Fenyletanolglykosider fra Cistanche Tubulosa undertrykker aktivering av leverstellatceller og blokkerer ledningen av signalveier i TGF-01/smad som potensielle antihepatiske fibrosemidler
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang og Tao Liu
Abstrakt: Cistanche tubulosaer en tradisjonell kinesisk urtemedisin mye brukt for å regulere immunitet ogfenyletanoidglykosider(CPhGs) er blant de primære komponentene som er ansvarlige for denne aktiviteten. Tidligere studier har indikert de forebyggende og terapeutiske effektene av CPhG på bovint serumalbumin (BSA)-indusert leverfibrose hos rotter. Målet med studien var å evaluere den antihepatiske fibroseeffekten av CPhGs og monomereneechinacosideogakteosidved å hemme aktivering av hepatisk stellatcelle (HSC), blokkere ledningen av signalveier i transformerende vekstfaktor-p1 (TGF-p1)/smad, og fastslå at de er in vitro hepatobeskyttende aktivitet. HSC-proliferasjon ble åpenbart hemmet etter behandling med CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinakosid (500,250,125 ^g/mL)/acteosid (6, 3 ^g/mL), med IC50-verdier på 119.125.520.349 g/6.949 g/ml mL, henholdsvis i MTT-analysen. Ulike konsentrasjoner av CPhGs/echinacoside/akteosidpåvirket ikke den cellulære toksisiteten på HSC i henhold til målinger av laktatdehydrogenase (LDH). Ulike konsentrasjoner av CPhGs/echinacoside/akteosidøkte mRNA-nivået og proteinekspresjonen til smad7 og reduserte mRNA-nivåene til smad2, smad3 og proteinekspresjonen til smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) i HSC. Oppsummert viser disse resultatene at CPhGs/echinacoside/akteosidkan blokkere ledningen av signalveiene i TGF-p1/smad, og hemme aktiveringen av HSC, noe som tyder på atC. tubulosakan dermed være en potensiell urtemedisin for behandling av leverfibrose.
Nøkkelord: Cistanche tubulosa; fenyletanolglykosider fraCistanche(CPHG);echinacoside; akteosid; hepatiske stellatceller (HSC); TGF-p1/smad
1. Introduksjon
blir proliferative og fibrogene, akkumulerer deretter ECM og differensierer til slutt til fibrogene myofibroblastlignende celler. Transformerende vekstfaktor-.1 (TGF-p 1) anses å være den viktigste profibrogene mediatoren. Signalveien relatert til TGF-&1 er en viktig mekanisme for leverfibrose, og den inkluderer hovedsakelig smad-avhengig og smad-uavhengig signalering, og den smad-avhengige signaltransduksjonsveien antas å være en hovedkanal for TGF-p1-signalering . Derfor kan blokkering av TGF-p1/smad-signalveien undertrykke kollagenproduksjonen og til slutt lindre hepatisk fibrose, noe som har gjort denne veien til et viktig mål i anti-hepatisk fibrose-medisinforskning de siste årene.
Til tross for den høye verdensomspennende forekomsten av leverfibrose, er ingen generelt akseptert antifibrogen terapi tilgjengelig [2-4]. Tradisjonelle kinesiske urtemedisiner (TCHM) er av stor interesse for behandling av leversykdommer fordi noen kan brukes terapeutiske legemidler i håndtering og forebygging av leverfibrose. For tiden er mange studier fokusert på potensielle anti-fibrogene legemidler som har blitt brukt som TCHM i tusenvis av år [5].
Cistanche tubulosa W (familien Orobanchaceae)fa parasittisk plante, dyrkes mye i den sørlige regionen Xinjiang i Kina [6]. Folk bruker den til å fornye nyrene, gi næring til blodet, slappe av tarmene og forsinke alderdom uten bivirkninger, og er offisielt oppført i den kinesiske farmakopéen [7]. C. tubulosa inneholder en rekke aktive komponenter, inkludert fenyletanoidglykosider (CPhGs), iridoider og polysakkarider. Blant de mange aktive komponentene i C. tubulous, er CPhGs, som presenterer en rekke bioaktiviteter (antioksidant, antifatigue, radioresistens, etc.) Pie hovedkarakteristiske komponenter av denne planten. I de siste årene er det rapportert at CPhGis har overflødig Hent-hepatobeskyttende effekter, og kan rense treradikaler, beskytte levermembraner og vise immunregulerende effekter, hemming av apoptose, hemming av uttrykket av hepatitt B overflateantigen (HBs Ag) og hepatitt B e antigen (HBeAg) og hepatitt B-virus (HBV) DNA-replikasjonsaktivitet, etc. HBV DNA-nivå er den mest pålitelige indeksen som direkte gjenspeiler den virale replikasjonsaktiviteten, som er nøkkelfaktoren for å bestemme den naturlige historien til kroniske HBV-infeksjoner, overvåke effekten av oP antiviral terapi, og vurdere prognosen for akutte og kroniske HBV-infeksjoner. De serologiske deteksjonsindeksene for HBV inkluderer hovedsakelig HBsAg, HBeAg, etc. [8—11]. Imidlertid er det få litteraturrapporter om anti-hepatisk fibrose-effekter av CPhG. Tidligere studier har indikert de forebyggende og terapeutiske effektene av CPhGs på bovint serumalbumin (BSA)-indusert leverfibrose hos rotter, men den antifibrogene aktiviteten til CPhGs og dets viktigste monomerer (echinacoside og acteosid, figur 1) har aldri blitt evaluert in vitro.
organisk Cistanche tubulosa
2. Resultater
2.1. Kvantitativ bestemmelse av CPhGs
CPhGs innC. tubulosainneholder ITto fenyletylalkoholglykosider: echinacoside og acteo side, og innholdet i CPhG-ene ble påvist ved HPLC-analyse (figur 1) til å være 42,71 prosent 土 0.42 prosent og 14.27 prosent 土 0.18 prosent, henholdsvis.
2.2. Hemmende aktiviteter av CPhGs, Echinacoside og Acteosid på HSC-T6
CPhGs, echinacosid og acteosid (62.5-500 卩g/mL) hemmet cellelevedyktigheten til HSC på en konsentrasjonsavhengig måte. CPhGs og acteosid viste en bemerkelsesverdig hemmende aktivitet på HSC-celler, med 50 prosent hemming av cellevekstaktivitet (IC50) verdier var henholdsvis 119.125 昭/ml og 6.999 昭/ml. Echinacoside viste moderat hemmende aktivitet (IC50,520.345 昭/ml; tabell 1 og figur 2).
2.3. Celletoksisitet av CPhGs, Echin acoside og Acteorida på HSC
Laktatdehydrogenase (LDH), et stabilt cytoplasmatisk enzym som finnes i alle celler, frigjøres raskt til cellekultursupernatanten ved skade på plasmamembranen. Enzymaktivitet i kultursupernatanten korrelerer med andelen lyserte celver [12]. Som vist i tabell 2, når behandlet med forskjellige: konsentrasjoner av C PhGs, echinacosid og acteosid, selv om LDH-aktivitet viste en liten økning sammenlignet med celle-coirtrol-gruppen, var forskjellen ikke statistisk signifikant (p > 0.05 ), som indikerer at de fleste av cellemembranene beholdt sin integritet, og hemmingen av CPhGs, echinacoside og acteosid på HSC skyldes ikke uspesifikk cellulær toksisitet.
2.4. Effekt av CPhGs, Echinacoside og Acteosde på HSC-spredning indusert av TGF-^i
Spredning, aktivering og differensiering av HSC reguleres av en rekke faktorer. Blant de ulike faktorene som er involvert i leverfibrose, anses TGF {{0}} å være den viktigste, siden den kan aktivere HSC, fremme myofibroblastdifferensiering, øke ECM-syntesen og hemme ECM-nedbrytning og frigjøre kjemokiner og cytokiner involvert i leverfibrose [13]. I denne studien, bortsett fra kontrollgruppen, ble stasjonære HSC-er stimulert med TGF-P1 in vitro for å simulere dannelsen av tidlig leverfibrose, og for å undersøke effekten av CPhG-er, echinakosid og acteosid på TGF-p1- indusert HSC-spredning. Som vist i tabell 3, sammenlignet med kontrollgruppen, fremmet TGF-61-gruppen signifikant spredningen av HSC (p < 0.01).="" sammenlignet="" med="" tgf-p1-gruppen,="" tgf-p1="" pluss="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" pluss="" echinakosid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" pluss="" akteosid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" hemmet="" alle="" bemerkelsesverdig="" spredningen="" av="" hsc-er="" indusert="" av="" tgf-|3="" 1="" i="" ulik="">
2.5. Uttrykk av smad2)smad3 og smad7 mRNA etter CPhGs, ochmacoside og acteaside intervensjon på HSCs
Smad3 og smad2 er viktige nedstrømseffektorer av TTGF-p-signalveien [14,15], og smad7 er en hemmer av smad-signalering. Teoretisk sett kan det økte uttrykket av smad7 eller det reduserte uttrykket av smad2/smad3 blokkere ledningen av signalveier i TGF-p 1/smad. Som vist i figur 3, viste kvantitafiv PCR-analyse i sanntid at mRNA-ekspresjonen av smad2 og smad3 indikerte et lavere nivå, mens smad7 indikerte høyere nivåer i kontrollgruppen, sammenlignet med TGF-|31-gruppen. I gruppen TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) er mRNA-nivået til smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" og="" smad3="" (p="">< 0,01)="" ble="" signifikant="" redusert="" sammenlignet="" med="" tgf-pf-gruppen,="" og="" var="" til="" og="" med="" lik="" kontrollgruppen;="" på="" en="" stund="" ble="" mrna-nivået="" til="" smad7="" betydelig="" økt="" i="" tc-gruppen="" (50,="" 75="" 100="" µg/ml)="" (henholdsvis="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" men;="" smad7-uttrykket="" indikerte="" en="" stigende="" trend="" i="" tc="" 25="" 卩g/ml-gruppen="" sammenlignet="" med="" tgf-p1-gruppen="" (figur="">
I mellomtiden, sammenlignet med TGF-p1-gruppen, var ekspresjon av smad2 og smad3 mRNA signifikant redusert i TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL)-gruppen (p < 0.01),="" og="" uttrykk="" for="" smad7-mrna="" ble="" signifikant="" økt="" i="" te-gruppen="" (125,="" 250="" 500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (figur="" 4)="" .="" tilsvarende="" viste="" ta-gruppen="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" den="" samme="" trenden="" (figur="">
2.6. Påvirkning av CPhGs, Echinacoside og Ac)eosider på T GF-^i/smad signalvei i HSC
TGF-p 1/smad-signalveien avhenger av smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) og smad7, der p-smad2, p-smad3 er de aktiverte formene av smad2 og smad3. I denne studien ble proteinnivåene til omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 og smad7 analysert. Western blot-analyse oppdaget økninger i smad2-, smad3-, p-smad2-, p-smad3-nivåene av TGF-p1, og hemmingen av disse økningene av CPhGs, ec hinacoside og acteosid; i mellomtiden avslørte wesiern blot-analyse oppregulerte smad7-nivåer av CPhGs, echinacoside og acteosid. (Fi gurene 6–8).
Som vist i figur 6, sammenlignet med c on2rol-gruppen (proteinuttrykkene til smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 ble signifikant økt, og smad7-proteinekspresjonen ble redusert i TGF-p1-gruppen. I TC (25 , 50, 75, 100 昭/ml) medikamentgrupper, smad/ (figur 6A), p-smad2 (figur 6B), smad 3 (figur 6C), p -smad3 (Figur 6D) uttrykk var betydelig lavere enn det i TGF-p1-gruppen (卩 < 0,01), og smad7 (Figur 6E)-proteinekspresjonen var høyere enn for TGF-S1-gruppen (p < 0,01) (Figur 6).
Samtidig ble uttrykkene ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 og smad7 protein målt etter echinacoside og acteosid intervensjon på HSC. Som vist i figur 7 og 8 ble smad2-, smad3-, p-smad2- og p-smad3-proteinekspresjonsnivåene signifikant hemmet (p < 0.05="" eller="" p="">< 0.01="" ),="" var="" smad7-proteinekspresjonsnivået="" forhøyet="" (p="">< 0,01),="" sammenlignet="" med="" tgf-p="" 1-gruppen="" (figur="" 7="" og="">
3. Diskusjon
Leverfibrose er en av de ledende årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden, men svært begrensede terapeutiske alternativer er tilgjengelige for denne tilstanden, derfor er det svært viktig for oss å søke potensielle mål for terapeutisk intervensjon for å forhindre utvikling av leverfibrose [ 16]. Nylig har forskere funnet ut at ulike urtemedisiner har hepatobeskyttende mot fibrotiske effekter. Mange TCHM-er som Fufang Biejia Ruangan-piller [17] og Xiao-chai-hu-avkok (shosaiko til i Japan) [18,19] har blitt mye brukt til å behandle leverfibrose i Kina, Korea og Japan i tusenvis av år. C. tubulosa inneholder en rekke aktive komponenter inkludert CPhGs, iridoider og polysakkarider. Som en av de effektive materialbasene til C. tubulosa har CPhG utmerket hepatobeskyttende aktivitet, men det er begrenset informasjon om de anti-fibrotiske effektene av GPhC og dets relaterte forbindelser. I denne studien undersøkte vi hvordan CPhGs, echinacoside og acteosid undertrykker HSC-aktivering og blokkerer signalveiledningen i TGF-p1/snaad som potensielle antihep atic fibrosemidler in vitro.
Leverskade av enhver etiologi vil til slutt føre til aktivering av HSCs, som gjennomgår transdifferensiering til fibrogene myofibroblast-lignende celler [20]. Det vil si at myofibroblaster
er avledet fra aktivering og spredning av HSCss [21], og det blir sett på som mediator for dannelse av hepatisk fibrose. Av denne grunn utførte vi in vitro-studier for å sammenligne cellelevedyktighetsratene til HSCs utsatt for CPhGs, echinacoside og acteosid. Resultatene viste at hemmende effekt av acteosid på HSC var sterkest, og effekten av CPhGs var bedre enn echinacoside. CPhGs, echinacosid og acteosid-medisinerte sera hemmet alle HSC-proliferasjon på en doseavhengig måte.
LDH er et cytoplasmatisk enzym i levende celler, og det kan ikke trenge gjennom cellemembranen under normale omstendigheter. Når cellene er skadet, øker membranpermeabiliteten og LDH frigjøres til cellens ytre. Vanligvis kan LDH oppdage graden av celleskade [{{0}}]. Undersøkelsen viste at LDH-aktiviteten til CPhGs, echinacoside og acteosid medisinert serum bare viste en svak økning sammenlignet med cellekontrollgruppen, og forskjellen var ikke statistisk signifikant (p > 0,05), noe som indikerer at det meste av cellemembranen beholdt sin integritet , og inhibering av HSCs av CPhGs, er echinacosid og acteosid ikke på grunn av uspesifikk cellulær toksisitet.
Når leverskade oppstår, kan aktiverte hepatocytter frigjøre TGF-pi som igjen aktiverer HSC-T6, derfor har TGF-pi et nært forhold til fibrose [25-27]. I denne studien kunne CPhGs, echinacoside og acteosid betraktes som en attraktiv terapeutisk strategi for hemming av HSC-proliferasjon etter at HSC-er ble stimulert med wTGF-pi in vitro. Vi spekulerer i at CPhGs, echinacoside og acteosid kan brukes som en slags behandling og/eller forebygging av leverfibrose, og hemmer dannelsen av tidlig leverfibrose. Dannelsen av leverfibrose er en kompleks prosess med multifaktor- og multicelle-involvering. I denne patologiske prosessen utgjør celle-celle, celle-cytokiner og celle-matrise-interaksjoner et tungvint nettverk. I dette nettverket kan utviklingen av leverfibrose reguleres med forskjellige signalveier og midler. TGF-pi er en klassisk aktivator av HSC og en nøkkelmediator i patogenesen av leverfibrose [28]. CPhGs, echinacoside og acteosid kan hemme uttrykkene av TGF-pi/smad pathway-relatert mRNA og proteiner i HSCs.
TGF-pi utøver sine cellulære effekter via smad-signalveien, og det har blitt ansett som en nøkkelmediator i utviklingen av leverfibrose og betennelse. Ved binding av TGF-pi til TGF-p-type II-reseptoren, fosforylerer type II-reseptorkinase GS-domenet til TGF-p-type I-reseptoren, noe som fører til aktivering av type I-reseptoren [29]. Via virkningen av p-smad2 og p-smad3 ved to serinrester i SSXS-motivet til deres C-terminal, aktiveres reaksjoner nedstrøms for smad-signalveien ved aktivering av type I-reseptor [30]. P-smad2 og p-smad3 danner oligomere komplekser med smad4, går deretter inn i kjernen og utøver sin biologiske transkripsjonsaktivitet. Dermed overfører smad-proteiner signaler direkte fra reseptorkinasen til kjernen [3i]. På den annen side er smad7 fast kombinert med TGF-pi-reseptor, noe som fører til manglende evne til smad 2/3 til å bli aktivert samt hemming av signaltransduksjonsveiene [32]. Smad7 kan virke for å hemme p-smad2 og p-smad3, nukleær translokasjon av aktiverte smad-komplekser og aktivering av (CAGA) (9)-MLP-Luc, noe som resulterer i redusert kollagen I-ekspresjon og fullstendig hemming av TGF-p-signaltransduksjon [33,34]. Resultatene våre viste at CPhGs, echinacoside og acteosid kan redusere smad2 og smad3 mRNA uttrykk, og øke smad7 mRNA uttrykk; hemme smad2-, p-smad2-, smad3- og p-smad3-proteinuttrykk, og oppregulere smad7-proteinuttrykk, noe som tyder på at CPhGs, echinacoside og acteosid også spiller en rolle i å hemme HSC-aktivering og dermed hemme leverfibrose, noe som fremhever et potensielt anti-fibrotisk middel. mekanisme.
Sekvensen av de hepatobeskyttende effektene til de tre testmidlene ble vist å være akteosid > CPhGs > echinakosid. For ytterligere å belyse årsakene til forskjellene i mekanismen som CPhGs, echinacoside og acteosid beskytter mot leverfibrose, ble deres kjemiske strukturer analysert. Fenetylalkoholglykosiddelen ser ut til å være en essensiell struktur for den hepatobeskyttende effekten [35]. Akteosid (C29H36Oi5) er et dobbeltglykosid, og echinakosid (C35H46O20) er et triglykosid, dvs. at echinakosid har et ekstra glykosid i strukturen sammenlignet med akteosid, noe som fører til en økning i romstørrelsen. Den hepatobeskyttende eller hemming av HSC-aktiviteten til akteosid er bedre enn den til echinakosid, noe som kan være på grunn av eksistensen av sterisk hindring.
beskytte leveren: cistanche-ekstrakt
4. Eksperimentell del
4.1. Kjemikalier og reagenser
TGF-pi ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). HSC-T6-cellelinjen ble kjøpt fra Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Kina). Dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Smad2, smad3 og smad7 primere ble produsert av Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Kina). Revert Aid første streng cDNA syntesesett ble kjøpt fra Thermo Scientific (Shanghai, Kina). Quantifast SYBR grønne PCR-settet ble kjøpt fra QIAGEN GmbH (Hilden, Tyskland). p-smad2 (ser465/467) antistoff, Smad3 (C67H9) kanin mAb og p-smad3 (ser423/425) kanin mAb ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Smad7-antistoff ble kjøpt fra Boster (Wuhan, Kina). Smad2 polyklonalt antistoff og p-aktin monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Proteintech (Wuhan, Kina). Påvisning av primært antistoff ble gjort ved å bruke 2 graders antistoffløsning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) og 2 graders antistoffløsning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mus) kjøpt fra Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Laktatdehydrogenaseanalysesett var fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).
4.2. Plantemateriale
C. tubulosa ble samlet inn fra Tulufan, i den autonome regionen Xinjiang Uirghur i Kina, i mai 2006. Plantematerialene ble identifisert som C. tubulosa av Jiang He, Institute of Materia Medica i Xinjiang. Et kupongprøve ble deponert ved Institute of Materia Medica i Xinjiang i Kina.
4.3. Isolering og rensing av CPhGs og dets forbindelser
Tørkede og oppskårne jordstengler av C. tubulosa (6,0 kg) ble ekstrahert tre ganger under tilbakeløp med 70 prosent etanol (4,8 L), og løsningsmidlet ble deretter fjernet fra de kombinerte ekstraktene til for å gi etanolekstraktet (1,146 kg). Etanolekstraktene ble renset med AB-8-harpiks for å oppnå det urene fenyletanolglycoside-ekstraktet (CPhG s). Etter d-oppløsning i vann ble den ekstra akten renset ved AB-8 ad sorpsjon makroporøs harpikskromatografi for å oppnå de totale fenyletanolglykosidene fra C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhGs ble påført på en ODS OP{{10}}-kolonne og eluert suksessivt med blandinger av MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Eluater ble kombinert i fem underfraksjoner i henhold til TLC-oppførsel ved bruk av løsningsmiddelsystemet CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Flekker ble visualisert etter spraying med 1 prosent FeCih. Ulike fraksjoner ble gjentatte ganger renset ved Sephadex LH-20 kolonnekromatografi med metanol som elueringsmiddel, og to fenyletanolglykosider ble isolert fra CPhGs. Deres strukturer ble bekreftet som echinacosid (C35H46O20) og acteosid (C29H36O15) ved bruk av MS, 1H- og MC-NMR [35], hvilke renheter ble bestemt til å være henholdsvis 99,17 prosent og 98,92 prosent ved UV-HPLC. Strukturene til ekinakosid og akteosid er vist i figur 9.
4.5. Kvantitativ bestemmelse av CPhGs
Væskekromatografi (HPLC) (LC{{0}}Et HPLC-instrument, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) ble brukt for å analysere innholdet av echinacoside og et cteosid i CPhG-ene. En Phenomenex Gemini ODS-kolonne (250 x 4,6 mm, 5 |^m) ble brukt ved 30 grader. En isokratisk mobil fase bestående av metanol-acetonitril-1 prosent eddiksyre (15:10:75, v/v/v) ble brukt i en kjøring på 40 minutter, med en strømningshastighet på 0,6 ml/min, med UV deteksjon ved 334 nm.
4.6. Cellekultur
HSC-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (High Glucose) (DMEM, Beijing, Kina) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IE/mL penicillin og 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) i en fuktet inkubator ved 37 grader med 5 prosent CO2. Disse cellene ble regelmessig subkulturert med trypsin 0,25 prosent (1x) løsning (HyClone, Logan, UT, USA) og mediet ble skiftet hver 2. dag. Til å begynne med ble celler dyrket med DMEM inneholdende 10 prosent FBS i 48 timer. Mediet ble deretter erstattet med DMEM uten FBS for å sulte cellene i 12 timer. Disse cellene ble forplantet i 48 timer og etter 48 timer ble serum sultet med 0,5 prosent FBS i 12 timer før det ble tilsatt 5 ng/ml TGF-&1,
4.7. Bestemmelse av IC50-verdier
Etter en inkubering over natten i sultmedium inneholdende {{0}},5 prosent FBS, ble HSC-celler sådd i en 96-brønnplate med en tetthet på 5 x 104 celler/ml i 24 timer. HSC-celler ble behandlet med CPhGs, echinacosid og acteosid i forskjellige konsentrasjoner (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 og 500 ^g/mL) i 48 timer. Hver konsentrasjon hadde fire brønner. På slutten av behandlingen, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid] (Sigma; 5 mg/ml) ble tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer. DMSO (200 rL) ble tilsatt til hver brønn etter fjerning av supernatanten. Etter risting av platen i 10 minutter på en shaker, ble IC50-verdiene oppnådd ved å måle absorbansen ved 490 nm bølgelengde ved bruk av et enzymmerkingsinstrument (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), denne analysen ble utført tre ganger. IC50-verdiene for CPhGs, echinacoside og acteosid var henholdsvis 119.125, 520.345 og 6.999 Rg/mL.
4.8. Celleproliferative hemmende effekter og cellelevedyktighet
HSC-celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av CPhGs (25,50,100 Rg/mL), echinacosid (125,250,500 Rg/mL) og acteosid (1,5,3, 6 Rg/mL). Ulike konsentrasjoner av CPhGs, echinacoside og acteosid ble påført på platen i fire påfølgende brønner og inkubert i 48 timer. Celleproliferasjonshemmingseffektene og nivået av cellelevedyktighet (basert på måling av LDH-aktivitet frigjort fra skadede celler inn i supernatanten [36]) ble bestemt ved en MTT-analyse. Inhiberingshastigheten ble beregnet ved å bruke følgende formel [37]:
Inhiberingsrate ( prosent ) " [1 — (gjennomsnittlig absorbans av eksperimentell gruppe/gjennomsnittlig absorbans for blindkontrollgruppe)] x 100 prosent
I henhold til settets instruksjoner,
LDH (U/L) {{0}} (Målt OD — kontroll OD)/(standard OD — blankOD) x 0,2 mmol/L x 1000
Vår foreløpige studie viste at CPhGs, echinacosid og acteosid ikke påvirket cellenes levedyktighet.
4.9. Anti-proliferative aktiviteter av TGF-^1
HSC aktivert av TGF-p1 har lenge vært ansett for å være assosiert med leverfibrose, og hemming av HSC-vekst har blitt foreslått som en metode for behandling av leverfibrose [36,38]. De anti-proliferative effektene av CPhGs, echinacoside og acteosid på HSCs aktivert av TGF-p1 ble bestemt ved en MTT-analyse [39]. Ved å bruke prosedyrene og medikamentkonsentrasjonene som beskrevet,
eksperimentelle grupper inkluderte kontrollgruppen, TGF-pi-gruppen, TGF-pi pluss forskjellige konsentrasjonsmedisingrupper. Alle cellegruppene bortsett fra kontrollgruppen ble dyrket med DMEM som inneholdt 5,0 ng/ml TGF-p1 (uten FBS) i 24 timer. Hemmende aktivitet på celleproliferasjon ble beregnet som 100 x (absorbans av behandlet forbindelse - absorbans av bakgrunnslys)/(absorbans av modell - absorbans av bakgrunnslys).
4.10. Omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
mRNA-ekspresjonsnivået til smad2, smad3 og smad7 ble bestemt ved sanntids-PCR. For å bestemme mRNA-ekspresjon i HSC-celler, ble cellene (5 x 104 celler) sådd i seks-brønns plater med 3.0 ml DMEM med 10 prosent FBS og inkubert over natten ved 37 grader og 5 prosent CO2. Etter at kulturmediet ble endret til serumfritt DMEM, ble CPhGs (100,50,25 卩g/ml), echinacosid (500,250,125 昭/mL) og acteosid (6, 3,1,5 ^g/ml) tilsatt til brønnene. Etter inkubasjon i 48 timer med CPhGs og monomersammensetninger, ble total-RNA ekstrahert ved bruk av TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og omrørt kraftig med kloroform i 15 s. Etter å ha fått stå ved romtemperatur i 3 minutter, ble lysatet sentrifugert ved 12, 000 xg i 15 minutter ved 4 grader. RNA i den vandige fasen ble utfelt med isopropanol, og den øvre vandige fasen ble overført til et nytt mikrosentrifugerør. RNA ble presipitert ved å tilsette 0,75 prosent etanol, hvoretter mikrosentrifugerøret og sentrifugert ved 12, 000 xg ved 4 grader i ikke mer enn 5 minutter. Supernatanten ble fjernet og RNA ble tørket ved romtemperatur i 5-10 min. Primerne (Sangon) ble designet ved bruk av Batch Primer 3, og er oppført i tabell 4. Resultatene ble normalisert til mRNA fra husholdningsgenet p-actin som en intern kontroll og presenteres som relative mRNA-nivåer. Reaksjoner ble utført med 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM primerpar, 8,5 destillert vann og 2,5 rL cDNA.
Hver polymerasekjedereaksjon ble utført under følgende forhold: 95 grader i 3 minutter, deretter 40 sykluser på 10 s ved 95 grader, 30 s ved 55 grader og 10 s ved 55 grader -95 grader for forlengelse, etterfulgt av en enkelt fluorescensmåling. De endelige resultatene ble beskrevet med de relative verdiene (2_AACt). Beregningen og analysen ble utført av iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Western blot-analyse
Helcelleekstrakter ble fremstilt ved å bruke Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.) med 1 prosent Halt proteasehemmer og 1 prosent Halt fosfatase inhibitor cocktailer (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Det totale proteinet ble brukt til påvisning av smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 og smad7. Proteinkonsentrasjonen ble målt og kvantifisert ved Bradford-metoden. Protein (10-30 Rg) ble separert på en 10 prosent SDS-PAGE gel og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Boston, MA, USA). Membraner ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med 5 prosent bovint serumalbumin, og de primære antistoffene (smad2 polyklonalt antistoff, p-smad2 antistoff, smad3 kanin mAb og p-smad3 kanin mAb, 1:1000 fortynning; kanin mAb 1 smad7, smad3 :200 fortynning, p-aktin monoklonalt antistoff, 1:5000 fortynning) ble inkubert ved 4 grader over natten. Den tilsvarende Alk-Phos. konjugerte sekundære antistoffer ble inkubert ved romtemperatur. Til slutt ble membranene vasket tre ganger med 1 x Tris-HCl saltvann med 0,1 prosent Tween 20, og signalene ble skannet og visualisert av et GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometrisk analyse ble utført på proteinene av interesse og normalisert til p-aktin av GEL DOC Image Studio programvare (Bio-Rad). p-actin ble brukt som internkontroll.
4.12. Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt 土 standardavvik (SD). Statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS 16.0-programvaren (Xinjiang Medical University). Probitanalyse ble brukt til å analysere IC50-verdier. Signifikansen av forskjellen ble beregnet ved enveis ANOVA-test, og verdier med p < 0,05="" ble="" ansett="" som="" statistisk="">
5. Konklusjoner
Som konklusjon viser CPhG fra C. tubulosa og dets komponenter echinacosid og acteosid betydelige anti-fibrotiske effekter. Blant dem er aktiviteten til akteosid den kraftigste, mens aktiviteten til CPhG-ene er mellom de to forbindelsene. Hemming av aktivering av TGF-p1/Smad-signalering kan være den underliggende mekanismen som CPhG beskytter mot kronisk leversykdom assosiert med fibrose, og echinakosid og acteosid er den effektive anti-fibrotiske materialets basis for C. tubulosa.
Anerkjennelser:Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81260624). Forfatterne vil gjerne uttrykke sin oppriktige takk til professor Tao Liu for hans forbedring av skrivingen i denne artikkelen.
Forfatterbidrag:TL, JZ, S.-PY, LM og S.-LZ unnfanget og designet eksperimentene. S.-PY, TL og JZ analyserte dataene. S.-PY og JZ skrev manuskriptet. TL, LM og JZ gjennomgikk manuskriptet. Alle forfattere leste og godkjente det endelige manuskriptet.
Interessekonflikter:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Referanser
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Utvikling av fytomedisin for leversykdommer. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Sykdomsmekanismer: Mekanismer for hepatisk fibrose og terapeutiske implikasjoner. Nat. Clin. Prak. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Hepatiske lipocytter: De viktigste kollagenproduserende cellene i normal rottelever. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Reversering av leverfibrose一Fakta eller fantasi? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Forstå mekanismen for hepatisk fibrose og potensielle terapeutiske tilnærminger. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Ravn; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. I Flora of China, 23. utg.; Redaksjonskomité for Flora of China: Chinese Academy of Sciences, Beijing, Kina, 2013; s. 1-16.
7. Chinese Pharmacopoeia Commission of Sanitary Ministry of People's Republic of China. kinesisk farmakopé; Del 1; Chemical Industry Publishing House: Beijing, Kina, 2010; s. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Effekt av roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) på reproduksjonstoksisitet hos mus indusert av glykosid av Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Hake. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE- og blodplateaggregeringshemmere fra Tamarix hohenackeri Bunge (vertsplante til Herba Cistanches) som vokser i Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Forbedring av dekstransulfat-natrium-indusert kolitt hos mus med echinacoside-anriket ekstrakt av Cistanche tubulosa. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimulerer cellulær glutationredoks-syklus av reaktive oksygenarter generert fra mitokondriell respirasjon i H9c2-kardiomyocytter. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Sur fosfatase: Endepunkt for in vitro toksisitetstester. Vitro celle. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 modulerer matrisemetalloproteinase-13-ekspresjon i hepatiske stellatceller ved komplekse mekanismer som involverer p38MAPK, PI3-kinase, AKT og p70S6k. Er. J. Physiol. Gastrointest Lever Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load regulerer beindannelse og Sclerostin-ekspresjon gjennom en TGFp-avhengig mekanisme. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun assosieres med onkoproteinet Ski og undertrykker Smad2 transkripsjonsaktivitet. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Han, M.; Scott, C.; et al. En vitamin D-reseptor/SMAD genomisk krets gir hepatisk fibrotisk respons. Celle 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Effekter av Fufang Biejia Ruangan-piller på hepatisk fibrose in vivo og in vitro. World J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Urtemedisin Sho-saiko-to (TJ-9) øker ekspresjonsmatrisemetalloproteinaser (MMPs) med redusert ekspresjon av vevsinhibitor av metalloproteinaser (TIMPs) i rottestjerneceller. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Rollen til TGF-01 og cytokiner i moduleringen av leverfibrose av Sho-saiko-to i rotte/s gallekanalligert modell. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biokjemiske markører, ekstracellulære komponenter i leverfibrose og skrumplever. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Kilde og rolle til myofibroblaster i leverfibrose. Hake. Pharmacol. Okse. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Iskemi-reperfusjonsmodell i rotteryggmargen: Cellelevedyktighet og apoptosesignaleringsstudie. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toksisitet av nanopartikler og en oversikt over gjeldende eksperimentelle modeller. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]