Poly- og oligosakkarid Ulva Sp. Fraksjoner fra enzymassistert ekstraksjon modulerer stoffskiftet 2
Aug 31, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
3. Diskusjon
Vårt hovedmål er å evaluere de potensielle biologiske aktivitetene til poly- og oligosakkaridfraksjoner fra Ulon sp. oppnådd etter en innovativ Enzyme-Assisted Extraction (EAE) prosess, som er kjent for å forbedre utbyttet av ekstraksjon [5] og tillate en betydelig fraksjonsanriking i ulvaner sammenlignet med maserasjon [36], på metabolismen av hudfibroblaster i menneskelig hud i kultur.
Et fokus på uttrykket av hud ekstracellulære matrisekomponenter (ECM) involvert i den anabole banen (spesielt type I og Ⅲ kollagener, GAGs og TIMP-1) og i den katabolske banen (MMP-1) ble gjort. på proteomisk og transkriptomisk nivå. I dette arbeidet antok vi at på grunn av den høye sammensetningen av karbohydrater og uronsyrer i fraksjonene, er aktiviteten relatert til ulvan (poly- og oligosakkarid) sammensetning. Likevel bør forfatterne ikke overse at polysakkarid-ulvaner fra Uloa sp. celleveggen er nært knyttet til proteiner, som også er kjent for å fremme total kollagen- og hyaluronsyreproduksjon in vitro i humane dermale fibroblaster [39]. Derfor antyder forfatterne at disse aktivitetene kan være relatert til en synergi mellom ulvaner og proteiner, selv om fokuset er satt på ulvaner i dette manuskriptet. 3.1. Virkning av poly- og oligosakkarid Uloa-fraksjoner fra EAE på ECM-fibroblastermetabolisme
Tidligere studier har vist at fraksjoner fra Uloa sp.Cistanche Extract Anti Radiation(råulvaner og ulvaner med lav molekylvekt) har evnen til å modulere normal proliferasjon av humane dermale fibroblaster [36-38]. Resultatene våre indikerte at både poly- og oligosakkaridfraksjoner fra EAE induserte en signifikant økning i fibroblastmetabolsk aktivitet (opptil pluss 68 prosent). Disse resultatene bekreftet tidligere foreløpige publiserte data fra forfatterne [36] og tidligere arbeid med hydrolysert Uloa pertusa-ekstrakt ved 250 ug/mL som induserte betydelig pre- og senescent fibroblastproliferasjon [38]. Metabolsk aktivitetsøkning ble ikke ledsaget av cytotoksisitetseffekten til fraksjonene (evaluert ved LDH-analyse), noe som betyr at bioaktivitetsresultatene til poly- og oligosakkarid Uloa-fraksjoner fra EAE ikke er partisk av en cytotoksisk effekt i området av testede konsentrasjoner. Resultatet vårt er i samsvar med tidligere studier som fremhever ulvaner som ikke-cytotoksiske forbindelser på forskjellige celletyper (makrofagcellelinjer, tarmceller, fibroblaster, celler fra mus og Vero-celler) [13,14,4]
cistanche kan anti-aldring
Som nevnt i introduksjonen, interagerer type I- og III-kollagener og GAG-er sammen for å etablere et molekylært nettverk for ECM-montering i dermis. I denne studien har således proteinsyntese og mRNA-nivåekspresjon av hovedkomponenter av dermis ECM (type I og Ⅲ kollagener, og GAG enten sulfaterte og ikke-sulfaterte) blitt undersøkt i nærvær av poly- og oligosakkarid Ullon sp. fraksjoner fra EAE. Videre ble MMP-1, et nøkkelenzym involvert i type I kollagennedbrytning (katabolismevei til ECM) og dets vevsinhibitor TIMP-1 involvert i reguleringen også vurdert ved protein- og mRNA-nivåer.
Resultatene avslørte at både poly- og oligosakkarid Ulva-fraksjoner fra EAE forbedret total kollagensyntese ved 1000 ug/mL (opptil pluss 2 prosent evaluert med Red sirius-analyse og signifikante resultater bortsett fra DEP-AD PP-UE). Disse resultatene skiller seg fra en tidligere studie der råvarebiler og ulvaner med lav molekylvekt ikke har noen signifikant effekt på total kollagensyntese [37]. Resultatene våre er imidlertid i samsvar med tidligere arbeid, som viste at L-rhamnoserike polysakkaridpreparater (ROPs) fra Klebsiella pneumonia-stammer stimulerer kollagensyntesen[45]. Faktisk inneholder humane dermale fibroblaster et lektinsted som er i stand til å gjenkjenne -L-rhamnose [46]. På denne måten kan rhamnose-delen av ulvan-fraksjonen gjenkjennes av den humane dermale fibroblasten og deretter fremme kollagensyntese. Spesielt ble type I kollagensyntese økt for alle fraksjoner i ELISA (signifikant for UE og DS-UE) og i Western blot-analyser (NS). Dette resultatet er i samsvar med tidligere litteratur om hydrolyserte Ulva pertusa-ekstrakter [38] og depolymeriserte galaktofukaner (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaFaktisk, i vår studie hadde ulvanene med lav molekylvekt ingen effekt på GAG-produksjonen (inkludert ikke-sulfaterte GAG-hyaluronsyre).
Siden aldring av huden er karakterisert med en ubalanse av ECM-komponenter (reduserte nivåer av type I og II kollagen, og GAG), poly- og oligosakkaridfraksjoner hentet fra Uloa sp. etter EAE-behandling er av interesse i anti-aldringsstrategier, siden de stimulerer type I og III kollagener, og GAGs syntese.
Imidlertid fremhevet resultatene våre også en økning i MP-1-syntese, aktivitet og genuttrykk i nærvær av poly- og oligosakkarid Uloa EAE-avledede fraksjoner. Økningen i MMP-1 mRNA-nivåer var korrelert med økningen av MMP-1-syntese i nærvær av Ulon-avledede EAE-fraksjoner og signifikant for polysakkaridfraksjoner (UE og DS-UE). Økningen av MMP -1 enzymsyntese er også relatert til en ikke-signifikant økning i MMP-1-aktivitet i nærvær av fraksjonene. Resultatet vårt skiller seg fra tidligere litteratur siden hydrolyserte Uloa pertusa-ekstrakter hemmet uttrykket og sekresjonen av MMP-1 i senescent fibroblaster[38], eller fukoseholdige polysakkarider (kalt fucoidaner) hemmer UVB-indusert MMP-1-ekspresjon i humane hudfibroblaster [50]. Resultatet vårt er imidlertid i samsvar med studien til FRioux et al. (2013), siden rå galaktofukaner (638-1529 kDa) økte den totale katalytiske aktiviteten MMP-er (inkludert MMP-1) til fibroblaster behandlet i 6 dager[47]. Våre data om MMP-nivåøkning er også i samsvar med arbeidet til Andres et al. (2006), siden RROP-er (rhamnoserike oligo- og polysakkaridpreparater fra Klebsiella pneumonia og K. planticola-stammer) oppregulerer MMP-9-ekspresjon, resulterer [45]Enhanced MMP-1-syntese normalt i en reduksjon av ECM komponentmengde som type I kollagen på grunn av MMP-1 nedbrytende aktivitet, men dette ble ikke påpekt i vår studie, siden en økning i typeI kollagen skjedde. Videre hadde Uloa EAE-avledede fraksjoner ingen innvirkning (NS økning eller reduksjon) på mRNA-ekspresjonsnivået og proteinproduksjonen av TIMP-1, en vevshemmer av MP-1 (bortsett fra DEP-HD PP- UE med en betydelig proteinøkning, s<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">
3.2. Rollen til Ulvan-overfloden, sulfatsammensetningen og molekylvekten i ECM-fibroblastmodulering
Det strukturelle trekk ved ulvaner som omfatter dens grad av sulfatering, sulfateringsmønster, monosakkaridsammensetning, glykosidbindinger, grad av forgrening, samt dens molekylvekt er kjent for å påvirke dens biologiske aktivitet [10,1,37,40,44,51 ].
Tidligere studier har vist at molekylvekten til bioaktive forbindelser som polysakkarider eller protein ser ut til å være en nøkkelfaktor for dens effekt på fibroblastproliferasjon og ECM-modulering [37,39,47]. I vår studie økte polysakkaridfraksjoner, UE og DS-UE, med høye molekylvekter (Mw > 670 kDa) fibroblastproliferasjonen. Selv om oligosakkaridfraksjoner (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">
Forfatterne påpekte at den bedre bioaktiviteten på GAG-syntese ble tilskrevet sulfaterte polysakkariders høymolekylære fraksjoner anriket i rå ulvaner. Dette kan være relatert til ulvans egensammensetning i sulfater og dens molekylvekt, siden oligosakkarid Ulva sp. fraksjoner, delvis helt fri for sulfater, har ingen evne til å stimulere GAG-syntese.cistanche penisvekstEn annen studie på Ulku sp. viste betydningen av ulvan-sulfateringsgraden på biologisk aktivitet siden kjemisk sulfatert Alvan-fraksjon, doblet sulfatinnhold fra naturlig polysakkarid, sterkt forbedret antikoagulerende aktivitet [10] Dessuten økte DS-UE mer ECM-modulasjon angående GAG, total og type I og Ⅲ kollagen syntese, sammenlignet med UE. Denne bedre bioaktiviteten kan være knyttet til høyere ulvans-overflod og større sulfatgruppeinnhold i dialysert fraksjon sammenlignet med de andre fraksjonene.
Våre data viste at poly- og oligosakkarid Uloa sp. fraksjoner viste forskjellige metabolske aktiviteter, noe som kan tilskrives forekomsten av ulvan, dens sulfateringsgrad og kjemisk struktur. Dette arbeidet fremhevet også en bedre aktivitet for varebiler med høy molekylvekt som viser sulfatgrupper. Det faktum at polysakkaridfraksjonene som er rike på rå ulvaner (dvs. ikke-depolymeriserte) hadde størst effekt på ECM-fibroblastmetabolismen er ideell for kommende studier og dets fremtidige potensielle anvendelser innen dermo-kosmetisk pleie, da minimal prosessering reduserer produksjonskostnader og tid.
4. Materialer og metoder
4.1.Makroalgmateriale
Grønn tang, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), ble hentet fra tidevannsstranden Landrezac (47 grader 30 grader 17,9" N grader 2 grader 42 grader 37,1" O) i Sarzeau (Bretagne, Frankrike) 28. mai 2018 på ettermiddagen ved lavvann. Materialet ble vasket med vann fra springen, malt til en diameter på 3 mm, frosset ved -25 grader, frysetørket (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Tyskland), og lagret i rommet temperatur i mørket.
4.2.Produksjon og karakterisering av poly- og oligosakkaridfraksjoner
I et tidligere arbeid av Fourniere et al. (2019) ble detaljert produksjon av poly- og oligosakkaridfraksjoner fra Enzyme-Assisted Extraction (EAE) beskrevet (se figur 9 og tabell 3)[36].
For å kort oppsummere ble endoprotease Protamex[(Novozymes, Bagsverd, Danmark) brukt i 6 prosent (w/dw) på tørket Uloa sp. tang. Enzymatisk hydrolyse ble utført i 3 timer ved 50 grader. Deretter ble vandig ekstrakt gjennomgått etanolisk utfelling (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) ved 4 grader i 244 timer for å oppnå fraksjonen rik på rå ulvaner (UE).
Deretter ble fraksjon DS-UE produsert etter dialyse av en fraksjon rik på rå Evans (10 mg/ml) i 7 dager ved 4 grader (cut-off 12-14 kDa, Spectra/Por94 Dialyse Membran, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific ,Illkirch, Frankrike).
To depolymerisasjonsprosedyrer (radikal depolymerisering med H-OZ og ionebytterharpiksdepolymerisering) ble utført på etanolisk bunnfallsløsning fra en fraksjon rik på rå ulvaner (25 mg/ml). For radikal depolymerisering, hydrogenperoksid (8 prosent, v/v) , Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) ble blandet til løsningen i 24 timer ved 50 grader, og produktet gjennomgikk 48 timers dialyse ved 4 grader (avskjæring av 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Frankrike). For sur depolymerisering ble harpiks Amberlite" FPC23H (10mL ekvivalent, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) blandet til løsningen i 24 timer ved 80 grader, og produktet ble nøytralisert med NaOH (0,1 og 1 M) før det gjennomgikk 48 timer dialyse ved 4 grader (cut-off av 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike).cistanche salsa fordelerDisse to prosedyrene førte til oligosakkaridfraksjoner kalt DEP-HD PP-UE og DEP-AD PP-UE for henholdsvis H2OZ og den sure harpiksprosedyren.
Alle fraksjoner ble frysetørket (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Tyskland) og lagret ved 4 grader før analyse. Karakterisering av disse fraksjonene: molekylvektfordeling av polysakkarid ved høytrykksstørrelseseksklusjonskromatografi (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), biokjemisk sammensetning, monosakkaridsammensetning ved høyytelses anionbytterkromatografi med pulserende amperekromatografi deteksjon (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) og matriseassistert laserdesorpsjon ioniseringstid for flymassespektrometri (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , USA) ble også utført i en tidligere studie [36].
4.3.Cellekultur
Humane dermale fibroblastprøver ble levert av "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Frankrike. Humane dermale prøver ble tatt fra hudbiopsier av friske donorer som gjennomgikk abdominoplastikk. Studien ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen, og alle pasienter signerte et avtaleskjema for informert samtykke. Prøvesamlinger fulgt den lokale avtalekomitéen ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) og referert til under DC 2016-2833.
Normale humane dermale fibroblaster (NHDF) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM, Lonza, Basel, Sveits) med 10 prosent (v/v) føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike ), en 1 prosent antibiotikaoppløsning (v/v)(Penicillin, Streptomycin 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike), og 1 prosent soppdrepende (v/v)(Fungizon, amfotericin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike), i en temperaturkontrollert inkubator med 5 prosent CO2 ved 37 grader (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Tyskland). Celler ble sub-dyrket ved trypsinisering (0,05 prosent) og EDTA (etylendiamintetraeddiksyre)-løsning ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) etter å ha nådd konfluens. Alle eksperimenter ble utført mellom 3. og 8. passasje.
Celler ble sådd på 96-brønnmikroplater med en tetthet på 400 celler/brønn for WST-1- og LDH (laktatdehydrogenase)-analyser på 12-brønnplater, med en tetthet på 5{{8 }} celler/brønn for Red Sirius og Blue Alcian-farging og RT-qPCR-analyse, og på 6-brønnplater med en tetthet på 200 000 celler/brønn for ELISA- og Western blot-analyser.
I alle eksperimenter, etter å ha nådd 80 prosent konfluens, ble cellene inkubert i DMEM med 2 prosent FBS i fravær eller nærvær av poly- og oligosakkaridfraksjonene i 48 timer ved 50 og 1000 ug/ml.
4.4.WST-1 celleproliferasjonsanalyse
WST-1, in vitro, analysen er basert på omdannelsen av tetrazoliumsalt WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl){{5 }}(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzendisulfonat) til formazan (oransje fargestoff) av cellulære mitokondrielle dehydrogenaser. Fargeendringen er direkte proporsjonal med levedyktigheten og spredningen av celler i kulturen.
Etter 48 timers inkubering ble mediet fjernet, og 100 uL WST-1-reagens (WST-1-celleproliferasjonssett, Roche Diagnostics, Meylan, Frankrike; fortynning 1:40 i DMEM med 2 prosent FBS) ble tilsatt i hver brønn. Etter 45 min inkubering ved 37 grader med 5 prosent CO2, ble absorbansen målt ved 450 mot 630 nm med en mikroplateleser (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). 4.5.LDH Cytotoksisitetsanalyse
LDH-cytotoksisitetsanalysen er basert på måling av laktatdehydrogenase (LDH), som er et stabilt cytosolisk enzym som frigjøres ved cellelyse. Frigitt LDH i kultursupernatanter måles via omdannelsen av et tetrazoliumsalt (jodonitrotetrazoliumfiolett) til rødt formazanprodukt.cistanche tubulosa dosering redditMengden rød formazan som måles er proporsjonal med antall lyserte celler.
LDH-analyse (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) ble utført i henhold til leverandørens instruksjoner. Positiv kontroll (LDH maksimal frigjøring) ble utført ved å tilsette 10 uL lyseringsløsning 10×(Triton X-100 ved 0,8 prosent) i 45 minutter før reagensen CytoTox969 ble tilsatt. Etter inkubering ble 50 μL cellekultursupernatant overført til en ny 96-brønnmikroplate (ikke-steril). Deretter ble 50 μL reagens CytoTox96 grader tilsatt. Mikroplaten ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 μL "Stoppløsning". LDH-frigjøring ble målt ved absorbanskvantifisering med en mikroplateleser ved 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland).
4.6.Alcian Blue-farging for glykosaminoglykaner kvantifisering
Alcian blue-farging er en fargemetode som gjør det mulig å kvantifisere to typer glykosaminoglykaner (GAG): sulfatert (heparansulfat, keratansulfat, kondroitinsulfat og dermatansulfat) og ikke-sulfatert (hyaluronsyre). Alcianblå løsning ved pH 1 farger sulfaterte GAG-er, mens løsning ved pH 2,5 farger ikke-sulfaterte GAG-er.
Ved slutten av inkubasjonen ble kulturmediet fjernet, og cellene ble skylt to ganger med PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Deretter ble cellene skylt i 5 minutter med 0.1N HCl(pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) eller med 3M eddiksyre (pH2,5, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) for å redusere pH og avsløre henholdsvis sulfaterte og ikke-sulfaterte glykosaminoglykaner. Deretter ble cellene farget med 1 prosent Alcian Blue (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) i HC10.1N løsning (pH1) eller i 3 prosent eddiksyreløsning (pH2.5) i 30 minutter. Cellene ble skylt to ganger med vann fra springen i 5 minutter, tørket under hetten og skylt med destillert vann i 5 minutter. Deretter ble bundet fargestoff solubilisert med Guanidinhydrokloridløsning 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) i 5 minutter under omrøring ved romtemperatur. Den fargede løsningen ble overført til en ny 96-brønnmikroplate, og absorbansavlesning ble utført ved 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland).
4.7.Rød Sirius-farging for total kollagenkvantifisering
Red Sirius-fargingsprosedyren gjør det mulig å kvantifisere totalt kollagen. Picrosirius red, et sterkt lineært anionisk fargestoff som omfatter seks sulfonatgrupper, assosieres langs kationiske kollagenfibre.
Etter inkubering ble kulturmediet fjernet, og cellene ble skylt to ganger med PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike). Deretter ble 1 mL Bouin-løsning Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) tilsatt i hver brønn, og cellene ble farget i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble cellene skylt to ganger med destillert vann og tørket under hetten. Celler ble farget med 1 mL Red Sirius-løsning (Sirius Red 80 i vandig mettet pikrinsyreløsning, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) i 1 time. Etter farging ble løsningen fjernet, og cellene ble skylt suksessivt med destillert vann og HC10.01N for å fjerne ubundet fargestoff. Bundet fargestoff ble solubilisert med NaOH0,1N i 30 minutter. Farget løsning ble overført til en ny 96-brønnmikroplate, og en absorbansavlesning ble utført ved 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). 4.8.Type I kollagen og MMP-1 ELISAer
Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike). Fibroblaster ble lysert i RIPA (radioimmunutfellingsanalyse) buffer (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) supplert med proteasehemmercocktail (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) ved 4 grader i 1 time. Celler ble skrapet, og prøvene ble vortexet i 30 minutter og sentrifugert (12,00xg i 30 minutter ved 4 grader). Supernatanter som inneholdt intracellulære proteiner ble samlet og deretter lagret ved -80 grad inntil analyse for proteinbestemmelse og Western blot-analyse. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som standard.
Cellekultursupernatanten ble samlet og sentrifugert for å fjerne celleavfall (200 x g i 10 minutter ved 4 grader) og lagret ved -80 grad frem til analyse.
Type I kollagen- og MMP-1-målinger ble evaluert i kulturmedier med Abcam-sett (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit og ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner . Absorbansen ble målt ved 450 nm med en mikroplateleser (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). Resultatene ble normalisert med celleproteinkonsentrasjoner bestemt tidligere. 4.9.Western BlotEkstraksjon av proteinprøver ble beskrevet i forrige avsnitt 4.8. Proteinprøver med Laemmli-buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) ble kokt i 5 minutter ved 95 grader og deretter sentrifugert ved 16,000×g i 1 min. Like mengder protein (10 ug) ble lastet inn i brønner på 7,5 prosent eller 4-15 prosent TGX flekkfri gel (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike), sammen med Precision Plus Protein "Unstained Protein standard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) Gelen ble kjørt ved 200 V i 30 min (PowerPac"Basic med Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike). Overføringen av protein fra gel til en mini PVDF (polyvinylidenfluorid) membran (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) ble utført med et Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) ). Membranen ble blokkert med 3 prosent BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) eller 5 prosent fettfri tørrmelk i TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) i 1 time ved romtemperatur og vasket med TBST. Membranen ble undersøkt med type I kollagen (Novotec, Reuver, Nederland), type III kollagen (Novotec, Reuver, Nederland), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, USA), eller TIMP{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) antistoffer; deretter ble den vasket flere ganger med TBST og inkubert i 1 time ved romtemperatur med sekundære peroksidase-konjugerte antistoffer (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). Deretter ble det vestlige ECL-substratet med klarhet (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) påført i 5 minutter til membraner og åpenbaring ble utført ved bruk av ChemiDoc XRS pluss Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike). Proteinnivået ble kvantifisert ved bruk av ImageLab v6.01.1 programvare.
4.10.Zymografi
Zymografi ble utført for å analysere den aktive formen av kollagenase MMP-1 i henhold til Inanc et al. (2017) tilpasset metode [52].
SDS-PAGE geler (10 prosent polyakrylamid, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) ble kopolymerisert med 1 mg/ml av type I kollagen rottehale Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike). Protein prøver (5 ug) ble blandet med ikke-reduserende prøvebuffer (62,5 mM Tris HCl pH 6,8,20 prosent glyserol, 4 prosent SDS, 0,01 prosent bromfenolblått), sentrifugert 1 min ved 4 grader, lastet i brønner av gelen, sammen med Precision Plus Protein" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike), og deretter elektroforert ved 110 V ved 4 grader i 2 timer. Gelen ble vasket to ganger i 2,5 prosent Triton X{{26 }} (v/v) i 15 min hver gang for å fjerne SDS. Deretter ble gelen inkubert i Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) i 48 timer ved 37 grader. Etter inkubering , ble gelen farget i 1 time med 0,5 prosent Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) løsning (w/v) og deretter avfarget i 40 prosent metanol og 10 prosent iseddik løsning (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike). MMP-1-aktivitet ble påvist som et klart bånd mot en Coomassie Blue-farget gelbakgrunn. Kvantifisering ble utført på utført ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) med Image Lab versjon 6.01.1 programvare (Bio-Rad). 4.11.RNA-isolering og sanntids RT-PCR
Etter 48 timers inkubering ble totalt RNA ekstrahert med TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og kloroform (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike), utfelt med isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike), vasket med etanol 75 prosent , tørket under panseret før resuspensjon i DEPC (dietylpyrokarbonat)-behandlet vann (Fisher Scientific, IIlkirch, Frankrike). RNA-mengde og renhetsnivå (mellom 1,8 og 2.0) ble estimert med absorbansmåling på en mikroplateleser (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) ved 260 og 280 nm ved bruk av drop TM Plate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Ett mikrogram totalt RNA ble behandlet med DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) i 5 minutter ved 25 grader for å fjerne DNA-forurensninger. Enzymet ble inaktivert i 5 minutter ved 75 grader.
Revers transkripsjon ble utført på 1 ug total RNA, tidligere behandlet med DNase I, ved bruk av iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike). Trinn fulgt for cDNa-syntese var 5 minutter ved 25 grader ,20 min ved 46 grader og 1 min ved 95 grader.
Kontroller av ikke-mal ble inkludert i PCR-eksperimenter. qPCR ble utført i 96-brønnplater for et totalt volum på 20 μL som inneholdt 1 ul av 1∶15 fortynnede cDNA-prøver fra RT, 1 μL primer (se tabell 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Frankrike）, 10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike) og 8 μL nukleasefritt vann. Amplifikasjonsbetingelsene var 2 minutter ved 95 grader etterfulgt av 40 sykluser på 5s ved 95 grader og 30s ved 60 grader, og avsluttes med 5s ved 95 grader og 5s ved 65 grader før protokoll for smeltekurven: økning på 0,5 grader fra 65 grader til 95 grader. PCR-eksperimenter ble utført på CFX 96-systemet (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Frankrike), og resultatene ble samlet inn fra Bio-Rad CFX Manager-programvaren v3.1 (Marnes-La-Coquette, Frankrike). mRNA-mengdene ble normalisert til RPL13A-mRNA, og analyse av relativ genekspresjon ble beregnet ved å bruke 2-AACt-metoden.
4.12. Statistisk analyse
Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnittet av n eksperiment ± standardfeil (SE).
Statistiske analyser ble utført ved bruk av Addinsoft (2020). Evaluering av normalfordeling av dataene ble vurdert ved bruk av Shapiro-Wilks test. Signifikante forskjeller mellom kontrollprøver og eksperimentelle prøver ble analysert ved Student's-t-test (uavhengig, tosidig), når normalfordeling forekom, og ved Mann-Whitneys test, når normalfordeling ble forkastet. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontroll i henhold til statistisk test er indikert med asterisker(*s<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">
5. Konklusjoner
Dette arbeidet viser at poly- og oligosakkaridfraksjoner, anriket i ulvaner, gjenvunnet etter grønn ny teknologi EAE fra den grønne tangen Uloa sp., påvirker fibroblastproliferasjon, ECM-proteinsyntese, matrisefornyelse og ombygging. Potensiell bruk i kosmetiske antialdringsstrategier kan dukke opp siden aldring av huden er preget av en reduksjon i kollagensyntese. Derfor er hudmatrisefornyelse gunstig i denne sammenhengen. Altså ulvans, fra Ulva sp. fraksjoner oppnådd etter EAE, er biologisk aktive på menneskelig hudfibroblastmetabolisme. Forfatterne foreslår at denne aktiviteten er en funksjon av ulvanoverfloden, sulfatsammensetningen og molekylvekten til fraksjonene. Forfatterne spekulerer i at disse sulfaterte rhamnoserike molekylene tilsvarer signalmolekyler, som gjenkjennes av lektinsteder i membranfibroblastene og deretter stimulerer deres metabolske aktivitet både ved anabole og katabolske synspunkter. Imidlertid er ytterligere undersøkelser nødvendig for å vurdere dyptgående den molekylære mekanismen aktivert av poly- og oligosakkarid Ulou sp. fraksjoner på transkripsjonsfaktornivå, penetrasjonskapasiteten til ulvaner med høy og lav molekylvekt i 3D-hud eller ex vivo hudeksplantasjonsmodeller, og bekrefte disse resultatene av ECM-modulasjon med Uloa EAE-avledede fraksjoner i disse modellene for et antialdringsmål.
Denne artikkelen er hentet fra Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
