Preparativ isolering og rensing av fire forbindelser fra Cistanches Deserticola YC Ma ved høyhastighets motstrømskromatografi

1. Introduksjon

Cistanches deserticolaYC Ma, en art avCistanchersom tilhørerOrobanchaceaefamilie, er en velkjent tradisjonell kinesisk medisin for behandling av nyremangel, kvinnelig infertilitet, sykelig leukoré, nevrapraxi og senil forstoppelse [1]. Det er en parasittisk plante som er vidt utbredt i nordvest i Kina. Så langt har flere forbindelser, bl.afenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider og lignaner er blitt isolert fra denne arten [2]. Noen av PhG-ene har blitt rapportert å ha antioksidative, leverbeskyttende og nevrobeskyttende aktiviteter [3–6]. Imidlertid er isolerings- og renseprosedyren for PhG-er vanskelig og tidkrevende. Dessuten bruker de klassiske flerkromatografiske metodene ikke bare en stor mengde organiske løsningsmidler, men gir også en lavere prøvegjenvinning. Høyhastighets motstrømskromatografi (HSCCC), en støttefri væske-væske partisjonskromatografisk teknikk, tilbyr utmerket prøvegjenvinning sammenlignet med noen konvensjonelle metoder og har blitt mye brukt for separasjon og rensing av ulike naturprodukter [7–9] . Selv om flere PhG er blitt renset fraCistancherslekt og andre av HSCCC [10–14], ingen papir har rapportert rensing av akteosid, isoakteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 2'-acetylakteosid i ett bifasisk system.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I denne artikkelen rapporterer vi en enkel metode for separasjon og rensing av fire PhG fra C. deserticola. Til slutt ble 30,9 mg akteosid, 13,0 mg isoakteosid, 12,5 mg syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 7,2 mg 2'-acetylakteosid oppnådd i en ett-trinns separasjon fra 297 mg fraksjon med renheter på henholdsvis 99 %, 95 %, 99 % og 98 %. Strukturene deres ble karakterisert basert på 1H- og 13C-NMR-spektraldata og HR-MS-spektra. Strukturene til de fire doktorgradsstudentene identifisert i denne undersøkelsen er vist i figur 1.

2. Resultater og diskusjon

2.1. HPLC-analyse av råekstraktet

Den anrikede fraksjonen av n-butanolekstrakt fra C. deserticola ble analysert ved HPLC-UV. Kolonnen som ble brukt var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, city, state abbrev, USA), den mobile fasen var metanol-vann (30:70, v/v). Strømningshastigheten var 1 ml/min. Detektorbølgelengden ble satt til 254 nm. HPLC-kromatogrammet er vist i figur 2. Topper 1 til 4 tilsvarer henholdsvis akteosid (1), isoakteosid (2), syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid (3) og 2'-acetylakteosid (4) .

2.2. Valg av tofaset løsemiddelsystem

Vellykket separasjon med HSCCC avhenger i stor grad av valget av et passende tofaset løsningsmiddelsystem, det tofasede løsningsmiddelsystemet ble valgt i henhold til fordelingskoeffisientverdiene (K) for hver målkomponent og et optimalt område for K bør være fra {{ 2}}.5 til 2.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I forsøket er K-verdiene for målkomponenter i flere tofasede løsemiddelsystemer vist i tabell 1 (selv om resultatene var litt høyere for topp 4, viste seg å være akseptable). Blant dem ga etylacetat-n-butanol-etanol-vann (40:6:6:50, v/v/v/v) passende fordelingskoeffisienter for målforbindelsene. Etter hvert ble løsningsmiddelsystemet bestående av etylacetat-n-butanol-etanol-vann (40:6:6:50, v/v/v/v) brukt til å isolere og rense fire forbindelser av C. deserticola, som vist i Figur 3. Som vist i figur 2, avslørte HPLC-analysen av hver HSCCC-fraksjon at fire rene PhG (akteosid, 99 %; isoacteosid, 95 %; syringalid A 3′- -L-rhamnopyranosid 99 % og 2′- acetylakteosid 98%) kunne oppnås fra råfraksjonen.

3. Eksperimentell

3.1. Apparatur HSCCC

utstyret som ble brukt i denne studien var et TBE{{0}}B høyhastighets motstrømskromatografisystem (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Kina) med tre forberedende flerlags spoleseparasjonskolonner koblet i serie (diameter av rør=2,6 mm, totalt volum=300 mL) og en 2{{10}} mL prøveløkke. Omdreiningsradiusen eller avstanden mellom holderaksen og sentrifugens sentralakse (R) var 5 cm, og verdien varierte fra 0,5 ved den interne terminalen til 0,8 ved den eksterne terminalen (= r/R, der r er avstanden fra spolen til holderakselen). Et HX 105 sirkulasjonsredskap med konstant temperatur (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Beijing, Kina) ble brukt til å kontrollere temperaturen i eksperimentet. HSCCC-systemet var utstyrt med en modell TBP-5002 konstantstrømspumpe med middels trykk, en modell TBP-2000 UV-detektor som opererer ved 254 nm, og en modell V4.0 arbeidsstasjon (Jinda Bio-chemistry Instrument Company, Shanghai, Kina).

Høyytelses væskekromatografi-utstyret (HPLC) som ble brukt var et Agilent 1200-system som består av en G1312A binær pumpe, en G1329A autosampler, en G1314A variabel bølgelengdedetektor (VWD), et G1316A termostatert kolonnerom, en G1379 arbeidsstasjon og en G1379 arbeidsstasjon. . En alltech 3300 ELSD ble brukt for påvisning av renhetene. Agilent 6520 Q-TOF og Bruker AVANCE III 500-NMR-spektrometre ble brukt til strukturell identifikasjon av forbindelser. 1H- og 13C-NMR-spektra (ved henholdsvis 500 og 125 MHz) ble målt ved romtemperatur (22 grader /295,1 K).

3.2. Reagenser og materialer

Etylacetat, n-butanol og etanol var analytisk kvalitet og metanol var HPLC-kvalitet. Alle løsningsmidlene ble kjøpt fra Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Kina). Milli-Q vann (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) ble brukt til alle løsninger og fortynninger. Jordstengelen til C. deserticola ble samlet inn fra Indre Mongolia-provinsen, Folkerepublikken Kina, i juni 2009. Planten ble identifisert av Prof. Lijuan Zhang, og en kupongprøve (nr. 20091001) ble deponert i vårt laboratorium.

3.3. Klargjøring av råprøve

Pulveriserte lufttørkede kjøttfulle stilker av C. deserticola (1 kg) ble refluksert to ganger med vandig etanol (8 L, 60 % v/v) i 2 timer hver gang. Ekstraktet ble inndampet under redusert trykk og ved en temperatur på 60 grader inntil total fordampning av etanolen. Resten ble suspendert i vann og ekstrahert suksessivt tre ganger med kloroform, etylacetat og n-butanol, hvilket ga 5,16 g n-butanolekstrakt etter inndamping til tørrhet under redusert trykk. N-butanekstraktet ble deretter separert på en silikagelkolonne (200–300 mesh) ved bruk av progressiv gradienteluering (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) for å gi åtte fraksjoner. Fraksjon 6 (297 mg) ble brukt for ytterligere HSCCC-isolering og separasjon.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TRADISJONELL KINESISK MEDISIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Valg av tofaseløsningsmiddelsystemer

To-fase løsningsmiddelsystemene ble valgt i henhold til fordelingskoeffisienten (K) til målkomponentene i fraksjonen av C. deserticola. K-verdiene ble bestemt ved LC-analyse som følger: En passende mengde råekstraktpulver (fraksjon 6) ble oppløst i den nedre fasen av løsningsmiddelsystemet og analysert ved HPLC. Områdene til toppene ble registrert som A1. Deretter ble likt volum av den øvre fasen tilsatt til løsningen og blandet grundig for å oppnå fordelingslikevekt. Den nedre fasen ble deretter analysert ved HPLC igjen. De sistnevnte toppområdene ble registrert som A2. K-verdiene ble beregnet etter følgende ligning: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Klargjøring av et to-fase-løsningsmiddelsystem og prøveløsning

I denne studien ble det tofasede løsningsmiddelsystemet bestående av etylacetat-n-butanol-etanol-vann (40:6:6:50, v/v/v/v) brukt for HSCCC-separasjon. Hvert løsningsmiddel ble tilsatt til en skilletrakt og ekvilibrert grundig ved romtemperatur. Den øvre fasen og den nedre fasen ble separert og avgasset ved sonikering i 30 minutter kort før bruk. Prøveløsningen ble fremstilt ved å oppløse 297 mg av fraksjon 6 i 15 ml av den nedre fasen av etylacetat-n-butanol-etanol-vann (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. HSCCC-separasjonsprosedyre

HSCCC ble utført som følger. Den flerlags kveilte kolonnen ble først fylt med den øvre organiske stasjonære fasen. Den nedre vandige mobile fasen ble deretter pumpet inn i hodeenden av kolonnen med en strømningshastighet på 1,5 ml/min, og samtidig ble HSCCC-apparatet kjørt med en omdreiningshastighet på 900 rpm. Etter at hydrodynamisk likevekt var etablert, som indikert av en klar mobil fase som eluerte ved haleutløpet (omtrent to timer senere), ble en 15 ml prøveløsning inneholdende 297 mg av råekstraktet (fraksjon 6) injisert gjennom injeksjonsventilen. Avløpet fra kolonnen ble kontinuerlig overvåket under 254 nm. Fire toppfraksjoner ble samlet i henhold til kromatogrammet og deretter inndampet under redusert trykk. Temperaturen på apparatet ble satt til 25 grader.

3.7. HPLC-analyse og identifisering av HSCCC-toppfraksjoner

Toppfraksjonene fra HSCCC ble analysert ved HPLC-ELSD. Kolonnen som ble brukt var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), og den mobile fasen var metanol-vann (30:70, v/v). Strømningshastigheten var 1 ml/min. ELSD ble operert under følgende forhold: Temperatur 45 grader, gass 1,6 l/min. Strukturell identifikasjon av de fire HSCCC-toppfraksjonene ble utført ved HR-ESI-MS, 1H og 13C-NMR-spektroskopi.

3.8. Den strukturelle identifikasjon

Fraksjon I: HR-ESI-MS observert ved m/z 623,2001 (M-H)-, beregnet for C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 av rhamnose), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukose), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} av rhamnose), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89) }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). Sammenlignet med dataene gitt i litteraturen [17], tilsvarte fraksjon I akteosid.

Fraksjon II: HR-ESI-MS observert ved m/z 623,1987 (M-H)-, beregnet for C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 av rhamnose), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukose), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 av rhamnose), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). 1H-NMR og 13C-NMR spektraldata var i samsvar med de for isoacteosid som rapportert i litteraturen [18].

Fraksjon III: HR-ESI-MS observert ved m/z 6{{108}}7,2032 (M−H)−, beregnet for C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 av rhamnose), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukose), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} av rhamnose), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). I følge litteraturen [18] tilsvarte fraksjon III syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid.

Fraksjon IV: HR-ESI-MS observert ved m/z 665,21{{20}} (M−H)−, beregnet for C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 av rhamnose), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukose), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 av rhamnose), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 1H-NMR- og 13C-NMR-spektraldataene var i samsvar med 2'-acetylakteosid [17].

4. Konklusjoner

En HSCCC-metode for preparativ separasjon og rensing av acteosid, isoacteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid og 2'-acetylacteosid fra Cistanches deserticola YC Ma ble etablert. Denne studien indikerer at HSCCC er en veldig kraftig teknikk for preparativ separasjon og rensing av bioaktive komponenter fra plantematerialer. Forbindelsene kan også isoleres i tilstrekkelig stor skala med høy renhet og kan deretter brukes som referansesubstanser for kromatografi eller bioaktivitetsstudier. Metoden er en gjennomførbar, økonomisk og effektiv teknikk for rask preparativ isolering av kompliserte naturprodukter.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%