Fytokjemisk analyse, in vitro antiproliferativ, antioksidant del 2
Apr 21, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
a-glukosidasehemmende analyse
En fortynningsserie med fraksjoner ble laget for å gi konsentrasjoner på 100,200,300.400 og 500mg/ml. Reaksjonsblandingene inneholdt 0,1 ml 1 U/ml -glukosidaseløsning blandet med 0,2 ml av en ekstraktfortynning og 0,5 ml 100 mM fosfatbuffer, pH 6,8. Blandingene ble inkubert ved 37 grader i 15 minutter. Deretter 0,2 ml 5 mM p-nitrofenyl-D-galaktopyranosidPNPG ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og inkubasjonen ble forlenget i ytterligere 20 minutter ved 37 grader. Reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 0,1 M NazCO3. Absorbansen ble registrert ved en bølgelengde på 405 nm for alle prøver. Akarbose ble brukt som en positiv kontroll ved samme konsentrasjoner som planteekstraktene. Resultatene ble uttrykt som prosentvis hemming i henhold til følgende ligning:
der Ag er absorbansen uten en enzymhemmer, og As er absorbansen i nærvær av enzymhemmeren [26].
Cellelinjer og MTS-analyse
HeLa- og MCF7-kreftcellelinjer ble hentet fra ATCC, cellene ble dyrket i RPMI-1640-medier supplert med 10 prosent føtalt bovint serum, 1 prosent penicillin/streptomycin-antibiotika og 1 prosent L-glutamin. Celler ble dyrket i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2 ved 37 grader. Celler ble sådd med 2,6 × 10* celler/brønn i en 96-brønnplate. Etter 48 timer var cellene konfluente, mediet ble endret. Celler ble deretter inkubert med forskjellige bladfraksjonskonsentrasjoner fra 0,25-10 mg/ml R. rothschildianus i 24 timer. Cellelevedyktighet ble vurdert
med CellTilter 96 grader Aqueous One Solution Cell Proliferation (MTS)-analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Promega Corporation, Madison, WI). Kort fortalt, ved slutten av behandlingen ble 20 ul MTS-løsning per 100 ul medium tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 grader i 2 timer. Absorbanser ble målt ved 490 nm [27,28].
Statistisk analyse
Alle de oppnådde resultatene av de fire studerte plantefraksjonene (antioksidant, anti-lipase,anti-amylase, anti-glykosidase, ogcytotoksisitetaktiviteter) ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD standardavvik; resultatet ble ansett som signifikant når p-verdien var<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">
Resultater
Fytokjemisk screening
Resultatene av de foreløpige fytokjemiske testene på R. rothschildianus vandige fraksjoner viste tilstedeværelse av saponin, fenoler, protein, stivelse og flavonoider. Metanolekstraktet viste tilstedeværelsen av komplekse polysakkarider, fenoler, proteiner og flavonoider, mens fenoler, tanniner og flavonoider ble observert i acetonfraksjonen, og i heksanfraksjonen ble det identifisert fenoler, tanniner og flavonoider, glykosider, terpenoider og steroider. som vist i tabell 1. For ekstraksjonsprosessen viste imidlertid metanol det høyeste prosentvise utbytte ved 29,4 prosent, etterfulgt av acetonfraksjonen ved 16,5 prosent. Den vandige ekstraksjonen ga 10,6 prosent, mens det laveste utbyttet (7,3 prosent) var i heksanfraksjonen (tabell 2).
Kvantitativ analyse av TPC, TFC og TTC For evaluering av TPC, TFC og TTC ble absorpsjonsverdiene (Abs) for flere konsentrasjoner av gallussyre-, rutinsyre- og katekinstandardene (STDs) oppnådd, og angående disse punktene , ble det oppnådd tre ligninger for hver STD versus dens konsentrasjoner for å beregne det totale innholdet av fenol, flavonoid og tannin i heksan, aceton, metanol og vandige R. Rothschild-diagnosefraksjoner er presentert i tabell 3.
Cistanche kan forbedre immuniteten
Antioksidant aktivitet
Resultatene av å vurdere den frie radikalfjernende aktiviteten til fire fraksjoner fra R. rothschildianus-blader, ved bruk av Trolox som en potent antioksidantstandardreferanse, ble uttrykt som prosentvis DPPH-hemming (fig. 1 og tabell 4). Derfor kunne R. rothschildianus-blader betraktes som en urtekilde for antioksidanter, og for acetonfraksjonen, som viste en ICso-verdi på 6,3±0,4 ug/ml. Lignende resultater ble også oppnådd for heks-an-fraksjonen, som hadde en ICso-verdi på 7,9±1,3 ug/ml (tabell 4). Resultatene ble sammenlignet med Trolox, en potent antioksidantforbindelse, med en også lik 3,1±0,9 ug/ml. Derimot viste den vandige fraksjonen bare moderat antioksidantaktivitet, med en høyere ICso-verdi på 19,9±0.7ug/ml, mens metanolekstraktet var inaktivt i denne analysen.
Lipase hemmende aktivitet
I denne analysen ble anti-fedmeaktiviteten til fraksjoner fra R. rothschildianus bladekstrakt sammenlignet med aktiviteten til
orlistat, et kraftig lipasehemmende middel (fig. 2 og tabell 4). R. rothschildianus-blader var en utmerket alternativ naturlig kilde til lipasehemmende midler. Acetonfraksjonen viste en ICso-verdi på 26,3±0.6ug/ml, som var svært nær den for referanseforbindelsen orlistat (12.3±0.3ug/ml). Heksan- og metanolfraksjoner registrerte bare moderate ICso-verdier, lik henholdsvis 39,8±0.3ug/ml og 60,3±0.4ug/ml; mens den vandige fraksjonen var inaktiv.
a-Amylase hemmende aktivitet
I denne analysen ble anti-amylaseaktiviteten til fraksjoner fra R. rothschildianus-bladekstrakt sammenlignet med den til akarbose, et kraftig a-amylasehemmende middel (fig. 3). Acetonfraksjonen var den mest potente hemmeren av -amylase, med en ICso på 19.0±0.7 ug/ml, sammenlignet med 28.8±1.2 ug/ml for akarbose, referanseforbindelsen. Dette antydet at R. rothschildianus kan være et kraftig urtemiddel mot diabetes. Den vandige fraksjonen viste bare moderat aktivitet i denne analysen med en ICso-verdi på 45,7±0,3 ug/ml, mens heksan hadde en ICso-verdi på 354,8±1,2 ug/ml. Metanolfraksjonen var inaktiv mot -amylase-enzymet. også ble verdier beregnet for de fire fraksjonene (tabell 4).
a-glukosidase hemmende aktivitet
Resultatene for a-glukosidase ble sammenlignet med resultatene for akarbose, et sterkt enzymhemmende middel, og også verdier ble beregnet for de fire fraksjonene (tabell 4 og fig. 4). Acetonfraksjonen utøvde den største hemmende virkningen på -glukosidase med en ICso på 54,9±0.3 ug/ml, sammenlignet med akarbose, referanseforbindelsen, ved 37.1±{{10} },3 ug/ml. Derimot viste metanolekstraktfraksjonen bare moderat inhibering av -glukosidase, med en ICso på 251,2±0,4 ug/ml, mens heksan og vandige fraksjoner var inaktive i denne analysen.
Anti-proliferativ aktivitet
Resultatene av behandling av HeLa- og MCF7-kreftceller med fem forskjellige konsentrasjoner i mg/ml for forskjellige ekstrakter viste at aktiviteten mot HeLa-kreftcellelinjen var bedre enn mot MCF7-kreftcellelinjen. Imidlertid var heksanekstrakt den mest potente
ekstrakt ved 4mg/ml konsentrasjon med inhiberingsprosent på 98,9 og 97,4 prosent mot henholdsvis HeLa og MCF7 kreftcellelinjer, mens metanolekstrakt i samme konsentrasjon viste potent aktivitet mot HeLa og MCF7 kreftcellelinjer med 97,2 og 95,6 prosent hemmingsprosent. HeLa-celleprosentvis hemming ved eksponering for fraksjoner fra R. rothschildianus-blader ble dokumentert, sammenlignet med den positive kontrollen doksorubicin (fig. 5a). MCF7-cellers prosentvise hemming ble på samme måte bestemt for de fire fraksjonene fra R. rothschildianus-blader, sammenlignet med kontrollen (fig. 5b).
Diskusjon
DPPH-radical scavenging-analysen er velkjent som en enkel metode for å oppdage antioksidantkapasitet i forbindelser. DPPH er et stabilt fritt radikal som gir en lilla farge i alkoholløsninger, og ved reduksjon i nærvær av hydrogendonerende antioksidanter, gjør løsningen fargeløs [29]. Derfor kunne R. rothschildianus-blader betraktes som en naturlig kilde til antioksidanter, spesielt for acetonfraksjonen, som viste en ICso-verdi på 6,3±0.4ug/ml. Lignende resultater ble også oppnådd for heksanfraksjonen, som hadde en ICso-verdi på 7,9±1,3 ug/ml (tabell 4). Resultatene ble sammenlignet med Trolox, en potent antioksidantforbindelse, med en også lik 3,1±0.9 ug/ml. Derimot viste den vandige fraksjonen bare moderat antioksidantaktivitet, med en høyere ICso-verdi på 19,9±0,7 ug/ml, mens metanolekstraktet var inaktivt i denne analysen. Disse resultatene stemte overens med tilstedeværelsen av fenoler og flavonoider i planten, en kraftig rensekilde for frie radikaler som vist med DPPH i denne studien. Disse resultatene var i tråd med mangfoldet av fenoliske forbindelser i planter, enkle fenoler som gallussyre og mer sofistikerte fenolsyrer som antocyaniner, hydroksylkanelsyrederivater og flavonoider. Alle disse klassene av forbindelser har fått omfattende oppmerksomhet på grunn av deres mange fysiologiske funksjoner, spesielt frie radikaler som fjerner, anti-mutagene, anti-inflammatoriske og anti-kreftfremkallende aktiviteter [30]. Som oppført i tabell 3, registrerte acetonekstrakten det høyeste innholdet av både fenolforbindelser og flavonoider, henholdsvis 28,2±0,8mg GAE/g og 107,3±4,6mg RU/g. En tidligere rapport om noen Rumex-arter fant fenoliske forbindelser i et etanolekstrakt fra blader av Rumex vicarious L., som muligens var involvert i frie radikaler, og reduserte det stabile brukte DPPH-radikalet til et gulaktig farget difenylpikrylhydrazin-derivat fra dets opprinnelige fiolett. farge [31].
R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 prosent er funnet ved in vitro-tester i mange forskjellige familier, inkludert Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra og Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. og Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),
(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. og Ericaceae Vaccinium myrtillus L.), og Fabaceae (Pisum sativum L. og Phaseolus vulgaris L.)[33].
Acetonfraksjonen var den mest potente hemmeren av -amylase, med en ICso på 19.0±0.7ug/ml, sammenlignet med 28.8±1.2ug/ml for akarbose, referanseforbindelsen. Dette antydet at R. rothschildianus kan være et kraftig urtemiddel mot diabetes. Den vandige fraksjonen viste bare moderat aktivitet i denne analysen med en ICso-verdi på 45,7±0,3 ug/ml, mens heksan hadde en ICso-verdi på 354,8±1,2 ug/ml. Metanolfraksjonen var inaktiv mot -amylase. En mulig forklaring på at den vandige fraksjonen er en god enzymhemmer var tilstedeværelsen av saponiner. Tidligere vitenskapelige undersøkelser fant at saponiner var bioaktive mot diabetes [34]. Den kraftige effekten av acetonekstraktfraksjonen mot amylase kan skyldes det høye innholdet av både fenolforbindelser og flavonoider. Corchorus olitorius-eksperter -amylase- og -glukosidasehemmende effekter på grunn av bestanddeler, spesielt fenoliske forbindelser som kaffesyre [35].
Acetonfraksjonen utøvde den største hemmende virkningen på a-glukosidase med en ICso på 54,9±0.3ug/ml, sammenlignet med den for akarbose, referanseforbindelsen, ved 37.1±0.3ug/ml . Derimot viste metanolekstraktfraksjonen bare moderat hemming av a-glukosidase, med en ICso på 251,2±0.4 ug/ml, mens heksan- og vandige fraksjoner var inaktive i denne analysen. Den tredje kategorien av orale hypoglykemiske midler inkluderer -glukosidasehemmere. Det finnes en rekke -glukosidasehemmere, som akarbose og voglibose, som vanligvis finnes i plantekilder. De viser verdifull stabilisering av blodsukkernivået etter et måltid og har blitt brukt klinisk i behandlingen av diabetes mellitus [36, 37].
Resultatene av behandling av begge kreftcellene (HeLa og MCF7) med ulike konsentrasjoner i mg/ml for forskjellige ekstrakter viste at den generelle aktiviteten mot HeLa-kreftcellelinjen var bedre enn MCF7-kreftcellelinjen. Heksanekstraktet viste kraftig antikreftaktivitet ved en konsentrasjon på 4 mg/ml med inhiberingsprosent på 98,9 og 97,4 prosent mot henholdsvis HeLa- og MCF7-kreftcellelinjer, mens metanolekstrakt i samme konsentrasjon viste potent aktivitet mot HeLa- og MCF7-kreftcellelinjer med 97,2 og 95,6 prosent inhiberingsprosent. Fra de tidligere resultatene utøvde heksanfraksjonen en betydelig cytotoksisk effekt på både HeLa- og MCF7-celler, med inhiberingsprosenter som nådde henholdsvis 99 og 92,4 prosent ved 4 mg/ml heksanfraksjonskonsentrasjon. Dette stemte overens med de cytotoksiske effektene av både terpenoider og steroider, som ble funnet i heksanfraksjonen. Diosgenin, et naturlig forekommende steroid og triterpenoid som finnes i enkelte planter, har vist seg å hemme brystkreft [38, 39].
Konklusjon
Resultatene fra denne studien på R. rothschildianus-blader indikerte at acetonekstraktfraksjonen hadde betydelig potensiale for å gi fytoterapi for diabetes og fedme, basert på dens kraftige hemming av lipase, a-amylase og a-glukosidase. I tillegg viste acetonfraksjonen også en betydelig frie radikalfjernende aktivitet. På den annen side viste heksanfraksjonen betydelig hemming av både HeLa- og MCF7-cellelinjer, noe som kan være relatert til dets høye innhold av terpener og steroider. Disse observasjonene i denne studien kan føre til ytterligere in vivo-studier for å utvikle nye naturlige farmasøytiske formuleringer som er effektive i behandlingen av fedme, diabetes mellitus og noen kreftformer.
Denne artikkelen er hentet fra Jaradat et al. BMC Complementary Medicine and Therapies (2021) 21:107
