Forkondisjoneringsaktivert AKT kontrollerer nevronal toleranse for iskemi gjennom MDM2–p53-banenⅠ

Abstrakt

En av de viktigste mekanismene for prekondisjoneringsmediert nevrobeskyttelse er demping av celleapoptose, som induserer hjernetoleranse etter påfølgende skadelig iskemi. I denne sammenhengen spiller den antiapoptotiske PI3K/AKT-signalveien en nøkkelrolle i å regulere celledifferensiering og overlevelse.

Klikk for å cistanche tubulosa pulver fornevrobeskyttelse

Active AKT er kjent for å øke uttrykket av murine double minute-2 (MDM2), en E3-ubiquitin-ligase som destabiliserer p53 for å fremme overlevelsen av kreftceller. I nevroner viste vi nylig at MDM2–p53-interaksjonen potenseres av farmakologisk forkondisjonering, basert på subtoksisk stimulering av NMDA-glutamatreseptoren, som forhindrer iskemi-indusert nevronal apoptose.

Hvorvidt denne mekanismen bidrar til nevronal toleranse under iskemisk prekondisjonering (IPC) er imidlertid ukjent. Her viser vi at IPC induserte PI3K-mediert fosforylering av AKT ved Ser473, som igjen fosforylerte MDM2 ved Ser166. Denne fosforyleringen utløste kjernefysisk stabilisering av MDM2, noe som førte til p53-destabilisering, og forhindret dermed nevronal apoptose ved en iskemisk fornærmelse. Hemming av PI3K/AKT-veien med wortmannin eller ved AKT-demping induserte akkumulering av cytosolisk MDM2, og opphevet IPC-indusert nevrobeskyttelse.

Dermed forbedrer IPC aktiveringen av PI3K/AKT-signalveien og fremmer nevronal toleranse ved å kontrollere MDM2–p53-interaksjonen. Funnene våre gir en ny mekanistisk vei involvert i IPC-indusert nevrobeskyttelse via modulering av AKT-signalering, noe som antyder at AKT er et potensielt terapeutisk mål mot iskemisk skade. Stikkord: AKT; MDM2; p53; PI3K; iskemisk toleranse; forkondisjonering

1. Introduksjon

Hos mennesker har eksistensen av forbigående iskemisk angrep (TIA) blitt avslørt som en endogen forutsatt tilstand med fordelene av funksjonelle utfall hos slagpasienter [1–3]. Endogen nevrobeskyttelse indusert av en kort, subtoksisk iskemisk stimulus, kjent som iskemisk prekondisjonering (IPC), regnes som en strategi i det nye feltet av nevrobeskyttelse mot iskemisk skade [4–6].

Bevis viser at IPC-fremmede nevrobeskyttelse avhenger av transkripsjon, translasjon og post-translasjonelle mekanismer, som endrer funksjonen til nøkkelproteiner etter iskemi [6–11]. Mekanismen involvert i IPC-indusert iskemisk toleranse (IT) har imidlertid ikke blitt fullstendig klarlagt i den menneskelige hjernen [12,13].

Utviklingen av nye eksperimentelle tilnærminger for å forstå IPC-mediert nevrobeskyttelse representerer et kraftig verktøy for å dechiffrere de endogene mekanismene som ligger til grunn for hjernens IT [6], som har potensial til å avsløre nye terapeutiske mål rettet mot å minimere hjerneskade hos slagpasienter. I de siste to tiårene har apoptotisk nevronal celledød posisjonert seg som en essensiell mekanisme involvert i cerebral iskemisk skade [14–16]. I denne forstand har proteinkinase B eller AKT, en serin/treoninkinase som krever at en funksjonell fosfoinositidkinase (PI3K) aktiveres, blitt ansett som et essensielt mål for nevrobeskyttende terapier etter iskemi [17,18].

Nylig demonstrerte vi at hemming av PI3K/AKT-signalveien øker nevronal mottakelighet for eksitotoksisitet [19]. AKT er involvert i et komplekst anti-apoptotisk signalnettverk [20], hvis komponenter kan være tilstede på forskjellige subcellulære steder avhengig av vevstype [21,22]. I hjertet har AKT vært involvert i prekondisjoneringsfremmende kardiobeskyttelse [23].

Bevis viser også at fosforylert AKT fremmer nevronal overlevelse ved begynnelsen av cerebral iskemi [24]. Selv om AKT-aktivering kan bidra til induksjon av IT i hjernen [25], forblir den nøyaktige mekanismen som involverer dens IPC-medierte aktivering unnvikende. I tumorceller fører aktivering av PI3K/AKT-signalveien til MDM2-fosforylering ved Ser166/186, som fremmer den nukleære translokasjonen av MDM2 [26,27] og øker dens ubiquitineringsaktivitet [28].

I kjernen binder MDM2 seg til p53 og fremmer dets ubiquitinering og påfølgende proteasomal nedbrytning, som hemmer p53-funksjonen [29]. Under stressforhold kan p53 også utløse MDM2-overuttrykk, som omvendt undertrykker p53-aktivering i en negativ tilbakemeldingssløyfe [30]. Hemmingen av PI3K forhindrer AKT-aktivering [31] og MDM2-fosforylering i det prekondisjonerte hjertet [32].

I denne sammenheng fant vi tidligere at in vivo hjerneprekondisjonering reduserte infarktvolum etter forbigående midtre cerebral arterieokklusjon (tMCAO) ved å øke MDM2-proteinnivåuttrykk. Følgelig dempet MDM2–p53-komplekset iskemi-indusert aktivering av p53/PUMA/caspase-3-signalveien i primære kortikale nevroner [33].

Her graver vi inn i rollen til PI3K/AKT-signalveien i IPC-mediert nevronal toleranse mot en påfølgende iskemisk skade, så vel som den underliggende mekanismen, og vi fokuserer hovedsakelig på den potensielle koblingen mellom AKT-aktivering og MDM2–p53-komplekset .

2. Resultater

2.1. IPC-Promoted Neuroprotection

Er mediert av fosforylering av AKT ved Ser473, fosforylering av MDM2 ved Ser166 og p53-destabilisering. Vi har tidligere beskrevet virkningen av MDM2-p53-interaksjon på nevronal mottakelighet for iskemi [34] og IT [33]. Her undersøkte vi den potensielle rollen til AKT på IPC-mediert nevrobeskyttelse som en kandidat til å være involvert i MDM2-p53-banen.

Først bekreftet vi at iskemi fremmet AKT-aktivering i nevroner, som vist ved AKT-fosforylering ved Ser473. Som vist i figur 1A, induserte kort (20 min) OGD signifikant p(Ser473)AKT- og MDM2-ekspresjon, mens AKT-proteinnivåene forble uendret (figur S1A). Imidlertid ble AKT-fosforylering ikke observert når nevroner ble utsatt for forlenget OGD (90 min). Dessuten var MDM2-proteinnivåene lavere, noe som er i samsvar med det høyere uttrykket av p53-protein som vist i figur 1A.

Den tidsavhengige oppreguleringen av Mdm2-ekspresjon etter OGD (Figur 1B) bekrefter at subakutt iskemi kan være viktig for å indusere mekanismer som forhindrer p53-stabilisering etter OGD, som tidligere beskrevet [33]. Vi brukte kort OGD (20 min) etterfulgt av 2 timers reoksygenering som en modell av IPC (figur S1B) [33]; dermed analyserte vi nevronale ekstrakter samlet ved 4 timers reoksygenering etter OGD (OGD/R) eller etter OGD innledet av IPC-protokollen (IPC pluss OGD/R). Parallelt ble nevroner inkubert i normoksi (Nx) eller prekondisjonering (IPC) innstillinger (figur S1B).

Som vist i figur 1C og figur S1C, induserte IPC den tidlige aktiveringen av AKT, som avslørt ved fosforylering ved Ser473 [35], etterfulgt av MDM2-proteinstabilisering og fosforylering ved Ser166. IPC forhindret også p53-stabilisering indusert av OGD/R (figur 1C). Interessant nok avslørte immunfluorescensbilder vist i figur 1D at IPC fremmet AKT-fosforylering ved Ser473 i nevroner, som hovedsakelig akkumulerte i kjernen, og reduserte p53-stabilisering etter OGD/R (IPC pluss OGD/R) sammenlignet med ikke-forbehandlede nevroner (OGD). /R).

Følgelig forhindret IPC nevronal apoptose og kaspase-3-aktivering forårsaket av OGD/R, målt ved henholdsvis flowcytometri (Figur S1D) og fluorimetrianalyser (Figur S1E). For å bekrefte rollen til p53 i IPC-mediert nevrobeskyttelse, brukte vi nevroner som uttrykker (villtype; wt) eller ikke (knockout; ko) p53-protein. Resultatene våre viser at nevroner som mangler p53 (figur S1F) var mer motstandsdyktige mot OGD-indusert apoptose enn p53 wt nevroner.

Dessuten var apoptosenivåer i p53KO-neuroner lik de som ble observert i prekondisjonerte (IPC pluss OGD/R) wt-neuroner (figur S1G), og bekrefter dermed nøkkelrollen til p53-destabilisering i IPC-mediert nevrobeskyttelse [33]. Resultatene våre viser at IPC induserte nevrobeskyttelse mot en iskemisk fornærmelse gjennom en mekanisme som involverer fosforylering av AKT ved Ser473, MDM2-stabilisering og fosforylering ved Ser166, og p53-destabilisering.

2.2. IPC utløser MDM2-fosforylering ved Ser166 via PI3K/AKT-banen

PI3K/AKT-signalveien er involvert i neuronal IT både in vitro [36] og in vivo [37]. Rollen til IPC-mediert aktivering av PI3K/AKT-banen i reguleringen av MDM2–p53-komplekset forblir imidlertid uutforsket. For å avklare dette ble nevroner inkubert med den irreversible og spesifikke hemmeren av PI3K/AKT-veien, wortmannin [19].

Som vist i figur 2A, opphevet wortmannin IPC-forbedret (Ser473)AKT-fosforylering og p53-destabilisering, som vist i figur 1D. Disse resultatene antyder en direkte kobling mellom AKT-aktivering og hemming av p53-mediert nevronal apoptose (figur S1D) og caspase-3-aktivering (figur S1E) indusert etter OGD/R. Hovedregulatoren for p53-stabilisering, MDM2, er et mål for AKT [26], som fosforylerer MDM2 ved Ser166 og Ser186 [26]. PI3K-hemming med wortmannin forhindret fosforylering av både (Ser473)AKT og (Ser166)MDM2 indusert av IPC (figur 2B).

Den spesifikke Akt-medierte fosforyleringen av MDM2 ved Ser166 indusert av IPC ble bekreftet ved å bruke et lite interfererende RNA (siRNA) spesifikt designet mot AKT1-protein (siAkt), sterkt uttrykt i kortikale nevroner, og hvis aktivitet er avgjørende for nevronal overlevelse etter iskemi [ 38]. Som vist i figur 3, reduserte siAkt totale AKT- og p(Ser473)AKT-proteinnivåer på dag 3 etter transfeksjon, både i HEK-293T-celler (figur 3A) og i kortikale nevroner (figur 3B).

Dessuten forhindret AKT knockdown (siAkt) (Ser166) MDM2-fosforylering (figur 3B). Disse resultatene viser at den IPC-aktiverte PI3K/AKT-signalveien fremmer MDM2-fosforylering ved Ser166, som kan være ansvarlig for MDM2-stabilisering og påfølgende p53-destabilisering etter iskemisk skade.

2.3. IPC-aktivert AKT utløser nukleær MDM2-proteinstabilisering etter iskemi

Aktiveringen av AKT har vært involvert i nukleær translokasjon av MDM2 i tumorceller [26]. Tatt i betraktning relevansen av nukleær MDM2-stabilisering for nevronal overlevelse etter iskemi [34] og mer spesifikt dens nevrobeskyttende rolle i IPC [33], bestemte vi oss for å undersøke relevansen av PI3K/AKT-signalveien i reguleringen av subcellulær lokalisering av MDM2. protein.

Nevroner eller HEK-293T-celler ble således transfektert med humant MDM2-merket protein (MDM2-GFP). Representative blotter av transfekterte HEK-293T-celler og bilder fra nevroner som ektopisk uttrykker humant MDM2-protein etter fire forskjellige eksperimentelle forhold (Nx, IPC, OGD/R og IPC pluss OGD/R) er vist i figur 4A og figur S1H , henholdsvis.

Ektopisk ekspresjon av MDM2- GFP bekreftet at IPC fremmer MDM2 kjernefysisk akkumulering sammenlignet med ikke-forbehandlede iskemiske (OGD/R) eller normoksiske (Nx) nevroner (Figur 4A, B), som avslørt ved kvantifisering av nukleær/cytosolisk fluorescensforhold (Figur S2B) og kjernefysisk fluorescensintensitet av MDM 2-GFP (Figur S2C).

2.4. IPC fremmer p(Ser473)AKT- og MDM2-interaksjon, som forbedrer MDM2-stabilisering i kjernen og reduserer indusert nevronal apoptose ved iskemi

Etter demonstrasjonen av rollen til IPC-forbedret aktivering av PI3K/AKT-veien i kjernefysisk stabilisering av MDM2, undersøkte vi videre om p(Ser473)AKT og MDM2 interagerte i kjernen (Figur 6A). MDM2-immunutfelling fra nukleære proteinekstrakter, etterfulgt av immunoblotting mot MDM2 og p(Ser473)AKT, avslørte at IPC fremmet interaksjonen mellom p(Ser473)AKT og MDM2, etter OGD/R, og forhindret dermed OGD/R-indusert kjernefysisk p53-stabilisering, som vist i kjerneinngangen (Figur 6A).

Til slutt studerte vi den skadelige effekten av forstyrrelse av PI3K/AKT-veien på nevronal apoptose (figur 6B). AKT-hemming motvirket den beskyttende effekten av IPC før OGD, noe som bekrefter den nevrobeskyttende rollen til AKT – MDM2 i sammenheng med IT. Resultatene våre viser dermed at IPC induserer fosforylering og aktivering av AKT, som fremmer MDM2-fosforylering ved Ser166 og kjernefysisk translokasjon, der den samhandler med p(Ser473)AKT. Denne mekanismen kan bidra til forbedret kjernefysisk stabilisering av MDM2, som spiller en viktig rolle i IPC-indusert iskemisk toleranse.

Hvordan beskytter Cistanche nevroner?

Det er noen bevis som tyder på at Cistanche kan beskytte nevroner ved å redusere apoptose (programmert celledød) og fremme nevronal overlevelse. Apoptose er en naturlig prosess som oppstår i kroppen for å fjerne skadede eller uønskede celler, men det kan være skadelig når det skjer overdrevent eller upassende. Cistanche har vist seg å hemme apoptose i laboratoriestudier, og denne effekten kan bidra til å beskytte nevroner mot skade.

I tillegg inneholder Cistanche en rekke bioaktive forbindelser som har vist seg å ha nevrobeskyttende effekter. For eksempel inneholder den echinacoside, som har vist seg å beskytte nevroner mot oksidativt stress og betennelse. Den inneholder også akteosid, som har blitt funnet å ha antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper.

Fortsettelse følger...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 og Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institute of Functional Biology and Genomics, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spania; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (bobil); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institutt for biomedisinsk forskning i Salamanca, Universitetssykehuset i Salamanca, Universitetet i Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Spania

3 Institutt for biokjemi og molekylærbiologi, Universitetet i Salamanca, 37007 Salamanca, Spania 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spania: * mdesteban@usal.es ; Tlf.: pluss 34-923-29-4908