Blodplatehemming forhindrer NLRP3-inflammasomaktivering og sepsis-indusert nyreskade

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez, et al

Abstrakt:

Blodplater, cellulære mediatorer av trombose, aktiveres under sepsis og blir i økende grad anerkjent som mediatorer av immunresponsen. Blodplateaktivering er betydelig økt hos sepsispasienter sammenlignet med ICU-kontrollpasienter. Til tross for denne korrelasjonen, er rollen til aktiverte blodplater i å bidra til sepsis patofysiologi fortsatt uklar. Vi har tidligere demonstrert NOD-lignende reseptorprotein 3 inflammasom (NLRP3) inflammasomaktivering i sepsis-induserte blodplater fra cecal-ligation puncture (CLP) rotter. Aktiverte blodplater var assosiert med økt lungeødem og glomerulær skade i CLP vs. SHAM-kontroller. I denne studien undersøkte vi om hemming av blodplateaktivering ville svekke NLRP3-aktivering og nyre- og lungeskade som respons på CLP. CLP ble utført i Sprague Dawley (SD) hann- og hunnrotter (n=10/gruppe) for å indusere abdominal sepsis og SHAM-rotter fungerte som kontroller. En undergruppe av CLPanimals ble behandlet med Clopidogrel (10 mg/kg/dag, CLP pluss CLOP) for å hemme blodplateaktivering. 72 timer etter CLP ble blodplateaktivering og NLRP3-inflammasomsamling evaluert, IL-1 og IL-18 ble målt i plasma, og vev, nyre- og lungepatologi og nyrefunksjon ble vurdert. Aktiverte blodplater var 7,8 ± 3,6 prosent i Sham, 22 ± 6 prosent i CLP og signifikant redusert til 14,5 ± 0,6 prosent i CLP pluss CLOP (n=8–10/gruppe, p < 0,05)="" .="" nlrp3-inflammasomsammenstilling="" ble="" hemmet="" i="" blodplater="" av="" clp="" pluss="" clop-dyr="" vs.="" clp.="" signifikante="" økninger="" i="" plasma-="" og="" nyre-il-1="" og="" il-18="" som="" respons="" på="" clp="" ble="" redusert="" med="" clopidogrel-behandling.="" nyreskade,="" men="" ikke="" lungehistologi="" eller="" nyrefunksjon="" ble="" forbedret="" i="" clp="" pluss="" clop="" vs.="" clp.="" disse="" dataene="" gir="" bevis="" for="" at="" aktiverte="" blodplater="" kan="" bidra="" til="" sepsis-indusert="" nyreskade,="" muligens="" via="" nlrp3-aktivering="" i="" blodplater.="" blodplater="" kan="" være="" et="" terapeutisk="" mål="" for="" å="" redusere="" nyreskade="" hos="" septiske="">

Nøkkelord:sepsis; NLRP3; blodplater; klopidogrel; multi-organ skade; endotelaktivering;betennelse

cistanche tubolosa-ekstrakt: anti-inflammasjon

1. Introduksjon

Sepsis er en livstruende dysregulert vertsinflammatorisk respons på et smittestoff [1] og en av de viktigste dødsårsakene i verden. Minst 1,7 millioner voksne i Amerika utvikler sepsis og nesten 270000 amerikanere dør som følge av sepsis årlig [2]. Sepsis fører til multiorgandysfunksjon inkludert akutt lungeskade (ALI) [3],akuttnyreskade(AKI) [4,5], blant annet hematologisk dysfunksjon og dysfunksjon i sentralnervesystemet. Et økende antall organer involvert i sepsis er assosiert med økt dødelighet [6]. Nåværende behandlingsmodaliteter fokuserer på støttende omsorg; dødeligheten er imidlertid fortsatt høy. Det er rapportert at omtrent 35 til 50 prosent av dødsfallene på sykehus skyldes sepsis [7]. Det er avgjørende å identifisere et terapeutisk mål som kan forbedre dødeligheten på grunn av sepsis.

Blodplater har blitt anerkjent som å ha en rolle i immunitet [8,9], i tillegg til deres rolle i hemostase og trombose. Trombocytopeni ses ofte ved sepsis og antas å oppstå på grunn av blodplateaktivering og forbruk; dens rolle i sykdomsprosessen er imidlertid fortsatt uklar. Trombocytopeni er assosiert med utvikling av (multiorgansvikt) MOF og økt 90-dagers dødelighet [10–14]. Blodplater kan være en integrert del av den inflammatoriske responsen på sepsis. En potensiell mekanisme som blodplater kan bidra til skade på flere organer er gjennom aktivering av det NOD-lignende reseptorprotein 3-inflammasomet (NLRP3). NLRP3 er en cytosolisk immunsignalreseptor som fører til caspase-1-mediert spaltning og aktivering av IL-1B og IL-18 og har vært implisert i patogenesen av inflammatoriske sykdomsprosesser som astma [15 ], Parkinsons [16], inflammatorisk tarmsykdom [17] og sepsis [18]. Hemming av NLRP3-inflammasomsamling har vist seg å være beskyttende mot sepsis-indusert organskade [19–23]. Vi har tidligere demonstrert at NLRP3-inflammasom aktiveres i blodplater som respons på cecal ligation-puncture (CLP) og er assosiert med multiorganskade som respons på polymikrobiell sepsis i en 72 timers CLP-rottemodell. I denne studien antok vi at blokkering av blodplateaktivering med Clopidogrel (CLOP) ville redusere NLRP3-inflammasomaktivering, nyre- og lungeskade som respons på polymikrobiell sepsis.

cistanche flavonoider: anti-inflammasjon

2. Resultater

2.1. Plateaktivering og NLRP3 Inflflammasommontering

Ved å bruke flowcytometri bestemte vi prosenten av blodplateaktivering blant gruppene. Vi fant at blodplateaktivering ble økt hos CLP-rotter med 22 ± 6 prosent, sammenlignet med SHAM 7,8 ± 3,6 prosent (p < 0.{{10}}5),="" og="" svekket="" i="" clp="" pluss="" clop-rotter="" med="" 14,5="" ±="" 0,6="" prosent="" (p="">< 0,05,="" figur="" 1).="" nlrp3-inflammasomsammenstilling="" i="" blodplater="" ble="" vurdert="" ved="" å="" visualisere="" samlokaliseringen="" av="" nlrp3="" med="" apoptoseassosiert="" flekklignende="" protein="" (asc)="" ved="" bruk="" av="" immuncytokjemi="" (figur="" 2).="" samlokalisering="" av="" inflammasomkomponenter="" i="" clp-blodplater="" var="" 83="" ganger="" større="" sammenlignet="" med="" sham-blodplater="" (figur="" 2c).="" videre="" ble="" samlingen="" av="" inflammasomet="" redusert="" i="" blodplater="" av="" clp="" pluss="" clop="" sammenlignet="" med="">

2.2. Inflflammasom-assosierte cytokiner

NLRP3-aktivering resulterer i frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 og IL-18 i deres aktive former. Vi målte begge cytokinene i plasma,lunge, ognyrehomogenisererav SHAM, CLP og CLP pluss CLOP via ELISA. Plasma-IL{{0}} økte signifikant fra 9 ± 21 pg/mL i Sham til 77 ± 31 pg/mL i CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" figur="" 3a).="" administrering="" av="" clopidogrel="" viste="" en="" reduksjon="" i="" plasma="" il="" -1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml;="" reduksjonen="" var="" imidlertid="" ikke="" statistisk="" signifikant="" sammenlignet="" med="" clp="" (p="">< 0.05="" vs.="" sham).="" tilsvarende="" var="" nyre-il-1="" forhøyet="" i="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" sammenlignet="" med="" sham="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3b).="" behandling="" med="" clopidogrel="" reduserte="" renal="" il-1="" signifikant="" til="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" i="" lungene="" var="" il-1="" signifikant="" økt="" fra="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" i="" sham="" til="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" i="" clp="" (p="">< 0,05)="" og="" var="" ikke="" signifikant="" forskjellig="" i="" clopidogrel-behandlede="" dyr="" (80="" ±="" 23="" pg)="" g,="" figur="">

Plasma IL{{0}} var ikke påviselig hos SHAM-rotter; gjennomsnittlig plasma IL-18 var imidlertid 26 ± 6 pg/ml i CLP. Viktigere, administrasjon av Clopidogrel resulterte i lavere nivåer av plasma IL-18 (12 ± 9 pg/ml; p < 0.{{20}}5,="" figur="" 3d).="" tilsvarende="" var="" nyre-il{{10}}="" forhøyet="" i="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" sammenlignet="" med="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" behandling="" med="" clopidogrel="" reduserte="" renal="" il-18="" til="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3e).="" i="" lungene="" ble="" il-18="" signifikant="" økt="" fra="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" i="" sham="" til="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" i="" clp="" (p="">< 0,05)="" og="" forble="" forhøyet="" i="" clopidogrel-behandlede="" dyr="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" p="">< 0,05="" vs.="" sham,="" figur="">

2.3. Endotelaktivering

Vi målte plasmanivåer av angiopoietin{{0}} og endocan som markører for endotelaktivering i Sham-, CLP- og CLP pluss CLOP-grupper via ELISA. Plasmaendokan ble signifikant økt fra 1234 ± 327 pg/mL i Sham til 1978 ± 306 pg/mL i CLP (p < {{20}}.05="" vs.="" sham).="" endocan="" ble="" signifikant="" redusert="" til="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" i="" clopidogrel-behandlede="" clp-rotter="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" figur="" 4a).="" lignende="" resultater="" ble="" funnet="" for="" angiopoietin-2.="" angiopoietin-2="" ble="" signifikant="" økt="" fra="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" i="" sham="" til="" 56="" 767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" i="" clp="" (p="">< 0,05="" vs.="" sham)="" og="" ble="" signifikant="" redusert="" hos="" klopidogrel-behandlede="" rotter="" til="" 22="" 486="" ±="" 13="" 616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" figur="">

2.4. Lungeskade

Histologisk analyse av lungene fra hver gruppe viste en signifikant økning i nøytrofilinfiltrasjon med en gjennomsnittlig poengsum på {{0}}.6 ± 0.2 hos CLP-rotter sammenlignet med en poengsum på {{6} }.10 ± {{10}}.10 hos falske rotter (p < 0.05).="" vi="" observerte="" også="" at="" administrering="" av="" clopidogrel="" til="" clp-rotter="" ikke="" endret="" nøytrofilinfiltrasjon="" (score="" 0,5="" ±="" 0,4,="" figur="" 5a).="" lignende="" resultater="" ble="" funnet="" i="" alveolær="" veggtykkelse="" med="" en="" signifikant="" økning="" i="" clp="" med="" en="" gjennomsnittlig="" tykkelse="" på="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" sammenlignet="" med="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" i="" sham-rotter="" (p="">< 0,05).="" administrering="" av="" klopidogrel="" til="" clp-rotter="" forbedret="" ikke="" alveolær="" veggtykkelse="" (figur="">

2.5. Nyreskade

Som vi tidligere har publisert, gikk GFR betydelig ned fra 2,1 ± 0,8 mL/min/100 g, men hos falske rotter til {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/min/100 g, men i CLP-rotter (p < 0,05).="" administrering="" av="" clopidogrel="" viste="" forbedret="" gfr="" til="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" men="" sammenlignet="" med="" clp,="" men="" ikke="" statistisk="" signifikant="" (figur="" 6a).="" histologisk="" analyse="" viste="" økt="" glomerulær="" skade="" i="" clp-gruppen="" sammenlignet="" med="" sham.="" clopidogrel-behandling="" forbedret="" glomerulær="" skade="" betydelig="" hos="" clp-dyr="" (figur="">

cistanche helsemessige fordeler: bedre nyrefunksjon

3. Diskusjon

Sepsis er en dysregulert immunrespons mot et smittestoff, ofte assosiert med multiorgansvikt og kjent for å ha høy dødelighet. Det er behov for identifisering av en ny terapi som kan modulere den inflammatoriske responsen og redusere dødeligheten. Blodplater har blitt postulert å ha en rolle i immunmodulering. Naturligvis har koagulasjonskaskaden og blodplateaktiveringen vært et fremtredende fokus i undersøkelsen. Administrering av protein C, et antikoagulant endogent enzym, har vært assosiert med forbedret overlevelse hos pasienter med alvorlig sepsis [24]. I Japan inkluderer retningslinjer for sepsis bruk av tidsbestemt antitrombinadministrasjon hos septiske pasienter med DIC og har vist forbedrede resultater [25]. Dette antyder at hemming av blodplateaktivering kan forbedre resultatene ved sepsis. Den inflammatoriske responsen under sepsis er definitivt kompleks og kan involvere mer enn én vei. Vi har tidligere publisert at blodplater fra CLP polymikrobiell sepsis-modell har økt plateplate NLRP3-montering/aktivering og var assosiert med lunge- og nyreskade [26]. I denne studien bestemte vi oss for å bestemme rollen til blodplatehemming i den inflammatoriske responsen i samme modell ved å bruke P2Y12-hemmeren, Clopidogrel.

Som tidligere publisert ble blodplateaktivering økt som respons på polymikrobiell sepsis i CLP-modellen sammenlignet med Sham-rotter. Vi fant at administrering av Clopidogrel reduserte blodplateaktiveringen hos CLP-rotter, og interessant nok ble det også observert en reduksjon i samlingen av NLRP3-inflammasom i blodplater. Vi fant også en trend i avtagende sirkulerende IL-1B og IL-18 i plasma fra Clopidogrel-behandlede dyr sammenlignet med CLP-gruppen. I en tidligere publisert studie rapporterte vi at direkte hemming av NLRP3-inflammasom med MCC950 resulterte i redusert IL-1B og IL-18 i plasma [27]. Dette tyder på at hemming av blodplateaktivering med Clopidogrel og reduksjonen i inflammatoriske cytokiner i denne sepsismodellen delvis er mediert av NLRP3-mekanismer. Derfor må ytterligere studier utføres for å tydeligere definere de inflammatoriske veiene mediert av NLRP3 i blodplater.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 prosent [28]. Vi har tidligere publisert at økt blodplateaktivering var assosiert med multippel organdysfunksjon og skade i CLP-rottemodellen [26]. Dataene våre viser en betydelig nedgang i IL-1 og IL-18 inyrerav klopidogrel-behandlede dyr. Kombinasjonen av akutt nyresvikt og sepsis er assosiert med 70 prosent dødelighet, sammenlignet med 45 prosent dødelighet blant pasienter med akutt nyresvikt alene [29]. Glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) er en indikator pånyrefunksjonog avtar med økt nyreskade. Clopidogrel-behandling forbedret nyreskade hos CLP-rotter, noe som tyder på at blodplateaktivering kan spille en rolle i utviklingen av sepsis-indusert AKI.

Fordeler med cistancheekstrakt: forbedrer nyrefunksjonen

I samsvar med dens rolle i å forårsake MOF, er utviklingen av ALI og akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) vanlig hos sepsispasienter og resulterer ofte i behov for mekanisk ventilasjon i denne pasientpopulasjonen. Bevis tyder på at blodplateaktivering spiller en viktig rolle i utviklingen av MOF hos septiske pasienter [8,30]. Tidligere studier har støttet dette ved å vise redusert nøytrofilinfiltrasjon i lungene til CLP-induserte septiske mus etter blodplatetarm [28]. Videre har Liverani et al. rapporterte at mus forbehandlet med Clopidogrel var resistente mot sepsis-indusert ALI [31]. Den nåværende studien var imidlertid ikke i stand til å vise noen signifikante bevis på redusert IL- 1, nøytrofilinfiltrasjon eller alveolar veggtykkelse i lungene. Dette kan skyldes bruk av en annen dyreart, en dose Clopidogrel og andre forskjeller i eksperimentell design.

Kapillærlekkasje er et fremtredende trekk ved sepsis. Proteiner som den vaskulære vekstfaktoren angiopoietin-2 er kjent for å fremme betennelse, endoteldysfunksjon og er assosiert med økt sykehusdødelighet hos pasienter med sepsis [32]. Endocan er en annen markør for endotelcelledysfunksjon og har vært relatert til alvorlighetsgraden av sykdom og utfallet av septiske pasienter [33]. Vi fant også at disse markørene for endotelaktivering og dysfunksjon var forhøyet i CLP-modellen, og reduserte i Clopidogrel-behandlingsgruppen. Tilsvarende observerte vi en liten, men ubetydelig økning i GFR i den klopidogrelbehandlede gruppen. Dette antyder at blodplateaktivering har en viss modulerende effekt på den inflammatoriske responsen på sepsis.

I denne studien ble ikke hemming av blodplateaktivering oversatt til signifikante forbedringer i organfunksjonen. Det er mulig at den valgte dosen på 10 mg/kg/dag var tilstrekkelig til å svekke blodplateaktivering, NLRP3-aktivering, cytokiner og markører for endotelaktivering, men ble ikke oversatt til svekkelse av lungeskade eller forbedring av nyrefunksjonen. Liverani, et al. tidligere brukt en startdose på 30/mg/kg/dag i villtype- og P2Y12-knock-out-mus, noe som ble oversatt til hemming av sepsis-indusert lungeskade [31]. I samme studie ble Clopidogrel administrert før induksjon av sepsis. Denne store forskjellen kan forklare mangelen på signifikante forbedringer i lunge- eller nyrefunksjonen observert i vår studie.

Mens den nåværende studien antyder en rolle for blodplateaktivering i å bidra til betennelse og endotelaktivering som respons på sepsis, er det begrensninger som bør noteres. For det første, mens markører for endotelaktivering ble målt, er ytterligere eksperimenter for å vurdere endotelfunksjon berettiget. Dessuten ble ikke bidraget fra andre blodplateavledede faktorer kontrollert for i denne studien. Dermed er det fortsatt ubesvarte spørsmål om hvordan blodplater bidrar til sepsis-indusert patologi og organsvikt.

Klopidogrels rolle i å redusere dødelighet ved sepsis har vært kontroversiell med rapporter om redusert forekomst av ARDS og mekanisk ventilasjon, men ingen reduksjon i dødelighet [34]. Ytterligere studier må utføres for å bestemme den nøyaktige mekanismen som blodplater bidrar til organskade og dysfunksjon ved sepsis. Denne studien støtter videre utforskning av blodplater som et terapeutisk mål hos septiske pasienter.

cistanche tubolosa helsemessige fordeler: forbedrer nyrefunksjonen

4. Materialer og metoder

4.1. Dyr

Sprague Dawley hann- og hunnrotter kjøpt fra Envigo (Indianapolis, IN, USA) ble brukt. Alle eksperimentelle prosedyrer utført i denne studien var i samsvar med National Institutes of Healths retningslinjer for bruk og stell av dyr. Alle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Mississippi Medical Center. Pleie og håndtering av dyrene var i samsvar med National Institutes of Healths retningslinjer for etisk dyrebehandling.

4.2. Cecal ligering og punktering

Alle våre in vivo-eksperimenter ble utført på 12- til 13-uke gamle hann- og hunnrotter som veide omtrent 225–325 g. Dyrene ble tilfeldig delt inn i to grupper: sham-operasjonsgruppen (SHAM, n=10) og cecal ligeringspunkturgruppen (CLP, n=10). Under isofluran anestesi ble CLP-operasjonen utført på en undergruppe av rotter for å indusere abdominal polymikrobiell sepsis som vi tidligere har beskrevet [26,27]. Forvarmet saltvann (20 ml/kg, 37 ◦C) ble injisert subkutant umiddelbart etter operasjonen for gjenopplivning. Sham-opererte dyr gjennomgikk den samme kirurgiske prosedyren uten blindtarmsbinding eller punktering. Rottene ble plassert tilbake i burene sine etter operasjonen, og mat og vann ble gitt ad libitum. 24 timer etter CLP ble det tidligere snittet gjenåpnet og den nekrotiske blindtarmen ble forsiktig skåret ut. Bukhulen ble vasket med 10 ml varm steril saltløsning. Magesnittet ble igjen lukket i lag. Dyrene ble administrert et bredspektret antibiotikum daglig (Naxcel 5 mg/kg) og analgesi ble oppnådd med buprenorfin SR (1,2 mg/kg) i løpet av den 72 timer lange eksperimentelle perioden. Blodplateaggregering ble blokkert ved daglig administrering av Clopidogrel (10 mg/kg/dag) i 3 dager i en undergruppe av CLP-rotter (CLP pluss CLOP; n=12) via esophageal sonde i 3 dager. På slutten av protokollen ble dyrene ofret under dyp anestesi. Blod og vev ble samlet inn for videre analyse.

4.3. Isolering av blodplater

Arterielt blod ble trukket inn i syre-sitrat-dekstrose-vakutainerrør og sentrifugert ved 200× g i 20 minutter for å oppnå blodplaterikt plasma. Blodplaterikt plasma (PRP) ble blandet med et likt volum HEP-buffer (140 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 3,8 mmol/L HEPES, 5 mmol/L EGTA, pH 7,4) inneholdende 1 µM PGE1. Denne blandingen ble deretter sentrifugert ved 100 x g i 20 minutter for å pelletere de gjenværende RBC og WBC hvor 40 µL av supernatanten ble brukt til å telle blodplater. PRP ble deretter sentrifugert ved 800 x g i 20 minutter, supernatanten ble kastet og pelleten ble resuspendert i Tyrodes buffer (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHC03, 2,9 mmol/L KCl, 0,34 mmol/L Na2HPO4,1 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES) som inneholder 5 mmol/L glukose og 3 mg/ml BSA.

4.4. Flowcytometri

Nyisolerte blodplater (106) ble resuspendert i 50 µL av Tyrodes buffer. Blodplater ble inkubert (RT i 30 minutter) med fluorescein-isotiocyanat (FITC)-konjugert anti-mus CD41 (Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) og Allophycocyanin (APC) konjugert anti-mus/rotte CD62P (Clone RMP { {9}}, Biolegend). Minst 10,000 hendelser per gate ble innhentet ved hjelp av en MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) og analysert med FlowLogic-programvare (Innovation, Sydney, Australia). Blodplater ble kjennetegnet ved spesifikk binding av anti-CD41 og karakteristisk spredning forover og på siden. Blodplater som farget positive for CD41 og CD62P ble betegnet som aktiverte blodplater.

4.5. Konfokal og lysmikroskopi

Blodplater (107) fra sham- eller CLP-rotter eller stimulert med eller uten LPS fikk feste seg til permanox-objektglass (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Adhererte celler ble fiksert i 10 prosent formalin i 30 minutter, vasket 3 ganger med PBS i 10 minutter ved RT og permeabilisert med iskald 100 prosent metanol i 10 minutter. Objektglassene ble blokkert i PBS med 10 prosent geite- og kaninserum i 1 time, vasket og inkubert med kanin-anti-NLRP3-antistoff (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) i 2 timer ved RT. Objektglassene ble deretter vasket og inkubert med anti-kanin Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble vasket igjen og inkubert med Alexa Fluor647-konjugert kanin-anti-ASC-antistoff (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) i 1 time ved romtemperatur. Kontroller ble behandlet identisk, bortsett fra utelatelsen av de primære antistoffene. Preparatene ble montert i Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) og analysert på et Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA) konfokalt skanningsmikroskop. Bildene ble tatt med et Nikon Eclipse 55i-mikroskop utstyrt med et Nikon-Fi1-fargekamera (Nikon) og analysert med NIS-Elements D 3.0-programvare.

4.6. Kvantifisering av biomarkører for endotelaktivering og cytokiner

Plasmanivåer av Angiopoietin-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) og Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) ble målt som markører for endoteldysfunksjon ved ELISA iht. til produsentens protokoll. Plasma,nyre, og lunge-IL-1 (RLB00, R&D Systems) og IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, USA) ble kvantifisert ved ELISA i henhold til produsentens protokoll.Nyrerog lungelysater ble fremstilt med BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll.

4.7. Vurdering av lungeskade

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 nøytrofiler i alveolrommet. Bildene ble tatt med et Nikon Eclipse 55i-mikroskop utstyrt med et Nikon DS-Fi1 fargekamera (Nikon Inc.) ved 40X ved hjelp av NIS-Elements D 3.0 programvare. Alveolar veggtykkelse ble målt ved bruk av NIS-Elements D 3.0 programvare. Data ble normalisert til falske verdier.

4.8. Vurdering av nyre glomerulær skade

Nyrerwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 prosent tap av kapillærer i tuften. Bildene ble tatt med samme mikroskop, kamera og programvare som nevnt tidligere.

4.9. Måling av nyrefunksjon

Under CLP-prosedyren ble et kateter satt inn i halsvenen og eksteriorisert subkutant på baksiden av nakken. Kateteret ble spylt med heparinisert saltvann hver dag til slutten av tre-dagers protokollen. På den siste dagen av protokollen gjennomgikk rottene kort isofluranestesi for å sette sammen NIC-Nyre-enheten (MediBeacon; Mannheim, Tyskland) laget av to lysemitterende dioder som eksiterer FITC sinistrin ved 480 nm, en fotodiode som sender ut lys ved 531 nm, en mikroprosessor og et batteri. Denne enheten ble festet til baksiden av rotten ved hjelp av en dobbeltsidig klebende lapp (MediBeacon) og festet med en gnagerjakke til et barbert område på ryggen av rotten. Rotter fikk komme seg i separate bur i 15 minutter og en grunnlinjemåling ble registrert. Etter baseline-målinger ble en bolusinjeksjon av FITC-sinistrin (5 mg/100 g kroppsvekt; FTC-FS001, MediBeacon) administrert via halsvenen etterfulgt av en bolusinjeksjon av sterilt saltvann. I løpet av en to-timers periode etter bolusinjeksjonen ble utskillelseskinetikk av FITC-sinistrin målt transkutant og ble brukt til å beregne eliminasjonshalveringstiden (t1/2) av FITC-sinistrin ved bruk av en ettromsmodell med MDPLab-evalueringsprogramvaren (MediBeacon) for å beregne GFR fra en validert empirisk utledet konverteringsfaktor [35,36].

cistanche anmeldelse: forbedrer nyrefunksjonen

4.10. Statistisk analyse

Potensanalyse bestemmer at en n på 10–12 dyr/gruppe ville oppnå en potens(1- ) på 0.80 og en sannsynlighet for type 1 feil ( ) på 0,05 for å oppdage en forskjell på minst 5–10 prosent i blodplateaktivering mellom Sham- og CLP-rottene. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Alle data ble sjekket for å være konsistente med Gaussisk distribusjon ved D'Agostino-Pearson normalitetstesten. Statistiske analyser ble utført med enveis ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest som post hoc analyse. En verdi på p < 0,05="" ble="" ansett="" som="" statistisk="">

Forfatterbidrag:

Konseptualisering, CAS, JMW og DCC; metodikk, JMW og D.CC; validering, OKT, JMW og DCC; formell analyse, MB-R., CAS, OKT, JMW og D.CC; undersøkelse, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW og DCC; ressurser, JMW og DCC; datakurering, MB-R., CAS og DCC; skriving – originalutkast, MB-R. og CAS; skriving – gjennomgang og redigering, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW og DCC; visualisering, MB-R., CAS, JMW og DCC; tilsyn, OKT og DCC; prosjektadministrasjon, DCC; finansieringsanskaffelse, DCC Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute Of GeneralMedical Sciences of the National Institutes of Health under Award Number P20GM104357 og P30GM103328. Denne forskningen ble finansiert av National Heart Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Numbers F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) og R01HL151407 (DCC), og National Institute of Diabetes and Digestive ogNyreSykdommerfra National Institutes of Health under Award Number R01DK109133 (JMW) Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:

Alle eksperimentelle prosedyrer utført i denne studien ble utført i samsvar med National Institutes of Healths retningslinjer for bruk og stell av dyr. Alle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Mississippi Medical Center (Protokoll 1487A, godkjent 07/02/2019). Pleie og håndtering av dyrene var i samsvar med National Institutes of Healths retningslinjer for etisk dyrebehandling.

Datatilgjengelighetserklæring:

Alle data til støtte for de rapporterte resultatene er presentert i manuskriptet og er fritt tilgjengelig.

Interessekonflikter:

Forfatterne uttrykker ingen interessekonflikt.

Referanser

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Blodplater og multiorgansvikt i sepsis. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; et al. Forekomst og trender av sepsis i amerikanske sykehus ved bruk av kliniske vs. kravdata, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB Sepsis og akutt respiratorisk distress-syndrom: Nylig oppdatering. Tuberc. Respir. Dis. (Seoul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Sepsis-assosiert akutt nyreskade. Semin. Nephrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Gentile, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Nylige fremskritt innen patofysiologi og biomarkører for sepsis-indusert akutt nyreskade. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Multippel organsvikt hos septiske pasienter. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Sykehusdødsfall hos pasienter med sepsis fra 2 uavhengige kohorter. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Utover trombose: Den allsidige blodplaten ved kritisk sykdom. Chest 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; fransk, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Blodplate Colloquium, P. Blodplatefunksjoner utover hemostase. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Rollen til blodplater i sepsis. Thromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Blodplatefunksjon i septiske multiple organdysfunksjonssyndromer. Intensiv Med. 1997, 23, 379–385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; et al. Sepsisprediksjon hos kritisk syke pasienter ved blodplateaktiveringsmarkører ved innleggelse på intensivavdeling: En prospektiv pilotstudie. Intensiv Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Blodplater og leukocyttaktivering korrelerer med alvorlighetsgraden av septisk organdysfunksjon. Sjokk 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombocytopeni og prognose i intensivbehandling. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Målrettet NLRP3-inflammasomaktivering ved alvorlig astma. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Målrettet mot det mikrogliale NLRP3-inflammasomet og dets rolle i Parkinsons sykdom. MOV. Uorden. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Ja, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ME; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; et al. Den patogene rollen til NLRP3-inflammasomaktivering i inflammatoriske tarmsykdommer hos både mus og mennesker. J. Crohns kolitt 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. NLRP3-inflammasomet og dets rolle i sepsisutvikling. Betennelse 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin hemmer NLRP3-inflammasomaktivering ved sepsis-indusert akutt lungeskade, som involverer hem oksygenase-1. Int. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.

20. Moon, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; et al. UCP2-indusert fettsyresyntase fremmer NLRP3-inflammasomaktivering under sepsis. J. Clin. Undersøk. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Curcumin undertrykker NLRP3-inflammasomaktivering og beskytter mot LPS-indusert septisk sjokk. Mol. Nutr. Mat Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Eksogent karbonmonoksid reduserer sepsis-indusert akutt nyreskade og hemmer NLRP3-inflammasomaktivering hos rotter. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Trailer, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Stone, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Komplementindusert aktivering av hjerte-NLRP3-inflammasomet i sepsis. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; et al. og rekombinant humant protein CWEiSSsg. Effekt og sikkerhet av rekombinant humant aktivert protein C for alvorlig sepsis. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699–709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Nåtid og fremtid for antikoagulantbehandling ved bruk av antitrombin og trombomodulin for sepsis-assosiert disseminert intravaskulær koagulasjon: Et perspektiv fra Japan. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travis, OK; Hvit, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 inflammasomaktivering i blodplater som respons på sepsis. Physiol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, OK; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3-inflammasomhemming demper sepsis-indusert blodplateaktivering og forhindrer skade på flere organer i en cecal-ligeringspunktur. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Blodplater støtter pulmonal rekruttering av nøytrofiler ved abdominal sepsis. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Akutt nyresvikt og sepsis. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Blodplatefunksjon ved sepsis. Crit. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12-reseptor modulerer sepsis-indusert betennelse. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Elias, JA; Siegel, MD Forhøyede serumangiopoietin 2-nivåer er assosiert med økte
dødelighet ved sepsis. Sjokk 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, en ny endotelmarkør i human sepsis. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajic, O.; Cartin-Ceba, R. Utfall av alvorlig sepsis og septisk sjokkpasienter på kronisk antiplatelet-behandling: En historisk kohortstudie. Crit. Care Res. Prak. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Farmakologisk profil og toksisitet av fluorescein-merket sinistrin, en ny markør for GFR-målinger. Naunyn-Schmiedebergs bue. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pill, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Fluorescein-merket sinistrin som markør for glomerulær filtrasjonshastighet. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.