Porcint placentaekstrakt øker de cellulære NAD-nivåene i humane epidermale keratinocytter Ⅱ

Diskusjon

Mange studier har vist atnedgang i NADpå grunn av aldring er korrelert medfunksjonell nedgang av vevogutvikling av aldersrelaterte sykdommer og kreft11,22. I epidermis forårsaker UV-bestråling, den viktigste ytre faktoren for aldring av huden, NAD-utarming samtkronologisk aldring23. Siden huden konstant utsettes for UV-bestråling i dagliglivet, synes lokal påføring av NAD-forsterkende midler å være en rimelig tilnærming for å forhindre NAD-reduksjon og beskytte huden mot UV-skader. Forbedring av NAD i huden har faktisk vist seg å forhindre UV-indusert hudkreft og immunsuppresjon hos mus24. Jacobson et al. rapporterte at aktuelle nikotinsyrederivater økte hudens NAD-innhold og forbedret barrierefunksjon25.

Klikk her for å få Cistanche-de beste antialdringsurtene

I tillegg har flere kliniske studier vist at topisk applikasjon av NAD-forløperen NAM reduserertegn på aldring av huden26,27. Disse in vivo og kliniske dataene støtter muligheten for at forhøyede NAD-nivåer forhindrerhudskader og forsinker aldring. Vi har også tidligere rapportert at å opprettholde tilstrekkelige NAD-nivåer er avgjørende for beskyttelse av humane epidermale celler fra UV-stress21. I denne studien demonstrerte vi at PPE øker intracellulære NAD-nivåer i keratinocytter. Vi fant også at dens aktive ingredienser har LMW på mindre enn 3 kDa, noe som er effektivt for både monolags- og 3-dimensjonale epidermis-kulturmodeller. Disse funnene tyder på at de aktive ingrediensene i PPE kan absorberes transdermalt og fremhever derfor dens potensielle anvendelse som et lokalt middel for å øke hudens NAD-nivåer.

Tabell 1. NAD-forløperinnhold i PPE.

I huden senker NAD-mangel funksjonen til de viktigste energimetabolske banene, som glykolyse og oksidativ fosforylering. Glykolyse er uunnværlig for å opprettholde en balanse mellom keratinocyttproliferasjon og differensiering28. UV-eksponering reduserer NAD-nivåer og kan derfor akselerere denne ubalansen. Forholdet mellom differensiering og spredning ble observert å være kraftig økt i soleksponert hud sammenlignet med solbeskyttet hud29. Tan et al. fant at FK866-behandling akselererte differensiering og reduserte metabolsk aktivitet i NHEK-er, og at NAM reverserte disse FK866--induserte hendelsene ved å gjenopprette cellulære NAD-nivåer28.

Figur 4. Topisk PPE viser NAD-gjenopprettingsaktivitet, men påvirker ikke cellemetabolsk aktivitet, i RHE. (A) Skjematisk illustrasjon av RHE-modellen. (B) PPE (2 mg/mL) ble påført på stratum corneum-siden av RHE og inkubert i 48 timer i nærvær eller fravær av FK866 (5 nM). De totale NAD-nivåene av vev ble bestemt ved å bruke et NAD pluss/NADH-analysesett. (C) PPE (0, 1, 2 eller 10 mg/ml) eller 1 prosent TX-100 (som positiv kontroll) ble påført på stratum corneum-siden av RHE og inkubert i 48 timer . Cellemetabolske aktivitet ble bestemt ved MTT-analyse. **s<0.01, the comparison to the control.

I denne studien fant vi at PPE gjenopprettet den FK866-induserte NAD-uttømmingen. Derfor kan det å bestemme om PPE kan opprettholde differensiering og spredning i den NAD-utarmede epidermis gi en bedreforståelse av detanti-aldringsmekanisme.

Nylig har Aioi et al. viste at lokal bruk av PPE i stor grad reduserte ansiktsrynker og forbedret hudens fuktighet17. Vår tidligere kliniske test viste at lokal påføring av PPE-krem resulterte i en betydelig forbedring ianti-hudaldringsparametere, som for eksempelrynker,hudhydrering, hengende, og øyeposer (upubliserte data). Funnene i denne studien kan bidra til forståelsen av den underliggende mekanismen som PPE reduserer rynker og forbedrer hydreringen av huden med. En tidligere rapport viste at intracellulære totale NAD-nivåer er positivt korrelert med uttrykket av ekstracellulære matrikskomponenter, som prokollagen og elastin, i humane hudfbroblaster30. Behandling av fibroblaster med PPE resulterer i økt produksjon av type I kollagen17. Kombinert med disse fakta, kan PPE fremme kollagenproduksjonen ved å øke NAD-innholdet i fibroblaster, noe som kan føre til lindring av hudrynker observert i kliniske studier. Hudhydrering er nært forbundet med barrierefunksjonen til epidermallaget. Flere studier har antydet at NAD er en viktig medfaktor for å opprettholde hudbarrierefunksjonen. Ming et al. viste at den NAD-avhengige deacetylase SIRT1 regulerer uttrykket av filaggrin, som spiller en kritisk rolle som et forløperprotein for naturlige fuktighetsgivende faktorer i hudbarriereintegriteten31. I tillegg viste en klinisk studie at den topiske påføringen av et NAD-forsterkende middel reduserte transepidermalt vanntapet markant, sammen med en økning i stratum corneumtykkelse i fotoskadet hud25. Disse rapportene antyder at PPE kan forbedre hudbarrierefunksjonen ved å øke cellulære NAD-nivåer i epidermis, sannsynligvis føre til forbedret hudhydrering notert i kliniske studier.

De siste årene har NAD-boostere vist seg å være nyttige for å forsterke antioksidant- og antiinflammatoriske effekter. I diabetiske og septiske musemodeller reduserte NR-administrasjonen signifikant høyfett diett-indusert hjernebetennelse og forhindret lipopolysakkarid-indusert endotelial oksidativt stress, henholdsvis 32,33. I likhet med NR, har NMN-tilskudd hos gamle mus vist seg å reversere den pro-inflammatoriske mRNA-ekspresjonsprofilen i den nevrovaskulære enheten og å forbedre kardiovaskulær funksjon ved å redusere oksidativt stress34,35. I tillegg viste en klinisk studie med eldre menn at oral NR reduserte nivåene av sirkulerende inflammatoriske cytokiner36. Til sammen støtter disse in vivo og kliniske studiene ideen om at bruk av NAD-forsterkende midler gir antioksidanter og antiinflammatoriske effekter. Forbedret SIRT-aktivitet har blitt foreslått som en av de plausible mekanismene som disse NAD-boosterne utøver antiinflammatoriske og antioksidanteffekter med. PPE er kjent for å ha antioksidanter og antiinflammatoriske effekter15; Imidlertid har relativt begrenset mekanistisk undersøkelse blitt utført til dags dato. Denne studien gir i det minste en delvis forklaring på effektene av PPE.

PPE er kjent for å inneholde rikelig med cellevekstfremmende proteiner som laminin, cytokiner og vekstfaktorer. Nyere studier, inkludert våre, har implisert cellulære NAD-nivåer å være assosiert med cellevekst i epidermale keratinocytter21,28. Derfor spekulerte vi i at noen av disse proteinene kan bidra til økningen i NAD-innhold. I motsetning til våre forventninger fant vi imidlertid at en del som inneholdt molekyler med lav molekylvekt på mindre enn 3 kDa fremmet NAD-produksjon i keratinocytter. Interessant nok avslørte fraksjonering av PPE-delen ved bruk av HPLC at NAD-produksjon bare ble observert i fraksjon 3. Vi fant også at forløpere for NAD, som NMN, NR og NAM, var tilstede i denne fraksjonen, noe som tyder på at de kunne forklare effekten av PPE på NAD-produksjon, i det minste delvis. Siden hver bestanddel i PPE ble påvist i svært lave konsentrasjoner, synes det imidlertid vanskelig å forklare at disse bestanddelene alene er ansvarlige for PPEs evne til å fremme NAD-innhold i keratinocytter. Nyere rapporter har vist at de reduserte formene av disse NAD-prekursorene, NRH og NMNH, har større evne til å produsere NAD enn NR og NMN37–40. Selv om ytterligere analyser er nødvendig for å bestemme om PPE inneholder NRH og NMNH, kan den NAD-forsterkende evnen til PPE observert i denne studien tilskrives flere NAD-forsterkere, inkludert NMN, NR, NMNH, NRH og andre ukjente NAD-forløpere.

Materialer og metoder

temperatur i en eksikkator ble vekten målt med en presisjonsvekt. Tørrstoffinnholdet i PPE var 10,98 mg/ml.

Cellekulturer.

NHEK-er (nyfødt/hann, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA) ble dyrket i EpiLife™-medium inneholdende 60 μM kalsium supplert med humant keratinocyttveksttilskudd (begge fra Termo Fisher Scientifc) ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 5 prosent CO2 . Mediet ble skiftet annenhver dag inntil kulturen nådde omtrent 50 prosent sammenløp, hvoretter det ble skiftet hver dag. Cellene ble passert når de nådde 80–90 prosent sammenløp. NHEK-er ble ikke brukt utover passasje 5.

NAD kvantifisering og gjenopprettingsanalyse.

Mengden av NAD ble målt ved å bruke NAD plus /NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 1.0× 105 NHEK sådd i 12-brønnplater. Etter 24 timer ble cellene behandlet med PPE ved forskjellige konsentratalternativer (0, 0.25, 0.5 og 1 mg/mL) og dyrket i 1–24 timer i nærvær eller fravær av 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA). Cellene ble lysert med den medfølgende NAD pluss /NADH-ekstraksjonsbufferen og ultrafiltrert ved bruk av en Ultracel-10 K sentrifugalfilterenhet (Merck, Darmstadt, Tyskland). For å beregne NADH-konsentrasjon ble halvparten av filtratene inkubert ved 60 grader i 60 minutter for å dekomponere NAD pluss. Alle filtrater ble utsatt for den enzymatiske reaksjonen ved 37 grader i 1 time. Deretter ble absorbansen til prøvene målt ved 450 nm ved bruk av en Infinite 200 Pro plateleser (Tecan, Männedorf, Sveits). NAD pluss-innholdet ble beregnet ved å trekke NADH-innholdet fra det totale NAD-innholdet. NAD pluss /NADH-nivåer ble normalisert til de respektive proteinkonsentrasjonene bestemt ved bruk av Pierce BCA-proteinanalysen (Thermo Fisher Scientific).

med 300 μL 1 mg/ml MTT (Thermo Fisher Scientific)-løsning ved 37 grader og 5 prosent CO2 i 3 timer. Etter vask tre ganger med PBS, ble formazan infiltrert i NHEK ekstrahert med 200 μL dimetylsulfoksid ved romtemperatur i 2 timer. Optisk absorpsjon ved 560 nm ble bestemt ved å bruke en Infnite 200 Pro plateleser (Tecan).

Ultrafiltrering av PPE. PPE (500 μL) ble påført en Ultracel-3K sentrifugalfilterenhet (Merck Millipore) og sentrifugert ved 16 100×g ved 4 grader i 60 minutter. Filtratene ble brukt som en LMW-fraksjon av PPE. For å gjenvinne restene på filteret ble filteranordningene plassert opp ned i et nytt sentrifugerør og sentrifugert ved 1000×g ved 4 grader i 5 minutter. Restene ble rekonstituert med 500 μL fosfatbufret saltvann (PBS) og brukt som en HMW-fraksjon av PPE.

min: hold på 100 prosent løsemiddel A fra 0 til 10 minutter, deretter en lineær gradient fra 0 prosent B på 10 minutter til 95 prosent B på 30 minutter. Eluentene ble samlet i prøverør hvert 2. minutt og tørket ved bruk av en sentrifugalfordamper CVE-3100 (EYELA, Tokyo, Japan). Restene ble rekonstituert med 100 μL PBS og filtrert gjennom en 0,22 μm membran før bruk av NAD-gjenvinningsanalysen.

Analyser av NAD-forløpere.

NMN, NR og NAM ble påvist og kvantifisert ved isotopfortynning LC–MS/MS. Analyser ble utført ved bruk av et ACQUITY UPLC H-Class-system kombinert med et TQS-mikro trippelt kvadrupol massespektrometer (Waters, Milford, MA, USA) med elektrosprayionisering drevet i positiv ionmodus. En Capcell Pak ADME HR-kolonne (2 μm, 2,1×100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japan) ble brukt for å skille hver prøve. Mobile fase A–B var vann–metanol (inneholdt {{10}},1 prosent maursyre og 10 mM ammoniumformiat). Gradienttilstanden var som følger: 0–0,5 min (99 prosent A), 0,5–3 min (99–60 prosent A), 3–5 min (60–2 prosent A) og 5–7 min. (2 prosent A). Strømningshastigheten var 0,2 ml/min. Kapillærspenningen var 0,75 kV, kildetemperaturen var 150 grader, og desolvasjonstemperaturen var 500 grader. Den koniske gasstrømmen var 50 l/t og desolvasjonsgasstrømmen var 1100 l/t. For å kvantifisere hver NAD-forløper, ble NAM-13C6 lagt til prøvene i en konsentrasjon på 78 nM som en intern standard. Ionene ble overvåket ved bruk av multippel reaksjonsovervåking (MRM) med følgende overganger: m/z 335→123 for NMN, m/z 255→123 for NR, m/z 123→80 for NAM og m/z 129→85 for NAM-13C6. NMN ble kjøpt fra Oriental Yeast (Tokyo, Japan). NR og NAM-13C6 ble hentet fra Merck (Darmstadt, Tyskland). NAM ble kjøpt fra Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).

RHE. In vitro RHE-modellen EpiDerm™ (EPI-200) ble kjøpt fra MatTek (Ashland, MA, USA) og dyrket i EPI-100-ASY-medium (MatTek) ved 37 grader og 5 prosent CO2. Ett hundre mikroliter PPE (1, 2 og 10 mg/ml) eller 1 prosent TX-100 ble påført på stratum corneum-siden av RHE. RHE ble inkubert i 48 timer i et EPI-100-ASY-medium i nærvær eller fravær av FK866 (5 nM). Etter inkubering ble RHE vasket tre ganger med PBS. For NAD-gjenopprettingsanalysen ble de totale NAD-nivåene i RHE kvantifisert ved å bruke NAD plus /NADH Assay Kit-WST. For analysen av cellemetabolsk aktivitet ble RHE overført til en 24-brønnplate og inkubert med 300 μL 1 mg/ml MTT (Thermo Fisher Scientific)-løsning ved 37 grader og 5 prosent CO2 i 3 timer. Etter vask tre ganger med PBS, ble formazan infiltrert i RHE ekstrahert med 2 ml dimetylsulfoksid ved romtemperatur i 2 timer. Optisk absorpsjon ved 560 nm ble bestemt ved å bruke en Infnite 200 Pro plateleser (Tecan). Absorbansen med 1 prosent TX-100-behandlet RHE ble brukt som positiv kontroll for analysen av cellemetabolske aktivitet.

Statistisk analyse. Data presenteres som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet av minst tre uavhengige eksperimenter. Alle statistiske analyser ble utført ved å bruke EZR-programvaren versjon 1.55 (Saitama Medical

Referanser

Appl. 11, 101–109 (2021).

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: pluss 86 15292862950