Tidligere fryktlæring muliggjør rask assimilering av nye fryktminner direkte inn i kortikale nettverk, del 3

Eksperimentelt design

Datareproduserbarhet ble vurdert med forskjellige replikater (S1-tabell). De første CNQX-inaktiveringseksperimentene i Te2 (fig 1A–1C) ble utført i et høyere antall replikater fordi de var de første eksperimentene vi utførte og tjente til å teste hovedhypotesen i studien vår. Dyr ble a priori tildelt forskjellige atferdsgrupper på en vektbalansert måte. Hanndyr fra samme yngel ble tilfeldig tildelt hver forsøksgruppe. Vi tok først opp hovedhypotesen i studien vår, dvs. at den kortikale inaktiveringen kan påvirke konsolideringen av et nytt fryktminne på en annen måte hos eksperimentelt naive rotter og hos dyr som hadde lært en tidligere frykthendelse.

Hanndyr har ekstremt sterke minner fordi de har et sterkere overlevelsesinstinkt og ønske om å reprodusere seg. Dyr som overlever i naturen trenger å huske mye geografisk informasjon, mattyper, rovdyrspor og plasseringen til gruppemedlemmene for å bedre tilpasse seg miljøet og beskytte livet.

For eksempel må hannløver huske statusen til hele territoriet, medlemsforhold og plasseringene til konkurrenter for å beskytte territoriet og deres status. Hannsebraer må huske plasseringen av vannkilder og mat på gressletter for å overleve og reprodusere seg. Et brusselskap kjørte en gang en annonse som viste at en mannlig isbjørn kunne huske en dykker og hans unike duft slik at han kunne identifisere ham neste gang de så ham.

Derfor må hanndyr ha sterke minner når det gjelder å beskytte territoriet deres, gi nok mat og reprodusere avkom. Dette gjør dem også til viktige emner i menneskelig forskning, for eksempel for å utforske sykdommer som hukommelsessvikt og Alzheimers sykdom.

I menneskeverdenen kan vi også hente inspirasjon fra minnet om hanndyr. Kontinuerlig eksponering for nye ting, kontinuerlig læring og tenkning kan forbedre hukommelsen og tilpasningsevnen vår, og forbedre levestandarden og arbeidseffektiviteten. La oss derfor lære av hanndyr, fortsette å samle kunnskap og erfaring, ha sterke overlevelsesinstinkter og reproduktive ønsker, og skape en bedre fremtid. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen vår. Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen betydelig fordi Cistanche deserticola er et tradisjonelt kinesisk medisinsk materiale med mange unike effekter, en av dem er å forbedre hukommelsen. Effekten av kjøttdeig kommer fra de ulike aktive ingrediensene den inneholder, inkludert syre, polysakkarider, flavonoider osv. Disse ingrediensene kan fremme hjernens helse på en rekke måter.

Klikk vet måter å forbedre hjernefunksjonen på

Ved statistiske forskjeller mellom disse gruppene, utførte vi etter hvert ytterligere kontrollgrupper gjennom injeksjon av saltvann. En lignende tilnærming ble brukt på de optogenetiske eksperimentene, der AAV-kontrollgruppen ble utført først etter at statistiske forskjeller mellom naive og tidligere trente rotter ble oppdaget. Disse forsøksplanene tillot oss å unngå unødvendige kontrollgrupper og bruk av unødvendige dyr, et nøkkelspørsmål i den europeiske og italienske lovgivningen om dyreforsøk (3 Rs-prinsippet).

Atferdsprosedyrer

Alle eksperimentene ble utført i løpet av dagens lysfase (kl. 08.00 til 16.00). Dyrene ble transportert enkeltvis fra anlegget til forsøksrommene i forskjellige små gjennomsiktige bøtter avhengig av de eksperimentelle kravene.

Auditiv trening: Første atferdsøkt. Auditiv frykt-betingede dyr (CS1-CS2). I denne gruppen ble rotter forsiktig tatt fra hjemmeburet og båret fra stuen til det lydisolerte rommet. Vel fremme ble dyrene plassert inne i kondisjoneringsapparatet bestående av et rektangulært svart bur (35 × 40 cm) utstyrt med et rist av rustfritt stål (1 cm i diameter, med en avstand på 1,5 cm) koblet til et sjokkleveringsoppsett.

Rotter ble stående uforstyrret i 1 minutt. Etter denne tiden ble 7 betingede stimuli (CSs) bestående av en ren tone på 15 kHz frekvens (15 s varighet hver, 80 dB, 36 s forsøksintervall) administrert. De siste 1 sekundene av hver tone ble paret med en smertefull UL (0,5 mA, 1 s). På slutten av kondisjonsøkten ble rottene brakt tilbake til hjemmeburet.

Dyr med kun sjokk (sjokk-CS2). I denne gruppen ble rotter på samme måte plassert inne i det samme kondisjoneringsapparatet. Umiddelbart etterpå ble hver rotte utsatt for 7-fotstøt (1 s, 0,5 mA) umiddelbart etter hverandre. På slutten av stimuleringen ble dyrene brakt tilbake til hjemmeburet. Tidsvarigheten i kondisjoneringsburet var mindre enn 9 sekunder. Tidligere studier har vist at denne prosedyren gjør det mulig å unngå assosiative prosesser mellom smertefulle stimuli og sensoriske stimuli [29,30].

Lukt frykt-kondisjonerte dyr (odor-CS2). I denne gruppen ble rotter plassert inne i det samme rektangulære sorte buret som ble brukt i de ovennevnte eksperimentelle gruppene og koblet til et sjokkleveringsoppsett. Rotter ble stående uforstyrret i 2 min. Etter denne tiden ble 7 CS bestående av vaniljelukter administrert (10 s varighet hver, 24 s prøveintervall). De siste 1 sekundene av hver lukt ble paret med en smertefull UL (0,5 mA, 1 s). Konditioneringsmodulen ble plassert i nærheten av en ventilasjonskilde for å unngå utholdenhet av de leverte stimuli etter deres forskyvning. Buret ble sikret med et øvre gitter. Lukter ble presentert ved bruk av et strømningsfortynningsolfaktometer. Ren luft (1,5 l/min) ble ledet til en magnetventil, som når den ble betjent, førte luften til en 15 ml flaske inneholdende 10 ml vaniljelukt.

Dyr med kun tone (Tone-CS2). Rotter i denne gruppen ble plassert inne i det samme sorte buret og ble presentert med 15-kHz-tonen (7 stimuli, 15 s varighet, 36 s ITI) levert i fravær av USA.

Forhåndseksponerte dyr (Tone-CS1-CS2). Rotter ble plassert inne i kondisjoneringsburet, og 1 min senere ble de presentert 20 ganger med 15-kHz-tonen alene, og 24 timer senere ble den samme tonen paret med USA som ble CS1.

Hvit støy frykt-kondisjonerte dyr (WN-CS2). I denne gruppen ble rotter plassert inne i det rektangulære sorte buret og latt stå uforstyrret i 1 minutt. Etter denne tiden ble 7 CS-er bestående av en WN (15 s varighet hver, 75 dB, 36 s mellomforsøksintervall) administrert. De siste 1 sekundene av hver tone ble paret med en smertefull UL (0,5 mA, 1 s). På slutten av kondisjonsøkten ble rottene brakt tilbake til hjemmeburet.

Auditiv fryktlæring: Andre atferdstrening. To uker etter prosedyrene beskrevet i avsnittet ovenfor, ble dyrene trent i en annen annen oppgave for kondisjonering av auditiv frykt. Rotter ble satt i en standard skinner-boks, som i vårt tidligere arbeid [10], og ble stående uforstyrret i 2 min. Etter denne tiden ble det levert 7 CS-er bestående av rene toner med 3 kHz frekvens (8 s varighet hver, 80 dB, 22 s mellomprøveintervall). De siste 1 sekundene av hver tone ble paret med en smertefull UL (0,5 mA, 1 s). På slutten av kondisjonsøkten ble rottene brakt tilbake til hjemmeburet.

Frykt hukommelsesbevaring. Oppbevaring av hørselsfryktminne nylig ervervet til CS2 (3 kHz) ble testet 4 dager senere. For optogenetiske eksperimenter ble testen av nyere minne utført med laserlevering 24 timer etter CS2-US-læring i analogi med tidsintervallet vi utførte kortikal inaktivering gjennom administrering av CNQX (dvs. 24 timer etter opplæring). Rotter ble vant til et annet apparat enn det som ble brukt til kondisjonering og plassert i et annet rom for å unngå betinget fryktadferd til kontekstuelle signaler [10,62].

Det nye apparatet besto av et gjennomsiktig plastbur med en svartmalt side innelukket i en lyddempende boks utstyrt med en avtrekksvifte, som eliminerte luktende luft fra kabinettet og ga bakgrunnsstøy på 60 dB. Dyrene fikk utforske buret i 5 minutter om dagen under tilvenningsøkten. På dagen for fryktminne-retensjonstesten, etter 2 minutter med fri utforskning, leverte vi 4 CS2 på 3 kHz (8 s—22 ITI) ikke fulgt av noen US.

Hvis det kreves av den eksperimentelle etterspørselen, ble rotter deretter testet for oppbevaring av fjernfryktminnet, ervervet 2 uker før den andre auditive fryktkonditioneringsforsøket. For dette formålet ble dyrene satt inn i et nytt miljø (et sort-hvitt stripete bur) 7 dager etter retentionstesten for fryktminne til 3-kHz-tonen og deretter presentert med 15-kHz-tonen. Fire toner ble presentert med 36 sekunders mellomrom.

Kontekstuell trening: Første atferdsøkt. Kontekstuell fryktkondisjoneringsgruppe (CtxA-CtxB). I denne gruppen ble rotter forsiktig tatt fra hjemmeburet, plassert i en bøtte og båret fra stuen til det lydisolerte rommet. Vel fremme ble dyrene plassert inne i kondisjoneringsapparatet bestående av det ovennevnte rektangulære sorte buret, utstyrt med gitteret av rustfritt stål koblet til et sjokkleveringsoppsett. Rotter ble stående uforstyrret i 1 minutt. Etter denne tiden ble 5 US (0,5 mA, 1 s) administrert med 51 s tidsintervaller. På slutten av økten ble dyrene brakt tilbake til hjemmeburet.

Bare sjokkgruppe (sjokk-CtxB). Når rotter først ble plassert inne i kondisjoneringsapparatet, fikk de umiddelbart 5-fotstøt (1 s, 0,5 mA) umiddelbart etter hverandre. Tidsvarigheten i kondisjoneringsburet var mindre enn 7 sekunder. Tidligere studier har vist at denne prosedyren gjør det mulig å unngå assosiative prosesser mellom smertefulle stimuli og sensoriske stimuli [29,30].

Bare sjokkgruppe (sjokk-CtxB). Når rotter først ble plassert inne i kondisjoneringsapparatet, fikk de umiddelbart 5-fotstøt (1 s, 0,5 mA) umiddelbart etter hverandre. Tidsvarigheten i kondisjoneringsburet var mindre enn 7 sekunder. Tidligere studier har vist at denne prosedyren gjør det mulig å unngå assosiative prosesser mellom smertefulle stimuli og sensoriske stimuli [29,30].

Ny kontekstuell fryktkondisjonering og nylig oppbevaring av fryktminne. To uker etter prosedyrene beskrevet i avsnittet ovenfor, ble alle gruppene opplært til å assosiere et nytt kontekstuelt miljø (skinnerbox-modulen, plassert i et annet rom) med en smertefull UL (0,5 mA, 1 s) . Hvert dyr ble plassert inne i det nye kammeret og forlatt uforstyrret i 2 minutter. Deretter ble den utsatt for 5 US atskilt med intervaller på 30 s.

Oppbevaringen av kontekstuelt fryktminne ble testet 4 dager etter fryktkondisjoneringsprosedyren ved å sette rotter igjen i Skinner-bokskammeret i 3 minutter. For optogenetiske eksperimenter ble testen av nyere hukommelse utført med laserlevering 24 timer etter CtxB-US-læringen i analogi med tidsintervallet vi utførte kortikal inaktivering gjennom administrering av CNQX (dvs. 24 timer etter trening). Hvis det var påkrevd av den eksperimentelle etterspørselen, ble rotter deretter testet for oppbevaring av fjernfryktminnet ved å sette dyr i konteksten paret til USA 2 uker før den nye assosiasjonen.

Dyr ble båret i 2 forskjellige bøtter til kondisjoneringskamrene i henhold til de forskjellige kontekstuelle prosedyrene.

Frysetiltak. I alle eksperimentelle prosedyrer ble vurderingen av frykthukommelsesbevaring bestemt som en fryserespons [10], analysert som fullstendig fravær av somatisk mobilitet bortsett fra respirasjonsbevegelser. For hvert dyr ble mengden tid (i sekunder) brukt i frysing målt offline av 2 uavhengige observatører som ble blindet for dyregruppene.

Kirurgiske prosedyrer

For å administrere de utvalgte stoffene på målstedene, ble rotter bedøvet med isofluran: Induksjonen ble utført med 4 % [vol/vol] i 2 L/min medisinsk luft og utvidet til en kontinuerlig eksponering ved 2 % [vol/vol]) når rotter ble montert i det stereotaksiske apparatet.

Et snitt i hodeskallen ble laget, og små borehull ble boret for å tillate penetrering av en 28-gauge infusjonsnål. En 10-ul Hamilton-sprøyte montert på en infusjonspumpe ble brukt til å levere stoffer. Etter infusjoner ble nålen stående på plass i ytterligere 3 minutter. Snittet ble deretter lukket med sårklemmer av rustfritt stål, og dyret ble gitt en subkutan injeksjon av det smertestillende/anti-inflammatoriske ketoprofenet (2 mg/kg kroppsvekt), og dyret ble holdt varmt og under observasjon inntil det ble frisk fra anestesi.

Som i tidligere studier [10,32–34], var kanylering av dyr unødvendig, med de aktive forbindelsene direkte administrert stereotaksisk. Denne prosedyren er fordelaktig fordi det kirurgiske traumet som er iboende til den permanente kanyleringsprosedyren unngås, og dermed begrenser traumer til en enkelt nålpenetrasjon [10,32–34]. Faktisk påvirker generell anestesi ikke hukommelseskonsolidering signifikant [10,32–34]. For å sikre at tidspunktet for administrering av forbindelser relatert til læringsforsøket var nøyaktig slik at rotter mottok de utvalgte forbindelsene rundt 1 time og rundt 1 dag etter trening, ble isoflurananestesi indusert 5 minutter før tidspunktet for den planlagte injeksjonen, f.eks. kl. 55. min hos rotter behandlet 60 minutter etter trening og 23 timer og 55 minutter hos dyr injisert 24 timer etter trening. Hver rotte ble kondisjonert og deretter operert separat. Dyr som tilhørte de forskjellige atferdsgruppene ble manipulert på en interleaved måte.

Den selektive hemmeren av AMPA/kainat glutamatreseptorer CNQX ({{0}}Cyano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] ble oppløst i steril saltvannsløsning (NaCl, 0,9%) og justert til pH 7,4 med HCl. Proteinsyntesehemmeren anisomycin (Merck, 125 ug/ul) ble oppløst i ekvimolar HCl, fortynnet med sterilt saltvann og justert til pH 7,4 med NaOH. Sterilt saltvann (0,9 % NaCl) ble brukt som bærerkontroll. Disse stoffene ble injisert bilateralt med en hastighet på 0,1 ul/min og et volum på 0,5 ul per sted ved følgende stereotaksiske koordinater hentet fra Paxinos og Watson atlas [26], med Te2 kortikalt felt referert til Zilles atlas [25]:

Sekundær auditiv cortex (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Anterior cingulate cortex (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Injeksjonsvolumet (0,5 ul per sted) ble valgt basert på tidligere studier der aktive forbindelser ble injisert i Te2 [10,34] og ACC [55,63] i voksne rotter.

For å inaktivere den dorsale hippocampus, ble aktive forbindelser injisert i et volum på 0,6 ul per sted ved følgende stereotaksiske koordinater:

Dorsal Hippocampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

De irreversible lesjonene i den dorsale hippocampus ble indusert ved å administrere NMDA (Tocris, 18 ug/ul, oppløst i steril saltvannsløsning, 0,4 ul per sted) med en hastighet på 0,1 ul/ min på punkter på de nevnte koordinatene. De samme koordinatene ble brukt for saltvannsinjiserte kontroller og sham-opererte dyr.

Røde retrokuler (Lumafluor, 1:2 fortynning i saltvann, 0.6 ul) ble injisert i BLA i henhold til følgende koordinater: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8,3.

På slutten av eksperimentene ble nålesporene i tilfelle av CNQX, anisomycin eller saltvannsinjeksjoner eller utvidelsen av lesjonene i tilfelle NMDA-injeksjoner histologisk verifisert. Rotter ble dypt bedøvet og intrakardialt perfusert med 4 % formaldehyd. Hjernene deres ble seksjonert ved 30 μm på en kryostat. Nissl-fargede seriesnitt ble fremstilt ved bruk av den konvensjonelle prosedyren og snittene ble histologisk verifisert under et mikroskop forstørret med 2,5×.

Optogenetiske eksperimenter

Virusinjeksjon. Det adeno-assosierte viruset AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-kirsebær og kontrollvektoren AAV5:CaMKII-kirsebær ble hentet fra University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, USA). Setningen Viraltiter var 5:8 viraltiter var 5,8 × 10^12 vg/ml for begge virusene. Bruken av CaMKII-promoter muliggjør transgenekspresjon som favoriserer pyramidale nevroner. Virus ble plassert i en −80˚C fryser. Virale infusjoner rettet mot Te2 eller ACC ble utført ved de ovennevnte stereotaksiske koordinatene ved volumer på 0,5 ul for hvert hull. Viruset ble injisert med en hastighet på 0,1 ul/min, og nålen ble stående på plass i ytterligere 5 minutter. Virale injeksjoner ble utført 4 uker før optogenetiske eksperimenter.

Belysning.

De optiske fibrene (Plexon, 200/230 μm kjerne; 10 mm lengde) ble implantert bilateralt i BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm fra bregma). Optogenetisk inhibering av Te2-projeksjoner til BLA eller av ACC-projeksjoner til BLA ble oppnådd ved å bruke PlexBright Optogenetic Stimulation System koblet til en laserdiode (Laserglow Technologies). Gult lys (589 nm) genereres og føres gjennom en optisk fiber. Effekttettheten estimert ved spissen av den optiske fiberen var 10 til 15 mW for belysning av projeksjonssteder. Under oppbevaring av fryktminne ble lysemisjon initiert 4 s før tonestart, vedvarte gjennom hele tonen, og ble stoppet 4 s etter toneoffset. Dyr som tilhører kontekstuelle fryktkondisjoneringsgrupper fikk lys stimulering under hele kontekstutforskningen (3 min). Rotter ble kjent med lappesnoren i 2 dager før minneretensjonsforsøket.

Immunhistokjemi. Etter fullføring av optogenetiske eksperimenter ble rottene dypt bedøvet og perfusert intrakardialt med 4 % PAF for å undersøke diffusjonen av viruset. Hjernene ble dissekert, lagret over natten ved 4˚C, og til slutt overført til 30 % sukrose. Koronale seksjoner (30 μm) ble kuttet på en kryostat og samlet i PBS. Frittflytende seksjoner ble inkubert i en blokkerende løsning i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble de inkubert i primært monoklonalt museantistoff anti mCherry (1:500 fortynning, Abcam) i blokkeringsløsningen over natten ved RT. Deretter ble seksjoner vasket med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med et sekundært fluorescerende AlexaFluor-568 anti-muse-antistoff (1:600, Invitrogen) fortynnet i PBS. Seksjoner ble vasket i PBS, montert med monteringsmedier som inneholdt DAPI (Vector), og dekkglasset.

Hjernen til rotter som gjennomgikk NMDA-injeksjoner ble samlet inn på samme måte. Frittflytende seksjoner, etter flere skyllinger, ble inkubert med primært monoklonalt muse-anti-Neun (1:1,000-fortynning, Merck) antistoff i blokkeringsløsningen over natten ved romtemperatur. Deretter ble seksjoner vasket med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med biotinylert heste-anti-muse-antistoff (1:200 fortynning, vektor). Avidin-biotin-komplekset (ABC-kompleks 1:100, vektor, 2 timer og halvparten av inkubasjonen) ble koblet til diaminobenzidin (0,03 %, Merck) for å farge Neun. Snittene ble deretter skylt i PBS og overført til gelatinbelagte objektglass, dehydrert og dekket med et dekkglass.

Te2-seksjoner av retrokuler-injiserte rotter gjennomgikk inkubasjon med primært polyklonalt kanin-anti-Fos-antistoff (1:2,000, cellesignalering) i blokkeringsløsningen over natten ved RT. Deretter ble skivene vasket med PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med anti-kanin Alexa 488 (1:1,000, Invitrogen, i PBS). Til slutt ble immunmerkede seksjoner vasket i PBS, montert på gelatinbelagte objektglass og dekket med et DAPI-supplert monteringsmedium.

Mikroskopi

mCherry-merking ble undersøkt ved å bruke et Zeiss Airyscan-konfokalmikroskop: To lasere ble brukt (405 og 561 nm), hver tilsvarer toppemisjonsspekteret for DAPI (Nissl-farging for cellekjerner) og Alexa 568 (mCherry ), henholdsvis. For å analysere diffusjonen av viruset på injeksjonsstedene, ble mikrofotografier av Te2 og ACC tatt som mosaikkbilder (hver enkelt ble anskaffet ved å bruke et 10× objektiv). Axon-terminaler inn i BLA ble analysert ved å bruke et 40× objektiv som en z-stabel på 10 seksjoner, plassert 1 μm fra hverandre (159 μm kvadrat; zoomfraksjon, 1,0).

For retroperle-injiserte dyr som gjennomgikk cFos-immunmerking, ble bilder tatt med en 40× forstørrelse (159 μm kvadrat; zoomfraksjon, 1.0) med 3 forskjellige lasere, tilsvarende toppemisjonsspekteret for henholdsvis DAPI (Nissl-farging for cellekjerner), AlexaFluor 488 (cFos) og Texas Red (Retrobeads). Seksjoner på 0,7 μm ble tatt langs en 10- μm z-stabel. Antall kjerner som uttrykker cFos, perler-merket og dobbelt-positive (cFos+ perler merket) ble kvantifisert for hvert dyr i Te2-regionen ved de anteroposteriore koordinatene fra 6,7 ​​til 7,3 mm fra bregma [10]. Data ble deretter gjennomsnittet for å produsere gjennomsnittet for hvert dyr, og resultatene ble statistisk sammenlignet. Bilder av snitt med DAB-farging av Neun ble analysert ved bruk av Neurolucida-programvare koblet til et mikroskop via et farge CCD-kamera [10].

Dataanalyse og eksklusjonskriterier

n for hver gruppe ble etablert a priori i henhold til våre tidligere studier [10,16,17], tidligere publiserte arbeider på feltet (se som referanser for ACC [6,22,55] og Te2 [10,59]), og gjennom G-effekt estimeringer, i henhold til følgende tabell (tabell 1):

For hver analyse estimerte vi et endelig gjennomsnittlig antall på 8 til 10 dyr for hver gruppe. Grupper ble kjørt med interne kontroller i samme eksperimentelle økt (S1-tabell). Gitt variasjonen av kirurgiske og atferdsmessige prosedyrer, inkluderte vi på forhånd et større antall forsøkspersoner (opptil 15 % flere) som i noen tilfeller oppfylte de eksperimentelle kriteriene og ble inkludert, og unngikk dermed en vilkårlig ekskludering. Når det gjelder hippocampale studier, for å vurdere effekten av NMDA- og CNQX-injeksjoner med forskjellige tidsintervaller, balanserte vi det totale antallet kontrolldyr mellom bærer- og sham-opererte rotter blant de forskjellige gruppene.

Atferdsanalyse, histologiske inspeksjoner og celletall ble utført blindt. Dyr med utilstrekkelig lokalisering av nålesporet eller lesjonen i tilfelle av NMDA-irreversible lesjoner ble ekskludert fra dataanalyse (S1-tabell). I farmakologiske studier ekskluderte vi 57 dyr over totalt 465 dyr på grunn av feil nåleplassering (22/255 for Te2, 31/179 for ACC og 4/31 for hippocampus). I sporingsstudier, på 21 dyr, eliminerte vi 3 individer der injeksjonen av retrokuler savnet BLA. I Te2 optogenetiske studier, over totalt 30 dyr, ekskluderte vi 1 rotte fordi plasseringen av de optiske fibrene ikke var over målregionen, 1 rotte. Tross alt var viruset fraværende i Te2 og 2 rotter fordi virusdiffusjonen var henholdsvis mindre enn 4,7 % og 5,3 % av Te2-området på injeksjonsstedene. Hos rotter inkludert i den statistiske analysen var den minimale virusdiffusjonen 39,6 % ved den mer fremre stereotaksiske koordinaten og 50,2 % ved den mer bakre stereotaksiske koordinaten.

Tilsvarende, i ACC-optogenetiske eksperimenter, over totalt 32 dyr, ble 2 rotter eliminert fordi plasseringen av optiske fibre ikke var over målregionen. To rotter ble ekskludert fordi viruset i ACC var fraværende, 1 dyr fordi viruset var i den tilstøtende sekundære motoriske cortex, og 1 rotte fordi virusdiffusjonen var mindre enn 2,3 % av ACC-området på injeksjonsstedene. Hos de resterende rottene var den minimale virusdiffusjonen 33,3 % ved den mer fremre stereotaksiske koordinaten og 42,2 % ved den bakre koordinaten.

I NMDA-lesjonsstudiene var lesjoner stort sett rettet mot CA1-regionen i dorsale hippocampus. Den minimale (røde) og maksimale forlengelsen (rosa) av hippocampus lesjoner over hele området av dorsale hippocampus var henholdsvis 23,2 % og 53,5 % ved den mer fremre stereotaksiske koordinaten og 28,3 % og 62,3 % ved den bakre koordinaten. Over totalt 73 dyr ble 4 rotter eliminert fordi lesjonen var fraværende, mens ytterligere 3 dyr ble kastet fordi forlengelsen av lesjonene var mindre enn 5,0 % (nemlig 4,8 %, 4,3 %, 3,1 %) angående hippocampusområdet ved de 2 koordinatene.

Områdekonturanalyse ble utført gjennom visuell inspeksjon og manuell kvantifisering ved bruk av region-konturverktøyet til ZEN 3.0-programvaren. Arealverdier ble deretter normalisert på det totale arealet av regionen. Stereotaksiske koordinater for Te2, ACC og hippocampus var basert på Paxinos-atlaset [26] og, i tilfelle av Te2, med kortikale felt referert til Zilles-atlas [25].

Statistisk analyse

Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Alle data besto Levenes test for varianslikhet. Parametrisk statistikk ble derfor brukt gjennom alle eksperimentene. Data fra 2 grupper ble sammenlignet ved å bruke 2-halede uparrede Student t-tester. Sammenligninger med flere grupper ble vurdert ved å bruke en 1-måte ANOVA-test med Tukeys post hoc-test. For å adressere forskjellene mellom og innenfor grupper, beregnet vi en 3 × 2 ANOVA-modell med blandet design med en gruppe (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) som mellom- subjektsvariabel og tilstand (før og etter nylig kondisjonering +injeksjon) som innen-fagsvariabelen. Der gruppe × tilstandsinteraksjonen var signifikant, utførte vi en enkel hovedeffektanalyse og vi justerte hver p-verdi med Bonferroni-korreksjonen. For hver blandet ANOVA-modell vurderte vi sfærisitetsantakelsen gjennom Mauchlys test av sfærisitet.

De statistiske parameterne (dvs. den nøyaktige verdien av n for hver gruppe, SEM, den statistiske testen, effektstørrelsen og den nøyaktige p-verdien) er rapportert i legendene. For like prøvestørrelser ble effektstørrelser for uparrede t-tester bestemt ved å beregne Cohen's d eller Glass's d i henhold til likheten til SD-er, mens, for forskjellige prøvestørrelser, Hedges'g. Korrelasjoner mellom celletall og frysing ble beregnet ved å bruke Pearsons koeffisient. For å finne ut om dataene oppfylte forutsetningene for den statistiske tilnærmingen, forkastet vi nullhypotesen på P < 0.05-nivået. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS Statistics 22 (IBM).

Støttende informasjon

S1 Fig. Forstørrelse av nålesporene til Te2 (A) og ACC cortex (B) injisert med CNQX, valgt som eksempler. (C) Når de ble representert med samme kontekst 2 uker etter prosedyren, viste dyr som kun hadde sjokk en lav fryktrespons, noe som viste at prosedyren ikke utløste betinget frysing i konteksten der sjokket ble gitt. (D) Lignende resultater som i Fig. 1 ble oppnådd ved å balansere de 2 tonene som ble brukt som CS-er (CS1, 3 kHz og CS2, 15 kHz) (Student t-test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass's d=4.14). (E) Hos de lukt-CS-kondisjonerte rottene som fryser til lukten, 2 uker etter kondisjonering, var høy selv om de ble testet i et annet miljø angående kondisjoneringskonteksten, og viste dermed at frykt var spesifikt assosiert med denne signalleveringen. Skalastenger, 300 μm. ��P < 0,01. Alle data er gjennomsnitt og SEM. Oppsummeringsdataene for S1 Fig kan finnes i støtteinformasjon i filen som heter S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. CNQX-injeksjon svekket oppbevaringen av nylige auditive fryktminner hos rotter der fryktgeneralisering ble senket med en tone alene før-eksponering eller ved å bruke en hvit støytone som CS1. En 3 × 2 ANOVA med blandet design (hovedeffekt av gruppe: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, hovedeffekt av tilstand: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, gruppe × betingelsesinteraksjon F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) viste at frysing til 3 kHz-tonen før assosiasjonen til USA var lavere hos dyr som mottok 15 kHz-tonepre-eksponeringen før 15 kHz-US-paringen (n=10, p=0.001) eller hos rotter kondisjonert til en hvit støy (n=13 , p=0.008) sammenlignet med CS1-CS2-dyr (n=22) som viste en variabel fryktgeneraliseringsrespons. Etter CS-US-læring og cnqx-injeksjoner i Te2 cortex ble imidlertid nylig frykthukommelse svekket i alle gruppene (p > 0,05). Enkel hovedeffekt innen grupper (før og etter CS-US-læring etterfulgt av cnqx-injeksjon): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, s=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Alle data er gjennomsnitt og SEM. Oppsummeringsdataene for S2 Fig kan finnes i Støtteinformasjon i filen som heter S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Tilfeldig eksempel på retrobeads-injeksjon rettet mot BLA. (B og C) Eksempler på plassering av optiske fibre over BLA til dyr injisert med AAV-vektorer i Te2 (B) og ACC cortex (C). Skalastenger, 500 μm.

Anerkjennelser

Vi takker Dr. E. Manassero for deres kontinuerlige støtte og råd.

Forfatterbidrag

Konseptualisering: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Datakurering: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Formell analyse: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Finansieringsanskaffelse: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Etterforskning: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodikk: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Veiledning: Benedetto Sacchetti.

Validering: Benedetto Sacchetti.

Skriving – originalutkast: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Skriving – anmeldelse og redigering: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referanser
1. Frankland PW, Bontempi B. Organiseringen av nyere og fjerntliggende minner. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Nevrobiologien til konsolideringer, eller hvor stabilt er engrammet? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidering av minne. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Minnekonsolidering og den mediale tinninglappen: en enkel nettverksmodell. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Hvorfor det er komplementære læringssystemer i hippocampus og neocortex: innsikt fra suksessene og fiaskoene til konneksjonistiske modeller for læring og hukommelse. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com