Fremstilling av et ferulsyre-fosfolipidkompleks for å forbedre løselighet, oppløsning og B16F10 cellulær melanogenese-hemmingsaktivitet

Abstrakt

Bakgrunn

Ferulsyre(FA; 4-hydroksy-3-metoksykanelsyre) finnes i mange matvarer, inkludert hvete, ris, bygg, havre, sitrusfrukter og tomater [1]. FA har vist seg å gi betydelig hudbeskyttelse mot UV-indusert oksidativt stress [2]. Den reverserer kronisk UVB-indusert oksidativ skade i musehudtumorer ved å modulere uttrykket av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS), tumornekrosefaktor (TNF)- og interleukin (IL){{7} } [3]. Den modulerer også uttrykket av mutert p53, Bcl-2 og Bax i UVB-induserte musehudsvulster [4]. Flere studier har fastslått at FA hemmer ekspresjonen av cytotoksiske og betennelsesassosierte enzymer [5] og matrisemetalloproteinaser (MMP), og demper nedbrytningen av kollagenfibre [6].

I følge relevante studier,cistancheer en vanlig urt kjent som "mirakelurten som forlenger livet". Hovedkomponenten ercistanoside, som har ulike effekter som antioksidant, anti-inflammatorisk og immunfunksjon. Mekanismen mellomcistancheogbleking av hudenligger i antioksidanteffekten til cistanche glykosider. Melanin i menneskelig hud produseres ved oksidasjon av tyrosin katalysert av tyrosinase. Oksydasjonsreaksjonen krever deltakelse av oksygen, så de oksygenfrie radikalene i kroppen blir en viktig faktor som påvirker melaninproduksjonen.Cistancheinneholder cistanosid, som er en antioksidant og kan redusere dannelsen av frie radikaler i kroppen, og dermed hemme melaninproduksjonen.

I tillegg har cistanche også funksjonen til å fremme kollagenproduksjonen, noe som kan øke elastisiteten og glansen i huden og bidra til å reparere skadede hudceller. Cistanche Phenylethanol Glycosider har en betydelig nedregulerende effekt på tyrosinaseaktivitet, og effekten på tyrosinase er vist å være konkurransedyktig og reversibel hemming, noe som kan gi et vitenskapelig grunnlag for å utvikle og utnytte blekeingrediensene i Cistanche. Derfor har cistanche en nøkkelrolle i hudbleking. Det kan hemme melaninproduksjonen for å redusere misfarging og matthet; og fremme kollagenproduksjonen for å forbedre hudens elastisitet og glød. På grunn av den utbredte anerkjennelsen av disse effektene av cistanche, har mange hudblekingsprodukter begynt å tilføre urteingredienser som Cistanche for å møte forbrukernes etterspørsel, og dermed øke den kommersielle verdien av Cistanche ihudblekingsprodukter. Oppsummert, rollen til cistanche ibleking av hudener avgjørende. Dens antioksidanteffekt og kollagenproduserende effekt kan redusere misfarging og matthet, forbedre hudens elastisitet og glans, og dermed oppnå en blekende effekt. Den brede anvendelsen av Cistanche i hudblekingsprodukter viser også at dens rolle i kommersiell verdi ikke kan undervurderes.

Klikk på Cistanche For Whitening

Spør om mer:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fosfolipidkomplekser er mye brukt i farmasøytisk industri. De har god permeabilitet og sikkerhet og får økende oppmerksomhet for bruk i kosmetikk. Fordi fosfolipider er biofunksjonelle overflateaktive stoffer med gode solubiliserende egenskaper, kan de brukes som bærersystemer for mindre løselige legemidler [7], noe som forbedrer transdermal permeasjon og den kumulative penetrasjonshastigheten til aktuelle legemidler [8]. Transdermal permeasjon av legemidler innebærer oppløsning, distribusjon og diffusjon inn i huden. Fysiske og kjemiske egenskaper, spesielt olje-vann-fordelingskoeffisienten til stoffet som skal administreres, påvirker denne prosessen [9].

Metoder

Materialer

Cellekultur

Fremstilling av FA–PC ved bruk av løsningsmiddelfordampning

Screening for optimal andel ferulinsyre og fosfolipider

FA og fosfolipider i molforhold på 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 og 1:4 ble tilsatt til 100 ml rundbunnede kolber og oppløst i vannfri etanol (FA, 2,0 mg/ml). Blandingene ble omrørt konstant ved 40 grader i 1 time, og deretter ble den vannfrie etanolen fjernet ved rotasjonsfordampning. De tørkede FA-PC-kompleksene ble plassert i en ekssikkator i 24 timer.

Screening for optimal reaksjonstemperatur for FA–PC-preparering

Screening for optimal reaksjonstid for FA–PC klargjøring

Screening for optimal FA-konsentrasjon

Karakterisering av FA–PC

Differensiell skanningskalorimetri (DSC)

Løselighet og olje-vann fordelingskoeffisient

Løselighet

Løselighetene til pulverisert FA og FA–PC ble bestemt ved å tilsette et overskudd av prøver til 10.0 mL [10] vann eller n-oktanol og deretter riste på en svingseng i 3 timer ved 37 grader. Blandingene ble sentrifugert ved 15,000 rpm i 10 minutter for å fjerne uløselig FA. Deretter ble supernatantene filtrert gjennom 0,45 µm membraner. Etterpå ble filtratene fortynnet ti ganger med metanol, og FA-innholdet ble bestemt ved bruk av et UV-spektrofotometer (UV-3150; Shimadzu; Japan).

Prøver (10 ml) av FA og FA-PC i vannmettet n-oktanol ble fremstilt og ristet. n-oktanol-mettet vann (10 ml) ble tilsatt til hver prøve, og den blandbare væsken ble omrørt i 24 timer. Etterpå fikk prøvene stå for lagdeling. FA-konsentrasjonen i hver fase ble bestemt ved UV-spektrofotometri (UV-3150; Shimadzu; Japan). Analyser ble utført i tre eksemplarer.

In vitro diffusjon

In vitro-diffusjonsstudier ble utført ved bruk av Franz-diffusjonsceller (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Kina). I tillegg brukte vi Strat-M®-membraner, som er syntetiske membraner med diffusjonsegenskaper som korrelerer nærmere menneskehud enn dyrehudmodeller [11]. Membranene ble klemt mellom giver- og mottakerkamrene til de vertikale diffusjonscellene, og mottakerkamrene ble fylt med fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4) for å oppløse FA eller FA-PC og sikre synkeforhold.

Kromatografisk separasjon ble utført ved bruk av et Agilent 1260LC-seriesystem (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) utstyrt med en online vakuumavgasser, kvartær pumpe, autosampler, termostatert kolonnerom og diodearraydeteksjon (DAD) ). Agilent Technologies ChemStation-programvare for væskekromatografi (LC; B.02.01) ble brukt, og HPLC-separasjon ble utført ved bruk av en Eclipse plus-C18-kolonne (4,6 × 250 mm, 5 μm). Deteksjonsbølgelengden var 0,05 prosent eddiksyre (A) og metanol (B) (40:60, v/v). Strømningshastigheten var 1,0 ml/min. Kolonnetemperaturen ble satt til 30 grader. Kumulative korreksjoner ble gjort for å fastslå mengden av FA frigjort ved hvert tidsintervall. Alle målinger ble utført i triplikat, og prosenten av kumulativ FA som trengte gjennom membranen (prosent Q) ble plottet som en funksjon av tid.

Hemming av melanogenese

B16F10 cellelevedyktighetsanalyse

Cellelevedyktighet og celleproliferasjon ble evaluert ved å bruke en {{0}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse [2]. B16F10-celler ble forbehandlet med 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 og 4.0 mg/ml konsentrasjoner av FA og FA–PC. Etter inkubering i 48 timer ble MTT-løsning (endelig konsentrasjon: 5 mg/ml) tilsatt, og cellene ble inkubert i 3 timer ved 37 grader. Til slutt ble absorbansen til hver prøve målt på en mikroplateleser ved 570 nm for å oppnå prosentandelen av levedyktige celler.

Måling av melanininnhold

Melanininnholdet ble målt som beskrevet tidligere [6] med noen modifikasjoner. B16F10 melanomceller ble sådd (2 × 105 celler/brønn i 3 mL medium) i seks-brønns kulturplater og inkubert over natten for å la cellene feste seg. Ved slutten av behandlingen ble cellene vasket med PBS og lysert med 1 M NaOH inneholdende 10 prosent dimetylsulfoksid (DMSO) i 30 minutter ved 80 grader. Absorbansen (optisk tetthet; OD) ble målt ved 475 nm ved bruk av en mikroplateleser. Melanininnholdet ble beregnet ved å bruke følgende formel:

Dataanalyse

Den statistiske signifikansen av forskjellene mellom gjennomsnittsmålingene for hver behandlede gruppe og den for kontrollgruppen ble bestemt ved å bruke Dunnetts t-test. P-verdier<0.05 were considered statistically significant.

Resultater og diskusjon

Optimal klargjøring av FA–PC

Løselighet og olje-vann-fordelingskoeffisient for FA–PC

Tabell 1 viser løseligheten av FA, PM og FA–PC i vann og n-oktanol. FA–PC viste god løselighet i vann og n-oktanol (henholdsvis 1,68 og 7,77 mg/ml), og løseligheten til FA–PC i n-oktanol ble funnet å være betydelig høyere enn for FA (1,34 mg/ml) .

Lipofilisitet måles vanligvis som en fordelingskoeffisient (P) mellom to ikke-blandbare faser. Det er typisk uttrykt som log P. De tilsynelatende fordelingskoeffisientene til FA og FA–PC i n-oktanol/vann-systemet ble bestemt. Resultatene indikerte at log P var høyere for FA–PC (1,21) enn for FA (0.99) målt ved pH 5.0. Den litt økte log P var relatert til den betydelig forbedrede n-oktanol-løseligheten til FA-PC sammenlignet med FA. Den økte løseligheten til FA-PC i n-oktanol kan forklares av de amorfe egenskapene til FA-PC. Siden lipofilisitet og permeabilitet er godt korrelert, tyder disse resultatene på at den transdermale permeabiliteten til FA kan forbedres ved å bruke den som et fosfolipidkompleks.

DSC 

DSC er en pålitelig metode for screening av kompatibilitet mellom legemidler og hjelpestoffer og gir maksimal informasjon om mulige interaksjoner mellom legemidlene og hjelpestoffene [10]. Tilstedeværelsen av interaksjon kan konkluderes fra eliminering av endoterme topper, utseendet av nye topper, endringer i toppform og begynnelse, topptemperatur/smeltepunkt og relativ areal eller entalpi. Figur 1 viser DSC-termogrammene til FA (fig. 1a), PC (fig. 1b), PM (fig. 1c) og FA–PC (fig. 1d). Den termiske kurven for ren FA har en typisk skarp endoterm smelting ved omtrent 172,7 grader, noe som indikerer dens vannfrie og krystallinske tilstand, mens den for fosfolipider viser en mindre endoterm topp ved 231,7–248,6 grader. DSC-kurven for PM, bestående av de overlagrede termiske profilene for FA og fosfolipider, viser ingen signifikantendringer bortsett fra et lite skifte til en høyere temperatur (175,9 grader), noe som indikerer ingen interaksjoner mellom komponentene. FA–PC har en hovedtopp på 158,2 grader , somskiller seg fra FA-toppen, noe som indikerer en interaksjon mellom FA og PC. Våre resultater tyder på at ulike grader av interaksjon og/eller amorfisering i ulikeblandinger eller komplekser kan oppnås avhengig av deres fremstillingsmetode, og dette er assosiert med forskjellene i løselighet.

RETTFERDIG

FTIR-spektroskopi kan bekrefte dannelsen av FA–PC ved å sammenligne FA–PC-spekteret med det for ren FA. Figur 2 viser FTIR-spektrene til FA, PC, PM og FA–PC. FA-spekteret (fig. 2a) viser et karakteristisk hydroksylstrekkbånd ved 3436 cm−1. Det hele blir en bred singlett i spektrene FA–PC, PM og fosfolipid (fig. 2b–d). FA-spekteret (fig. 2a) viser karakteristiske topper ved 1620 cm−1 (C=C-strekking) og 1450 cm−1 (C=C aromatisk ring-strekking). I FA-PC-spekteret (fig. 2b) er disse to toppene ikke synlige, sannsynligvis på grunn av svekkelse eller fjerning, eller skjerming av fosfolipidmolekylet.

FA-spekteret (fig. 2a) viser karakteristiske umettede karboksyltopper ved 1691 cm−1 (C=O-strekking), og 1664 cm−1 (C=C-strekking). I FA–PC-spekteret (fig. 2b) er disse to toppene ikke synlige, sannsynligvis på grunn av tiltrekningskreftene mellom den negative karboksylladningen i FA og den positive nitrogenladningen i fosfolipider. Fosfolipidspekteret (fig. 2d) har nådd en topp på 1733 cm−1 (C=O-strekking), 1238 cm−1 (P=O-strekking), og 1087 cm−1 (P–O) –C-strekk). Detopper ved 1733 og 1087 cm−1 beholdes i PM- og FA–PC-spektrene, noe som indikerer ikke-involvering i dannelsen av komplekset. Fosfolipidtoppen ved 1283 cm−1 er ikke observerbar i FA–PC-spekteret sannsynligvis på grunn av den karakteristiske hydroksylen fra FA som er forbundet med P=O ved 1283 cm−1 gjennom van der Waals-krefter. Resultatene indikerer at FA var innebygd i ringstrukturen sammensatt av den negative fosforoksygenbindingen og positiv nitrogenladning i fosfolipider, som ble det komplekse FA–PC.

SEM

Overflatemorfologiene til FA, PC, PM og FA–PC ble undersøkt ved bruk av SEM (fig. 3). I fig. 3c fremstår FA som krystallinsk, nesten rektangulær, mens FA–PC-partikler (fig. 3a) virker uregelmessig i form med en glatt overflate. FA–PC har en vesentlig forskjellig form og overflatetopografi sammenlignet med FA og PC (fig. 3b). Dette skyldes sannsynligvis den fullstendige blandbarheten til FA i PC. I PM-skanningen (fig. 3d) er både FA og fosfolipider lett å skille.

In vitro diffusjonsstudier

Nylig ble den syntetiske Strat-M®-membranen introdusert som en erstatning for human hud in vitro diffusjonsstudier [11]. Strat-M®-membranen er sammensatt av to lag med polyetersulfon som er motstandsdyktig mot diffusjon. Polyetersulfonlagene ligger på toppen av ett lag med polyolefin, som er mer åpent og diffusivt. Denne syntetiske membranen er preget av lav batch-til-batch-variabilitet, og gir dermed mer konsistente data. Dessuten har det blitt vist at diffusjonsdata for Strat-M®-membraner korrelerer godt med data fra menneskelig hud [11].

For å evaluere påvirkningen av PC på in vitro diffusjonsegenskapene til FA, ble prosent Q av FA og FA – PC plottet mot tid. Resultatene i denne artikkelen viste en trend at fosfolipider betydelig økte FA-permeasjonen inn i Strat-M®-membranen. I tillegg satt FA–PC lenger på Strat-M®-membranen enn FA (fig. 4). Derfor kan inkorporering av fosfolipider i FA øke oppholdstiden i stratum corneum og gjøre den mer egnet for hudgjennomtrengning. Når det gjelder gjennomtrengningstiden, selv om Strat-M®-membran har blitt rapportert å ha en god korrelasjon med menneskehud [11], har den også teksturforskjeller sammenlignet med menneskehud. Påvirkningsfaktorene for permeasjonstidene kan inkluderes løsemiddel, konsentrasjonen av forbindelsene, pH-verdi, et al. Flere eksperimenter bør gjøres i fremtidig analyse.

Hemming av melanogenese

Effekt av FA-PC på melaninsyntese

I følge litteraturen kan FA hemme cellulær tyrosinaseaktivitet og melanogenese i B16F10 melanomceller gjennom nedregulering av celleproteinene c-kit og ERK1/2 [12]. I denne studien reduserte FA–PC melanininnholdet i B16F1{{10}}-celler tydeligere enn FA ved testede konsentrasjoner på 0,25, 0,5 og 1,0 mg/ml (tabell 2). Dermed bestemte vi at FA – PC er mer effektiv enn FA til å hemme melaninsyntese i B16F10-celler.

Konklusjon

Forfatteres bidrag

LL og LY har gitt betydelige bidrag til utforming og design, eller innhenting av data, eller analyse og tolkning av data; XY og WX har vært involvert i å utarbeide manuskriptet eller revidere det kritisk for viktig intellektuelt innhold; og ZJ og DY har gitt endelig godkjenning av versjonen som skal publiseres. Alle forfattere leste og godkjente det endelige manuskriptet.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundations of China (31501402).

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Mottatt: 27. desember 2016 Godtatt: 14. mars 2017

Publisert på nett: 22. mars 2017

Referanser