fra 46,7 (LO) til 55,1 prosent (CP), med et gjennomsnitt på 50,1 ± 2,7 prosent (data ikke vist). Metanolekstrakter fremstilt fra prøver samlet i 2014 og 2015 ble brukt for totalfenol- og arbutinholdsbestemmelser. Vi observerte et bredt spekter av kontinuerlige variasjoner for begge parametere med signifikante forskjeller (p < 0,001)="" blant="" planter.="" bladekstrakter="" av="" 80="" planter="" tatt="" prøve="" høsten="" 2014="" (figur="" 2a)="" viste="" totalt="" fenolinnhold="" fra="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (prøve="" li-4)="" til="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr)="" -2),="">arbutininnholdet svingte fra 92.0 ± 3.0 mg/g dr wt (AN-6) til 194.2 ± 5.6 mg/g dr wt (SE-8). Analyse av ekstrakter fremstilt fra blader samlet i 2015 fra 94 planter (figur 2b) viste også en bred fytokjemisk variasjon, fra 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) til 200,9 ± 9,8 mg GAE/g drwt (LO-4) i totalt fenolinnhold, mens arbutininnholdet varierte mellom 87,1 ± 0,4 mg/g drwt (ET-2) og 211,5 ± 5,9 mg/g drwt (LI -2). Videre, uavhengig av innsamlingsår, betydelige forskjeller i totale fenoler ogarbutininnhold ble oppdaget blant bjørnebærplanter som vokste på samme sted for de fleste av populasjonene (data ikke vist). Arbutinnivåer var signifikant korrelert med totalt fenolinnhold i bjørnebærbladekstrakter siden vi estimerte signifikante Pearson-koeffisienter på {{0}} .332 (p=0.003) for 2014, og 0.289 for 2015-data (p=0.005). Arbutininnholdet i de 48 plantene som ble tatt prøver i begge årene varierte ikke signifikant (p=0.380).

Til tross for variasjonen som ble funnet i populasjoner, og uavhengig av høstingsår, viste variansanalyse at arbutininnholdet i bjørnebærbladekstrakter også var avhengige (p < {0}}.00="" 1)="" på="" populasjonsplassering="" (figur="" 3a,b),="" som="" skjedde="" for="" totalt="" fenolinnhold="" i="" bjørnebærblader="" analysert="" i="" 2015="" (p="">< 0.001,="" figur="" 3b).="" derimot="" ble="" det="" ikke="" observert="" signifikante="" forskjeller="" i="" totalt="" fenolinnhold="" (p="0.080)" blant="" de="" 10="" populasjonene="" som="" ble="" samplet="" i="" 2014,="" som="" var="" lokalisert="" i="" et="" relativt="" lite="" område,="" men="" fordelt="" på="" et="" bredt="" høydeområde,="" fra="" 424="" (ba).="" befolkning)="" til="" 1410="" moh="" (pa-befolkning).="" denne="" variasjonen="" i="" høyde="" var="" assosiert="" med="" forskjeller="" i="" klimatiske="" forhold="" (tabell="" s1),="" siden="" steder="" i="" høyere="" høyder="" var="" preget="" av="" lavere="" gjennomsnittstemperaturer="" (pearsons="" korrelasjonskoeffisient,="" r="-0,666," p="">< 0,001)="" og="" høyere="" årlig="" nedbør="" (="" r="0.485," p="">< 0,001),="" som="" intur="" resulterte="" i="" lavere="" globale="" strålingsnivåer="" (r="-0,390," p="">< 0,001).="" videre,="" fra="" dette="" datasettet="" ble="" det="" beregnet="" en="" lav,="" men="" signifikant="" positiv="" korrelasjon="" mellom="" årlig="" nedbør="" og="" totalt="" fenolinnhold="" i="" bjørnebærplanter="" (spearmans="" koeffisient="" rho="0.256," s="0.022)," mens="" fra="" 2015-datasettet="" når="" vi="" samplet="" populasjoner="" i="" et="" større="" område,="" oppdaget="" vi="" en="" signifikant="" positiv="" korrelasjon="" mellom="" årlig="" nedbør="" og="" arbutininnhold="" (rho="0.246," s="0.017)." denne="" signifikante="" korrelasjonen="" indikerer="" at="" bjørnebærplanter="" som="" vokser="" på="" nordlige="" steder="" og="" i="" relativt="" høyere="" høyder="" ofte="" viste="">arbutininnhold (henholdsvis rho=0.217, p=0.035 og rho=0.269, p=0.009). Som nevnt korrelerte disse høyere arbutininnholdene signifikant til høyere totale fenolinnhold i bjørnebærblader, som var lik (i gjennomsnitt 154,4 ± 19,6 mg GAE/g dr wt) de som ble funnet i vandige ekstrakter fra andre plantearter brukt somantioksidanttilsetningsstoffer i næringsmiddelindustrien [43], som asrosmarin (185,0 mg GAE/g dr wt), te (149,3 mg GAE/g dr wt), eller guava (154,4 mg GAE/g dr wt). Disse resultatene er i samsvar med tidligere referanser og ble bekreftet i en studie utført av Wrona et al. [20] ved å bruke noen av prøvene av spanske bjørnebærblader samlet inn i 2015, for hvilke høyereantioksidantkapasitet var forbundet med høyerearbutininnhold. Elite bjørnebærgenotyper kan også identifiseres for dette formålet, slik som individer 1, 4, 7 og 8 fra LO-populasjonen, som i gjennomsnitt akkumulerte 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr wt i løpet av de to studieårene.

For ytterligere å belyse klimatiske og geografiske faktorer som påvirker fenolvariasjonsmønstrene, utførte vi en mer uttømmende prøvesamling høsten 2016: 140 bjørnebærplanter som vokste på 29 steder, og vi kvantifiserte fem fenoliske forbindelser (Figur S1a) som ble identifisert ved ko-eluering med standarder i en acetonitril/vanngradient (Figur S1b). Analyse viste store spekter av kontinuerlig variasjon for innhold av arbutin, koffeinsyre, katekin, myricetin og quercetin-glukosid, med betydelige forskjeller mellom planter som også generelt ble observert i populasjoner (data ikke vist). For de viktigste fenolbestanddelene fant vi at arbutininnholdet varierte fra 91,1 ± 5,0 (LB{{10}}) til 232,4 ± 2,8 mg/g dr wt (PT{{15) }}), mens katekininnholdet varierte fra 4,1 ± 0,1 (AF{{20}}) til 45,5 ± 1,4 mg/g dr wt (LB-5). Når det gjelder de to andre flavonoidene som ble bestemt, ble ikke myricetin påvist i noen planter fra flere populasjoner, mens den nådde 21,2 ± 1,2 mg/g drwt i PO{{30}}, og quercetinglukosid varierte fra 3,8 ± 0,1 (CO -3) til 22,8 ± 0,8 mg/g dr wt (BT-3). Lavere innhold av koffeinsyre ble bestemt i bjørnebærbladekstrakter, som varierte fra 1,8 ± 0,0 (IZ-1) til 7,1 ± 0,3 mgPlanter /g dr wt (SI-4).

Til tross for variasjonen som ble observert blant individer, ble signifikante forskjeller mellom populasjoner også estimert for disse fem forbindelsene (Kruskal–Wallis-tester, p < {0}}.001="" og="" p="0." 009="" for="" koffeinsyreinnhold).="" høyere="" arbutininnhold="" ble="" i="" gjennomsnitt="" bestemt="" i="" planter="" fra="" ab,="" gu,="" ln="" og="" lo="" naturlige="" populasjoner="" (figur="" 4a),="" som="" skilte="" seg="" betydelig="" (etter="" bonferronicorrection)="" fra="" det="" lave="" innholdet="" funnet="" i="" planter="" fra="" lb-populasjonen="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,169,5="" ±="" 10,0="" og="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" dr="" wt="" front="" til="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" dr="" wt,="" henholdsvis).="" en="" gang="">arbutininnholdet i planter som var tatt prøver også i 2015 varierte ikke signifikant mellom år(p=0.821). Populasjonen LB viste i sin tur høyere gjennomsnittlig katekinnivå (Figur 4b), som skilte seg betydelig fra det lave gjennomsnittlige innholdet av denne flavonoiden påvist i populasjonene AF og LC (32,8 ± 9,8 foran til 5,7 ± 1,9 og 5,3 ± {{2{{62} }}},5 mg/g dr wt, henholdsvis). Gjennomsnittlig myricetin- og quercetin-glukosidinnhold er vist i figur 4c, med signifikante forskjeller mellom populasjonene AB, CG, LB og PO, med høyere myricetininnhold (15,1 ± 4.0, 14.6 ± 5.7, 10 henholdsvis .7 ± 2,8 og 17,2 ± 3,9 mg/g dr wt, sammenlignet med de lave nivåene som akkumulerte på gjennomsnittlige planter fra populasjoner CO og OD (henholdsvis 1,2 ± 1,5 og 2,4 ± 3,6 mg/g dr wt) , og betyr også quercetin-glukosid-innhold bestemt i populasjoner AA, BT, CP, IZ og LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 og 13,1 ± 3,7 forskjellig ± 4,6 mg/dg) signifikant forskjellig. fra det i populasjon CO (4.0 ± 0,1 mg/g dr wt). I motsetning til dette svingte gjennomsnittlig koffeinsyreinnhold fra 2,1 ± 0,2 mg/g drwt i populasjoner AB, CE, PT og SA, til 3,5 ± 1,2 mg/g dr wt i populasjon AF eller 3,4 ± 2,2 mg/g dr wt in populasjon SI; derfor ble det ikke observert signifikante forskjeller på grunn av intrapopulasjonsvariasjon (gjennomsnittlig innhold 2,7 ± 0,8 mg/g dr wt). Disse resultatene utfyller variasjonen på fenoliske metabolitter observert av Wrona et al. [20], for åtte av bjørnebærstedene som ble tatt prøver i 2015 som ble analysert ved hjelp av UPLC®-ESI-Q-TOF med MSE-teknologi.

I motsetning til resultater oppnådd i analysen utført med bjørnebærprøver fra 2014 og 2015,arbutininnhold bestemt i 2{{10}}16 prøver viste lav, men signifikant positiv korrelasjon med stråling (rho=0.256, p=0.002) og maksimale gjennomsnittstemperaturer (rho{ {5}}.183, p=0.030), og var derfor omvendt korrelert til årlige nedbørsverdier (rho=−0.265, p=0.002). Disse forskjellene var også assosiert med variasjon i høyde (rho=−0.192, p=0.023), men denne negative korrelasjonen ble forklart med den nevnte lavearbutininnhold av planter fra LB-populasjonen som er lokalisert på 1720m. Et lignende variasjonsmønster ble observert for myricetininnhold siden høyere nivåer av denne forbindelsen var signifikant assosiert med bjørnebærplanter som vokste på steder under høyere strålingsnivåer (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). Det motsatte mønsteret til arbutin ble observert for katekin, siden en positiv korrelasjon ble estimert mellom denne flavonoiden og årlig nedbør (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" og="" negative="" korrelasjoner="" ble="" følgelig="" oppdaget="" med="" stråling="" og="" med="" maksimal="" gjennomsnittstemperatur="" (rho="−0.307," p="">< 0.001="" og="" rho="−0.470," p="">< 0.001,="" henholdsvis).="" denne="" variasjonen="" i="" klimatiske="" faktorer="" forklarte="" at="" både="" høyde="" og="" bredde="" påvirket="" katekininnholdet="" i="" bjørnebærbladene="" (henholdsvis="" rho="0.410" og="" 0.490,="" p="">< 0.001).="" en="" hovedkomponentanalyse="" utført="" med="" fytokjemiske,="" klimatiske="" og="" geografiske="" data="" som="" tilsvarer="" de="" 29="" stedene="" som="" ble="" samplet="" i="" 2016,="" der="" de="" to="" første="" komponentene="" forklarte="" 60="" prosent="" av="" den="" observerte="" variasjonen,="" bekreftet="" disse="" resultatene="" (figur="" 5).="" vi="" fant="" ingen="" signifikant="" korrelasjon="" mellom="" innholdet="" av="" koffeinsyre="" eller="" quercetinglukosid="" i="" bjørnebærplanter="" og="" verken="" klimatiske="" eller="" geografiske="" faktorer,="" selv="" om="" vi="" estimerte="" små,="" men="" signifikante="" korrelasjoner="" mellom="" myricetin-="" og="" quercetinglukosidinnholdet="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)og="" mellom="" myricetin-="" og="" koffeinsyreinnhold="" (rho="−0.176," s.="0.037)" i="">

De observerte kontrasterende klimatiske mønstrene for variasjon iarbutininnhold av bjørnebærplanter tyder på at selv om biosyntesen av denne metabolitten sannsynligvis økes under forhold med høyere stråling og temperatur, er vannmangel sannsynligvis en begrensende faktor for A. uva-ursi i Middelhavs- og sørområdene. Del Valle et al. [44] rapporterte et breddegradsmønster av flavonoidakkumulering av Silene littorea (Caryophyllaceae) i Spania, der høyere flavonoidinnhold ble bestemt i sørlige populasjoner, siden breddegrad korrelerte negativt med UV-B-stråling og temperatur, og positivt med nedbør. Global stråling viser en klar breddegradient med høyere forekomst i sør og øst for den iberiske halvøy, og det er også en signifikant orografisk effekt siden skypersistens modulerer forekomsten av denne strålingen i høyere høyder. Et UV-strålingskart over Spania [45] referert høy korrelasjon (r > 0.9) mellom UV-B og globale strålingsdata. I følge denne referansen, bjørnebærpopulasjoner som viste høyere gjennomsnittarbutininnholdet i vår studie er for det meste lokalisert i områder med UV-B-strålingsnivåer på 2403–2451 J/m2.

Våre resultater for katekinvariasjon i bjørnebær viste et geografisk mønster (Figur 5) og stemmer overens med studier utført i andre plantearter fra nordlige land i Europa. Høyere innhold av spesialiserte metabolitter, som flavonoider og antocyaniner, ble rapportert i planter som vokste på høyere breddegrader, sannsynligvis på grunn av lengre dagslysperioder og lavere nattetemperaturer [46]. Derved økte løselig fenolinnhold i Juniperus communis nåler med breddegrad og høyde i Finlands befolkning [47], og også 10–19 prosent høyere fenolinnhold ble funnet på en høyere breddegrad i frukter av tre Ribes spp. kultivarer analysert på to finske lokasjoner [48]. Disse forfatterne relaterte lavere fenolinnhold med høyere nivåer av stråling og temperatur. Flavonoidinnhold i frukt av to arter av Vaccinium (også fra familien Ericaceae) viste en geografisk gradient, med høyere mengder av flavonoider på nordlige breddegrader [49,50].

I forhold til høydevariasjon ble høyere nivåer av flavonoider bestemt i populasjoner av andre Ericaceae-arter, Calluna vulgaris, som vokste i høyere høyder [51]. Høydegradienter påvirket også den spesialiserte metabolismen til spanske populasjoner av Arnica montana [52] og Quercus robur[53]. Det sistnevnte arbeidet refererte til en signifikant positiv sammenheng mellom konsentrasjonen av totale bladfenoler og høyde, idet gradienten kun var avhengig av flavonoider, og antydet dermed at disse forbindelser drev forholdet for totale fenoler. Disse resultatene stemmer overens med våre estimater for katekininnholdsmønsteret. Til slutt var en nedbørsgradient assosiert med signifikante forskjeller i polyfenolsammensetningen i en afrikansk medisinsk busk (Myrothamnus flabellifolia) der metabolomiske forskjeller var kongruente med den genetiske strukturen til populasjoner [54].

CISTANCHE CAN ANTI-AGEING

2.2. Genomstørrelse og sekvensdataanalyse

Genomstørrelse 2C-verdier for bjørnebærplanter varierte fra 2,50 til 3,15 pg (tabell 1). Små forskjeller i mengden kjernefysisk DNA er funnet blant populasjoner (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunns test med Bonferroni-korreksjon avdekket statistisk signifikante forskjeller mellom: AL- og SI-populasjoner (Z=−3.972, p=0.024), LE og SI (Z=−4.196, p {{ 21}}.009), og SE og SI (Z=−4.236, p=0.008). Populasjonen av Pontils (PO) er typelokaliteten til A. uva-ursi var.crassifolius, som senere ble kombinert som A. uva-ursi subsp. crassifolius, og foreløpig ikke vurdert taksonomisk (se introduksjon), har en mellomverdi (2,88 pg), innenfor rekkevidden av verdier oppnådd i andre populasjoner av arten. Dette er den første omfattende populasjonsstudien av kjernefysisk DNA-mengde i arten og hele slekten siden den eneste tilgjengelige informasjonen i dag kommer fra en Balkan-populasjon av samme takson [55]. 2C-verdien der rapportert, 2,49 pg, er plassert like ved den nedre grensen for variasjonsområdet til det her undersøkte datasettet. Det ble ikke funnet noen sammenheng mellom genomstørrelsesverdier og populasjonshøyde. DNA-mengden av individer viste en svak positiv signifikant korrelasjon medarbutininnhold når data fra 158 bjørnebærplanter ble sammenlignet (rho=0.187, p=0.018), mens ingen annen signifikant korrelasjon mellom genomstørrelse og andre variabler ble funnet. Dette resultatet er i samsvar med de rapporterte økningene i produksjonen av spesialiserte metabolitter som generelt observeres i medisinske og aromatiske planter etter polyploidisering [29].

Nyproduserte sekvenser for rpl{0}}trnL og psbE-petN intergene spacere ble justert i to matriser (henholdsvis inneholdende 566 og 874 bp) som ble sammenkoblet i en enkelt matrise på 1440 bp.Moderat nivåer av variasjon i disse plastidregionene ble påvist (seks nukleotidsubstitusjoner og fire indeler). Ti forskjellige haplotyper ble funnet med en total haplotypediversitet (Hd) på 0.468 (tabell 1). De fleste populasjoner (21) inneholdt bare én haplotype, mens fem av dem viste et visst mangfold blant individer. Den mest tallrike haplotype 1 viste den høyeste frekvensen (71,4 prosent), etterfulgt av haplotype 2 (15,2 prosent), mens resten av dem viste mye lavere frekvenser (0,04–0,01 prosent). Den geografiske fordelingen av haplotyper er vist i figur 6. Haplotype 1 ble funnet i 32 populasjoner – den var fiksert i 18 av dem – fordelt på alle utvalgte regioner bortsett fra de sørligste lokalitetene. Haplotype 2 ble funnet i ti populasjoner og var den eksklusive haplotypen i de to sørligste populasjonene (HU og LV) samt i PR. Haplotype 4 var privat fra tre populasjoner fra Pyreneene, mens haplotype 8 dukket opp i to populasjoner fra den østlige iberiske halvøya. Når det gjelder de evolusjonære forholdene vist i parsimoninettverket (figur 6), er de fleste haplotypene forbundet med ett eller to mutasjonstrinn. Haplotype 1 inntar en sentral posisjon, med syv haplotyper knyttet til den.

En Mantel-test mellom pDNA-genetiske og kjemiske parvise avstandsmatriser viste svak, men signifikant korrelasjon (r=0.301; p=0.048) mellom genetisk differensiering og konsentrasjonen av de fem kjemiske komponentene målt for 2016 datasett. Mantel-testen avdekket ingen signifikant korrelasjon mellom genetisk og geografisk avstand blant de 25 populasjonene som ble samplet i 2016 (r=0.103, p=0.207) eller mellom de kjemiske og geografiske parvise avstandene blant disse 25 populasjoner (r=0.191, s=0.050). Den fytokjemiske variasjonen som er rapportert her for bjørnebærpopulasjoner over hele Spania er derfor supplert med moderate nivåer av pDNA-haplotypevariasjon, som er den nord-sør genetiske differensieringen funnet i bjørnebærpopulasjoner som kan sammenlignes med fylogeografiske mønstre funnet i andre planter (f.eks. [56–58]. All denne homogeniteten forventes i planter med lav reproduksjonskapasitet [59], som A. uva-ursi, som viser dårlige spiringshastigheter og høy dødelighet hos unge frøplanter [4] Likevel var den beskjedne genetiske differensieringen vist av pDNA korrelert med biokjemisk parvise avstander estimert fra profiler av fem fenoliske figur 6. Geografisk fordeling av pDNA-haplotyper på iberiske populasjoner av Arctostaphylos uva-ursi. Befolkningskoder tilsvarer de i tabell S1, og kakediagrammer representerer prosentandelen av individer som viser hver haplotype i hver populasjon. rektangel, det statistiske parsimony-nettverket som viser de evolusjonære forholdene til te n plastidhaplotyper funnet i A. uva-ursi-populasjonen er representert. Hver stripe langs linjene som forbinder haplotypene indikerer ett mutasjonstrinn i pDNA-regionene sekvensert i denne studien. En Mantel-test mellom pDNA-genetiske og kjemiske parvise avstandsmatriser viste svak, men signifikant korrelasjon (r=0.301; p {{28 }}.048) blant genetisk differensiering og konsentrasjonen av de fem kjemiske komponentene målt for 2016-datasettet. Mantel-testen avdekket ingen signifikant korrelasjon mellom genetisk og geografisk avstand blant de 25 populasjonene som ble samplet i 2016 (r=0.103, s=0.207) eller mellom de kjemiske og geografiske parvise avstandene blant disse 25 populasjonene ( r=0.191, s=0.050). Den fytokjemiske variasjonen som er rapportert her for bjørnebærvilde populasjoner over hele Spania er derfor supplert med moderate nivåer av pDNA haplotypevariasjon, som er den nord-sør genetiske differensieringen funnet i bjørnebærpopulasjoner sammenlignbar med fylogeografiske mønstre funnet i andre planter (f.eks. [56–58]. All denne homogeniteten forventes inplanter med lav reproduksjonskapasitet [59], som A. uva-ursi, som viser dårlige spiringshastigheter og høy dødelighet hos unge frøplanter [4] Ikke desto mindre korrelerte den beskjedne genetiske differensieringen av pDNA med biokjemiske parvise avstander estimert fra profiler av fem fenolforbindelser. Dette mønsteret av genetisk og fytokjemisk variasjon (som som nevnt ikke var assosiert med geografiske avstander), samt den svake, men signifikante korrelasjonen mellom genomstørrelse og arbutininnhold, kan indikere at naturlig genomisk variasjon påvirker utbyttet av fenolforbindelser i A. uva-ursi. Imidlertid er hypervariabel molekylær m arkere i en mer omfattende populasjonsprøvetaking er nødvendig for å bekrefte disse fylogeografiske mønstrene og sammenhengen mellom genetisk og biokjemisk variasjon.

CISTANCHE HAR ANTIOKSIDASJONSEFFEKTER

3. Materialer og metoder

3.1. Plantemateriale

For fytokjemisk analyse ble det tatt prøver av totalt 249 bjørnebærplanter som vokste i 42 populasjoner høsten 2014, 2015 og 2016, noe som er representativt for den naturlige fordelingen av denne plantearten på den iberiske halvøy (figur 1 og tabell S1). Først høsten 2014 samlet vi terminalskudd fra 80 planter i ti spanske populasjoner (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC og SE) lokalisert i et relativt lite område (ca. 80 × 50 km) i Nord-Spania, men i et stort høydeområde (424–1410 moh). For det andre, høsten 2015, samlet vi 48 planter fra seks av disse populasjonene (AG, LI, LO, PA, SE og SR) og 46 bjørnebærplanter fra seks populasjoner lokalisert på lavere breddegrader (AL, CH, ET, HU, LV og PI). For hver populasjon tok vi prøver av åtte planter adskilt på minst 5 m, bortsett fra i HU, hvor vi bare fant seks individer. For det tredje, høsten 2016, ble det tatt prøver av totalt 140 planter på 29 forskjellige steder (1–6 individer fra hver), inkludert 26 nye spanske lokaliteter (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN og ZU). Vår prøvetaking spenner over et høydeområde fra 534 til 1750 m. Til sammen representerer de 42 populasjonene et bredt spekter av klimatiske forhold (tabell S1): maksimal middeltemperatur viste 2-foldvariasjon (13–26 ◦C) og årlig nedbør svingte fra 399 (ZU) til 1589 mm (PT). Global stråling varierte fra 4,2 til 5,1 kWh/m2d. Seks til ti terminale skudd (15–20 cm lange) ble samlet for hver plante for å oppnå 6–15 g friske blader, som deretter ble skåret ut og tørket ved 60 ◦C til konstant vekt (3–4 dager). Etter tørrvektbestemmelser ble bladene manuelt homogenisert i en morter og lagret ved 4 ◦C inntil de ble analysert. Dette plantematerialet ble brukt for totale fenoler og HPLC-bestemmelser.

Bladmaterialer for flowcytometriske vurderinger ble hentet fra ferske blader av 178 individer som tilhørte totalt 37 populasjoner (tabell 1). Det ble tatt prøver fra 33 av populasjonene nevnt ovenfor, og fra fire nye populasjoner (BE, JO og PR i Spania og EN i Andorra) hvor blader ble samlet inn våren 2017, og derfor ikke ble inkludert i den fytokjemiske analysen (Figur 1 og Tabell S1). Fra ett til seks individer per populasjon ble målt indulikat. Bladmaterialer for DNA-ekstraksjon ble tørket i silikagel og lagret ved romtemperatur. DNA-diversitetsanalyser ble utført i totalt 105 planter fra 35 lokasjoner (tabell 1).

Plantekuponger av de 46 bjørnebærpopulasjonene som er studert, deponeres i herbariet BC, ved Institutt Botànic de Barcelona, ​​i herbariet BCN, i Centre de Documentació de Biodiversitat Vegetal, Universitat de Barcelona eller i herbariet JACA, ved Instituto Pirenaico de Ecología( CSIC).

3.2. Fremstilling av bladekstrakter og total fenolbestemmelse

Tre replikater av bjørnebærbladekstrakter ble fremstilt ved å bruke 50 mg tørket prøve og 10 ml 80 prosent metanol. Rørene ble inkubert i 30 minutter i et ultralydbad, og deretter ble ekstraktene filtrert (0,45 mm) og lagret ved 4 ◦C inntil analyse. Totalt fenolinnhold ble bestemt i ekstraktene fremstilt fra prøver samlet i 2014 og 2015. Vi fulgte en Folin-Ciocalteu-metode [60,61] med små modifikasjoner: til 0,1 ml ekstrakt, 0,4 ml metanol (80 prosent), 0,5 ml Folin- Ciocalteu-reagens og 8 ml ultrarent vann ble tilsatt. Etter 5 minutter i et ultralydbad ble 1 ml Na2CO3 20 prosent (vekt/volum) tilsatt. Prøvene ble stående i mørket i 30 minutter før absorbansen ble målt ved 760 nm ved bruk av et UV-synlig spektrofotometer (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Resultatene ble uttrykt i gallussyreekvivalenter (GAE); dvs. mg gallussyre/g dr wt, ved bruk av en gallussyrestandardkurve (40–340 µg/g).

3.3. Arbutin og andre fenoliske metabolitter Bestemmelse

Fenolinnhold i metanoliske ekstrakter av bjørnebærblad ble kvantifisert ved RP-HPLC ved bruk av et HPLC-UV/Vis-system (LaChrom Merck Hitachi L-7400) med en Kinetex 5 µm-EVO C18(250 mm × 4,6 mm ) kolonne og absorbans bestemt ved 280 nm. Ekstrakter fra prøver samlet i 2014 og 2015 ble fortynnet 1:10 (v/v) og injisert med en mobil fase av metanol og acetonitril. Gradientprogrammet besto av 0–5 min, 25 prosent metanol; 5–6 min, 100 prosent; 6–10 minutter, 100 prosent; og 10–20 minutter, igjen 25 prosent metanol. Strømningshastigheten var 1 ml/min og injeksjonsvolumet var 20 µL. I disse forholdene vil oppbevaringstiden påarbutinvar 2,6 min, noe som gjør det mulig for oss å bestemme konsentrasjonen av denne forbindelsen ved å bruke en kalibreringskurve etablert med 6 fortynninger av en standard, fra 40 til 340 µg/g, med en korrelasjonskoeffisient på r=0. 9997. Ekstrakter fra prøver samlet i 2016 ble analysert med en mobil fase av metanol og vann med følgende gradientprogram: 0–5 min, 10 prosent metanol; 5–6 min, 20 prosent ; 6–10 min, 20 prosent; 10–11 min, 30 prosent; 11–15 min, 30 prosent ;15–16 min, 40 prosent ; 16–20 min, 40 prosent ; 20–21 min, 50 prosent ; 21–25 min, 50 prosent ; 25–26 min, 60 prosent ; 26–30 min, 60 prosent ;30–31 min, 10 prosent ; og 31–36 min, igjen 10 prosent metanol. Under disse forholdene bestemte viarbutin ogandre 4 fenoliske forbindelser: koffeinsyre, katekin, myricetin og quercetin-3-O-glukopyranoside ved å bruke de tilsvarende kalibreringskurvene etablert med 5 fortynninger av standarder (25–500 µg/mL) ,som viste korrelasjonskoeffisienter på {{10}}.9992 for katekin (retensjonstid 12,0 min), 0,9924 for koffeinsyre (retensjonstid 13,4 min), 0,9981 for quercetin{{16} }O-glukosid (retensjonstid 23,4 min), og 0,9997 for myricetin (retensjonstid 25,1 min).

Metanol og acetonitril var i HPLC-kvalitet og kjøpt fra Panreac (Barcelona, ​​Spania). Standarder (renhet større enn eller lik 98 prosent)arbutin, koffeinsyre og gallussyre, samt Folin-Ciocalteu-reagenset ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Barcelona, ​​Spania). Catechin og quercetin-3-O-glukopyranosidestandarder ble kjøpt fra Extrasynthese (Genay Cedex, Frankrike), mens myricetin ble kjøpt fra Alfa Aesar (Karlsruhe, Tyskland).

Resultater av kjemiske bestemmelser ble analysert ved bruk av SPSS v. 25-programvare og R 3.5.2. Etter å ha testet data for normalitet og homoskedastisitet, utførte vi variansanalysen av forskjellige sett av data og middelseparasjonstester (Tukey og Tamhane) eller ikke-parametriske tester som Kruskal–Wallis og Dunn multiple sammenligningstest med Bonferroni-korreksjon. Vi estimerte også korrelasjonskoeffisienter (Pearson eller Spearman avhengig av om data fulgte en normal fordeling) mellom variabler, inkludert genomstørrelse.

CISTANCHE HAR ANTIOKSIDASJONSEFFEKTER

3.4. Anslag på genomstørrelse og DNA-sekvensering

Genomstørrelsen til bjørnebærplanter ble estimert ved flowcytometri ved Centers Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) etter prosedyrene forklart i Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) ble brukt som intern standard. Frø av standarden ble levert av Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Frankrike). Kjernefysisk DNA-innhold (2C) ble beregnet ved å multiplisere det kjente DNA-innholdet i standarden med kvotienten mellom toppposisjoner (modus) for målarten og standarden i histogrammet av fluorescensintensiteter, forutsatt en lineær korrelasjon mellom de fluorescerende signalene fra de fargede kjernene til den ukjente prøven, den kjente interne standarden og DNA-mengden [63].

Omtrent 20 mg silikatørket bladvev ble brukt til DNA-ekstraksjon ved bruk av en CTAB-protokoll [64] med mindre modifikasjoner. Kvaliteten på totalt DNA ble kontrollert med et NanoDrop 1000 spektrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). De plastide intergene regionene rpl32-trnLand psbE-petN, så vel som den nukleære ribosomale DNA-regionen ITS, ble amplifisert og sekvensert i tre individer per populasjon. Sekvenser av ITS presenterte ingen variasjon innen de 105 analyserte individene, bortsett fra noen få posisjoner som viser intragenomiske nukleotidpolymorfismer. Derfor ble denne nukleære ribosomale DNA-regionen ekskludert fra videre analyse. Andre plastid-DNA-regioner (dvs. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; og trnL-trnF) ble også testet, men de ble forkastet på grunn av lav variasjon eller sekvenseringsproblemer. Amplifikasjonsprosedyre ble utført som beskrevet i Vitales et al. [65]. Direkte sekvensering av de amplifiserte DNA-segmentene ble utført med Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, California, USA) ved Unitatde Genòmica, CCiTUB, på en ABI PRISM 3700 DNA-analysator (PE Biosystems). rpl32-trnL ogpsbE-petN-sekvensene ble satt sammen med BioEdit versjon 7.1.3.0 [66], justert med ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] og justert manuelt. GenBank-tilgangsnumre er gitt i tabell S2.

3.5. Genomstørrelse og genetisk analyse

En ikke-parametrisk Kruskal–Wallis-test ble utført for å sjekke for statistisk signifikante forskjeller mellom 2C-verdier blant populasjoner. Dunns multiple sammenligningstester ble også utført for å bestemme hvilke populasjoner som viste signifikante forskjeller mellom dem. Bonferroni-korreksjonen ble brukt for å minimere type I-feilen (falsk positiv).

Genetiske diversitetsparametere (polymorfe steder, sparsomhetsinformasjonssteder, antall haplotyper og total haplotypediversitet) ble estimert ved bruk av DnaSP v6 [68]. Plastidhaplotyper ble bestemt i et kombinert datasett som inkluderte både rpl32-trnL- og psbE-petN-regionene. Indels ble kodifisert med FastGap v.1.2 [69] og behandlet som enkeltmutasjonshendelser. De evolusjonære forholdene mellom haplotyper ble utledet basert på et sparsomhetsnettverk konstruert ved bruk av TCS [70] som implementert i PopArt [71]. Maksimalt antall forskjeller som følge av enkeltsubstitusjoner blant haplotyper ble beregnet med 95 prosent konfidensgrenser.

For å analysere forholdet mellom genetiske og kjemiske data ble det utført en Mantel-test. Først estimerte vi den fenotypiske avstanden blant 25 populasjoner ved å bruke data fra bjørnebærplanter samlet inn i 2016, som hadde blitt målt for fem fenoliske komponenter (dvs.arbutin, katekin, koffeinsyre, quercetin og myricetin). Vi brukte R Commander for å standardisere disse dataene [72], og deretter for å beregne den kjemiske avstanden utledet fra den standardiserte matrisen med funksjonen "Dist" onR basert på euklidiske avstander. For det andre ble en Neis populasjons genetiske parvise avstandsmatrise beregnet mellom de 25 populasjonene ved bruk av DnaSP v6. Til slutt beregnet vi de parvise geografiske avstandene blant disse populasjonene ved å bruke pakken "geodist" i R. Parvise korrelasjoner mellom avstandsmatriser ble beregnet ved hjelp av en Mantel-test med 10,000 permutasjoner med funksjonsmantelen tilgjengelig i R-pakken "vegan" [ 73].

4. Konklusjoner

Alle analyserte bjørnebærplanter vistearbutininnhold høyere enn 7 prosent; derfor er dette plantematerialet egnet for urtepreparater. Vår analyse avdekket høyere arbutininnhold enn de (opptil 9 prosent) referert av Parejo et al. [40], som analyserte fire populasjoner lokalisert i de nordøstlige Pyreneene ved 1580–2030 m og oppdaget lave forskjeller i arbutininnhold blant populasjoner. Videre er de fleste av verdiene som er bestemt her i området for plantematerialet som er valgt for dyrking i Polen [74] og i samsvar med den høyearbutininnhold av spanske bjørnebærbladprøver rapportert av Sonnenschein og Tegtmeier [42] ved valg av planter for dyrking i Tyskland. Elitegenotyper av A. uva-ursi kunne formeres vegetativt, men de fleste av de oppnådde klonene mislyktes under feltetablering, noe som begrenset utnyttelsen av disse ressursene. Vi beskrev også den eksisterende variasjonen i innholdet av tre flavonoider (katechin, myricetin og quercetinglucoside), så vel som av koffeinsyre, blant spanske bjørnebærpopulasjoner, og hvordan klimatiske faktorer (hovedsakelig global stråling og nedbør), som korrelerte med breddegrad og høyde gradienter, påvirker den variasjonen. På samme tid, til tross for de lave nivåene av haplotype og genomstørrelsesvariabilitet bestemt i iberisk A. uva-ursi, var genetisk og cytogenetisk differensiering av populasjoner svakt, men signifikant assosiert med fytokjemisk mangfold. Samlet sett fremhever disse resultatene at effekten av både genetiske og abiotiske faktorer må vurderes for å forklare intraspesifikk fytokjemisk variasjon funnet i planter fra ville populasjoner.

CISTANCHE EFFEKT

Referanser

1. Moore, BD; Andrew, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Forklarer intraspesifikk mangfold i plantesekundære metabolitter i en økologisk kontekst. Ny Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Plantefenoler: nylige fremskritt innen deres biosyntese, genetikk og økofysiologi. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Høyde- og sesongmessige endringer av fenoliske forbindelser i Buxus sempervirens blader og neglebånd. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482.[CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Red.) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard for analyse, kvalitetskontroll og terapi; American Herbal Pharmacopoeia: Scotts Valley, CA, USA, 2008; 30 s.

5. European Medicines Agency. Vurderingsrapport om Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Folium. EMA/HMPC/750266/2016; European Medicines Agency: Amsterdam, Nederland, 2018.6. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Planter og naturlige produkter for behandling av hudhyperpigmentering - En gjennomgang. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Betydningen av arbutin og dets derivater i terapi og kosmetikk. Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Bioteknologisk produksjon av arbutin (- og -arbutin), hudlysende midler og deres derivater. Appl. Microbiol. Bioteknologi. 2012, 95, 1417–1425.[CrossRef]

9. Zhu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nylig fremgang på biologisk produksjon av -arbutin. Appl. Microbiol. Bioteknologi. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundær metabolisme i plantecellekulturer. I Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2nd ed.;Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: London, Storbritannia, 2017; Bind 2, s. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Bestanddeler av Arctostaphylos uva-ursi leaves.Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS metabolsk profilering av Arctostaphylos pungens og Arctostaphylos uva-ursi: En sammenlignende studie av fenoliske forbindelser fra bladmetabolsk ekstrakt. Fytokjemi 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein og andre fenoliske forbindelser fra Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Naturlige antioksidanter: kilder, forbindelser, virkningsmekanismer og potensielle anvendelser.Compr. Rev. Food Sci. Mat Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Friradikalfangende kapasitet og antioksidantaktivitet til utvalgte plantearter fra de kanadiske præriene. Food Chem. 2004, 84, 551–562.[CrossRef]

16. Snekker, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Evaluering av antioksidantpotensialet til druefrø- og bjørnebærekstrakter i rått og kokt svinekjøtt. Kjøtt Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekini´c, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalini'c, V.; Šimat, V. Antioksidant og antimikrobielt potensial av fenoliske metabolitter fra tradisjonelt brukte middelhavsurter og krydder. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Studie av egenskapene til bjørnebærbladekstrakt som en naturlig antioksidant i modellmat. Antioksidanter 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioksidantaktivitet av polyfenoler fra bjørnebærbladekstrakt (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) i kjøttsystemer. I fenoliske forbindelser i matvarer og naturlige helseprodukter; Shahidi, F., Ho, CT, red.; American Chemical Society: Washington, DC, USA, 2005; s. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Salg, E.; Asensio, E. Antioksidant- og antimikrobielle markører av UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE av en ny flerlags aktiv emballasje basert på Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Screening av europeiske medisinske urter på deres tannininnhold—Nye potensielle garvemidler for lærindustrien. Ind. avling. Prod. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. Boros, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. ValidatedHPLC-metode for samtidig kvantifisering av bergenin, arbutin og gallussyre i blader av forskjellige Bergenia-arter. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Samtidig HPLC-bestemmelse av hydrofilt blekemiddel i et kosmetisk produkt. J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Et enkelt ekstraksjonstrinn i den kvantitative analysen av arbutinin-bjørnebærblader (Arctostaphylos uva-ursi) ved høyytelses væskekromatografi. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. STRØM. Plants of the World Online. Tilgjengelig på nettet: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (åpnet 29. april 2020).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD-metode for karakterisering av medisinske Ericaceae brukt av Eeyou IstcheeCree First Nations. Phytochem. Anal. 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Mocan, A.; Crisan, G. Fenoliske forbindelser fra fem Ericaceae-arter blader og deres relaterte biotilgjengelighet og helsemessige fordeler. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Utforsking av genetisk mangfold i planter ved hjelp av sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning. Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI;Escandón, AS Den "polyploide effekten" i avl av aromatiske og medisinske arter. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Genomstørrelsesmangfold og evolusjon i landplanter. In-Plant Genome Diversity Volum 2, Fysisk struktur, atferd og evolusjon av plantegenomer; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, Eds.; Springer: Wien, Østerrike, 2013; s. 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ Kjernefysiske DNA-mengder i angiospermer—fremgang, problemer og prospekter.Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Red.) The Evolution of the Genome; Elsevier: San Diego, CA, USA, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Variasjon i genomstørrelse, celle- og kjernevolum, kromosomantall og rDNA-loki blant andemat. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Knight, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Den store genombegrensningshypotesen: Evolusjon, økologi og fenotype. Ann. Bot. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Genomstørrelsesmangfold og dets innvirkning på utviklingen av landplanter. Gener 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev, I.; Rušˇci´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravic, A.; Siljak-Yakovlev, S.; Politico, O. Fytokjemisk og cytogenetisk karakterisering av Centaurea solstitialis (Asteraceae) fra Kroatia. Chem. Biologiske dykkere. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Sammenligninger av Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora og Scutellaria racemosa: Genomstørrelse, antioksidantpotensial og fytokjemi. Planta Med. 2008,74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Nylige trender innen forskning på det genetiske mangfoldet av planter: Implikasjoner for bevaring. Mangfold 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Høyt genetisk mangfold i en truet medisinplante, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), i vestlige Tianshan-fjellene, Kina. Conserv. Genet. 2017, 18 1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Studie på kloroplastDNA-mangfold av kultiverte og ville pærer (Pyrus L.) i Nord-Kina. Tre Genet. Genomes 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Variasjon av arbutininnholdet i forskjellige ville populasjoner av Arctostaphylos uva-ursi i Catalonia, Spania. J. Urter Krydder Med. Planter 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Eksperimenter på domestisering av bjørnebær (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Krydderplanter 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Evaluering av antioksidantaktivitet til vandig ekstrakt av noen utvalgte næringsmiddelurter. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. Om flavonoidakkumulering i ulike plantedeler: Variasjonsmønstre blant individer og populasjoner i strandcampionen (Silene littorea). Front. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; et al. Samtidig rensende seleksjon på den forfedres MC1R-allel og positiv seleksjon på melanomrisiko-allelen v60l i sør-europeere.Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaaola, L.; Hohtola, A. Effekt av breddegrad på flavonoidbiosyntese i planter. Plantecellemiljø. 2010, 33 1239–1247. [CrossRef]47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Effekt av breddegrad og høyde på terpenoid og løselig fenolisk sammensetning av einer (Juniperus communis) nåler og evaluering av deres antibakterielle aktivitet i den boreale sonen. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Effekter av breddegrad og værforhold på fenoliske forbindelser i rips (Ribes spp.) kultivarer. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Antocyanin og flavonolvariasjon i myrbilbær (Vaccinium uliginosum L.) i Finland. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analyse av antocyaninvariasjon i ville populasjoner av blåbær (Vaccinium myrtillus L.) i Finland. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bucar, F. Phytochemistry of lyng (Calluna vulgaris (L.) Hull) og dens altitudinelle endring. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitian, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Sesquiterpene laktoner i Arnica montana: Helenalin og dihydrohelenalinchemotypes i Spania. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotiske andabiotiske faktorer assosiert med høydevariasjon i planteegenskaper og planteetende hos en dominerende eikeart. Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM Metabolomics som et komplement til fylogenetikk for å vurdere intraspesifikke grenser i den uttørkingstolerante medisinske busken Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

55. Siljak-Yakovlev, S.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Muratovic, E.; Basic, N.; Catrice, O.; Brown, CSTowards en database over genomstørrelse og kromosomantall av Balkanflora: C-verdier i 343 taxa med nye verdier for 252. Adv. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcántara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitian, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.; Herrera, CM Geografisk genetisk struktur av iberiske akelejer (gen. Aquilegia). Plantesystem. Evol. 2017,303, 1145–1160. [CrossRef

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Phylogeography of a tough rock-overlevende i europeiske tørre gressletter. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. White Oaks phylogeography in the Iberian Peninsula.Ecol. Manag. 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Påvirkninger av klonalitet på plantes seksuelle reproduksjon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112 8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Effekten av Perilla frutescens-ekstrakter på den oksidative stabiliteten til modell matemulsjoner. Antioksidanter 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolisk sammensetning og antioksidantaktivitet til kenafblader. Ind. avling. Prod. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Siljak-Yakovlev, S.; Vallès, J. Opprinnelse og utvikling av søramerikanske Artemisia-arter (Asteraceae); bevis fra molekylær fylogeni, ribosomalt DNA og genomesize data. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Flowcytometrisk analyse av kjernefysisk DNA-innhold i høyere planter. Phytochem. Anal. 1991, 2.143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL En rask DNA-isoleringsprosedyre for små mengder ferskt bladvev. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Er. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. En ny omskrift av middelhavsslekten Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) basert på plastid- og kjernefysiske DNA-markører. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: En brukervennlig redigerings- og analyseprogram for biologisk sekvensjustering for Windows95/98/NT. Nukleinsyrer Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Forbedring av sensitiviteten til progressiv multisekvensjustering gjennom sekvensvekting, posisjonsspesifikke gap straffer og vektmatrisevalg. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: DNA-sekvenspolymorfismeanalyse av store datasett. Mol. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, versjon 1.2; Institutt for biovitenskap, Aarhus Universitet: Aarhus, Danmark, 2009;Tilgjengelig online: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (åpnet 1. juli 2019).

70. Clement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Et dataprogram for å estimere gengenealogier.Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Programvare med full funksjon for haplotype-nettverkskonstruksjon. Metoder Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Komme i gang med R-kommandøren: Et grunnleggende grafisk brukergrensesnitt til RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Community Ecology Package. R-pakkeversjon 1.17-4. 2010. Tilgjengelig på nett: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (åpnet 19. september 2010).74. Malinowska, H. Utvalgene av bjørnebær (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) fra naturlige populasjoner i Polen. Acta Soc. Bot. Pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]