Porcint placentaekstrakt øker cellulære NAD-nivåer i humane epidermale keratinocytter

Beste urter for anti-aldring-urte-cistanche

Nikotinamid adenindinukleotid(NAD) er en klassisk kofaktor for mange redoksreaksjoner og finnes i alle levende celler i de oksiderte (NAD pluss ) og reduserte (NADH) former. NAD plus er også kjent som et essensielt co-substrat for NAD pluss-forbrukende enzymer som sirtuin (SIRT) og poly ADP-ribose polymerase (PARP). Fordi disse enzymene spiller en sentral rolle i ulike biologiske prosesser, inkludert DNA-reparasjon, mitokondriell metabolisme og stressresistens, påvirker ubalansert NAD-homeostase deres sentrale prosesser1. NAD-nivåer i vev/organer synker med alderen, noe som resulterer i ubalansert NAD-homeostase2–6. Derfor er det nå enighet om at opprettholdelse av NAD-nivåer fører til forebygging og behandling av aldring og aldersrelaterte sykdommer7. NAD biosyntetiseres via en rekke veier, inkludert de novo biosyntese fra tryptofan, Preiss-Handler-veien fra nikotinsyre og bergingsveien fra nikotinamid (NAM)8. Hos pattedyr er bergingsveien hovedveien for å opprettholde cellulære NAD-nivåer9. I denne veien blir NAM omdannet til nikotinamidmononukleotid (NMN) av NAM-fosforibosyltransferase (NAMPT) og blir deretter omdannet til NAD av NMN-adenylyltransferaser. Nikotinamidribosid (NR) omdannes til NMN av NR-kinaser og integreres deretter i bergingsveien. NAD-mellommetabolitter, som NMN og NR, har vist seg å øke NAD-nivåer i ulike celler og vev og forbedre aldersrelaterte sykdommer10,11.

Placentaekstrakt (PE) har vært mye brukt i tradisjonell medisin for sårheling. PE er en rik kilde til en rekke bioaktive komponenter, inkludert aminosyrer, nukleinsyrer, fettsyrer, mineraler, vitaminer, hormoner, bioaktive peptider, cytokiner og vekstfaktorer. Det er kjent for å ha forskjellige farmakologiske aktiviteter, slik som antiinflammatoriske, antioksidanter, regenerative og immunmodulerende effekter12. Subkutane og intramuskulære injeksjoner av human PE (HPE) har således blitt klinisk brukt for behandling av flere sykdommer, inkludert menopausale symptomer og kronisk leversykdom13. Videre brukes HPE klinisk som et anti-rynkemiddel hovedsakelig i asiatiske land på grunn av dets effekter på cellevekst og kollagensyntese14. Siden bruken av HPE er begrenset til medisinske applikasjoner i noen land som Japan, ble porcin PE (PPE) nylig utviklet som et alternativ til HPE og brukt som en råingrediens i helsekost og kosmetikk. En in vivo-studie med en musekontaktdermatittmodell viste at topisk PPE har antiinflammatoriske og antioksidative effekter på huden15. Kliniske studier har rapportert at aktuell PPE er gunstig for behandling av kroniske ikke-helende sår og for å forhindre rynkedannelse16,17. Videre ble en randomisert, dobbeltblind, placebokontrollert klinisk studie utført med friske voksne kvinner for å validere hudfordelene ved oralt inntak av PPE og viste at hudtilstanden til PPE-inntaksgruppen ble betydelig forbedret18. Disse rapportene støtter konseptet om at PPE-behandling kan lindre eller forhindre aldring av huden.

PE har blitt konvensjonelt brukt som enanti-aldringsmiddel, og en rekke kliniske studier har etablert sinanti-aldringsegenskaper. Mekanismen som ligger til grunn for antialdringseffektene av PE er imidlertid fortsatt uklar. Denne rapporten viste at PPE inneholder flere NAD-forløpere, som NMN og NR, og øker intracellulære NAD-nivåer i normale humane epidermale keratinocytter (NHEK). Våre funn gir ny innsikt i mekanismen som PE utøver sine antialdringseffekter gjennom ved å opprettholde intracellulær NAD-homeostase.

Resultater

PPE øker intracellulære NAD-nivåer. For å undersøke om PPE endrer cellulære NAD-tilstander, dyrket vi NHEK-er i et medium supplert med PPE og kvantifiserte deres intracellulære NAD pluss og NADH-nivåer. Resultatene viste at PPE signifikant økte mengden av både NAD pluss og NADH i NHEKs på en doseavhengig måte (fig. 1A). Det totale NAD-nivået (NAD pluss pluss NADH) til cellene behandlet med 1 mg/ml PPE var omtrent 1,5 ganger høyere enn for ubehandlede celler (fig. 1A). I tillegg, i et tidsforløpseksperiment, ble det observert signifikant økning av NAD pluss, NADH og totale NAD-nivåer etter 4 timers behandling med 1 mg/ml PPE (fig. 1B). Te {{10}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse bekreftet at {{20} },5–2 mg/mL PPE hadde ingen effekt på cellemetabolsk aktivitet, mens 5 mg/mL PPE eller den positive kontrollen (0,2 prosent Triton X-100 [TX-100]) viste signifikant celletoksisitet (Fig. IC). Siden NAD knapt ble oppdaget i selve PPE (data ikke vist), så det ikke ut til at den NAD-produserende effekten av PPE skyldtes tilstrømningen av PPE-avledet NAD til NHEK-er. Dermed antyder disse resultatene at PPE kan øke intracellulære NAD-nivåer. Aktive ingredienser i PPE er små molekyler, ikke proteiner. For å bestemme om PPE øker cellulær NAD-biosyntese via NAMPT-reaksjonen i NAD-bergingsveien, utførte vi en NAD-gjenopprettingsanalyse ved å bruke NAMPT-hemmeren FK866 (fig. 2A). FK866 reduserte de totale NAD-nivåene betraktelig 24 timer etter tilsetning (fig. 2B).

Interessant nok, til tross for fravær av NAMPT-aktivitet i NHEK-er, induserte PPE-undertrykte FK{{0}} uttømming av NAD på en doseavhengig måte (fig. 2B). Mange rapporter har vist at PE inneholder proteiner som cytokiner og vekstfaktorer13,19,20. Derfor antok vi at noen bioaktive proteiner eller svine-NAMPT inneholdt i PPE kan forbedre intracellulær NAD-biosyntese i NHEK-er. For å bekrefte hypotesen vår, separerte vi PPE i høy- og lavmolekylære (HMW, LMW) fraksjoner ved hjelp av en sentrifugalfilterenhet (cutoff: 3 kDa). Siden NAD-gjenopprettingsanalysen ved bruk av FK866 viste effekten av PPE på NAD-biosyntese tydeligere enn i fravær av FK866 (fig. 1A og 2B), fortsatte vi med å identifisere de aktive ingrediensene i PPE ved å bruke denne analysen. Uventet krevde HMW-PPE en høy konsentrasjon på 1 mg/ml for signifikant gjenoppretting av NAD-nivåer, mens LMW-PPE klart forbedret den FK866-induserte NAD-utarmingen selv ved en lav konsentrasjon på 0,25 mg/ml (fig. 2C og D). Dermed antyder disse resultatene at de primære aktive ingrediensene i PPE er små molekyler på mindre enn 3 kDa, snarere enn proteiner som vekstfaktorer og cytokiner.

PPE inneholder NAD-forløpere, som NMN og NR. Vi fraksjonerte videre LMW-PPE i 12 fraksjoner ved hjelp av revers-fase høyytelses væskekromatografi (HPLC) og undersøkte hvilken fraksjon som bidro til gjenoppretting av FK866-indusert NAD-utarming. Et typisk HPLC-kromatogram av LMW-PPE er vist i fig. 3A. NAD-gjenopprettingsanalysen viste at bare fraksjon 3 tydelig økte NAD-nivåer i FK866-behandlede NHEK-er (fig. 3B). NAD-forløpere, som NMN og NR, øker intracellulære NAD-nivåer uten NAMPT-intervensjon i forskjellige cellelinjer inkludert NHEKs10,21. Siden LMW-PPE fortsatt økte NAD-innholdet i NHEK-er, selv når NAMPT ble hemmet av FK866, antok vi at NAD-forløpere inneholdt i PPE forbedrer intracellulær NAD-produksjon. For å teste denne hypotesen analyserte vi fraksjon 3 ved bruk av væskekromatografi – tandem massespektrometri (LC – MS/MS) for å oppdage NAD-forløperne. Resultatene viste at tre ionetopper i samsvar med NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) og NAM (m/z 123→80) ble påvist i fraksjon 3 ( Fig. 3C). Kvantifiseringsanalysene viste at konsentrasjonen av NMN, NR og NAM i hele PPE var henholdsvis 0,22, 17,62 og 0,14 ng/mg (tabell 1). Disse resultatene tyder på at minst tre NAD-forløpere, NMN, NR og NAM, er tilstede i PPE og deltar i intracellulær NAD-forsterkning.

Figur 2. PPE forbedrer uttømmingen av NAD av FK866 i NHEK-er. (A) Redningsveien for NAD-biosyntese. Te NHEK-er ble forhåndsbehandlet med FK866 i 30 minutter og inkubert med hel-PPE (B), HMW-PPE (C) eller LMW-PPE (D) ved de angitte konsentrasjonene i 24 timer. De totale NAD-nivåene ble bestemt ved å bruke NAD plus/NADH-analysesettet. †s<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Topisk administrering av PPE på rekonstruert human epidermis øker NAD-nivåer av vev. De primære aktive ingrediensene i den NAD-forsterkende effekten av PPE er små molekyler, som kan forventes å ha høyere transdermal absorberbarhet enn større proteiner som vekstfaktorer. Derfor ser lokal påføring av PPE på huden ut til å være et egnet alternativ for å øke NAD-nivåer i hudvev. For å undersøke om topisk administrering av PPE påvirker NAD-nivåer i epidermis under stratum corneum, ble den 3-dimensjonale rekonstruerte humane epidermis (RHE) behandlet med PPE på stratum corneum-siden og dyrket i et medium med tilstedeværelse eller fravær av FK866 (fig. 4A). Topisk påføring av PPE økte NAD-nivåene med henholdsvis 9,1 prosent (ikke signifikant) eller 7,3 prosent (signifikant) i fravær eller nærvær av FK866 (fig. 4B). PPE hadde ingen effekt på cellemetabolsk aktivitet når de ble testet opp til 10 mg/ml, mens 1 prosent TX-100 ble markert redusert (fig. 4C). Disse resultatene tyder på at de aktive ingrediensene i PPE kan infiltrere subcorneal huden og øke hudens NAD-nivåer uten å forårsake skadelige effekter.

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: pluss 86 15292862950