Beskyttende effekter og mekanismer for procyanidiner på Parkinsons sykdom i Vivo og in Vitro del 2
Mar 21, 2022
Ta kontaktoscar.xiao@wecistanche.comhvis du vil ha mer informasjon
2.7.Effekter av PCer på oksidativt stress av sebrafisk Larae behandlet med MPTP
Behandling av sebrafisk larver med PCer redusert MPTP-indusert økt intracellulær ROS-formasjon (Figur 7a,b). Videre viste lipidperoksidasjonsanalyseresultatene at PC-eksponering (16 μg / ml) blokkerte MPTP-induserte MDA-nivåer i sebrafisk larver (figur 7c). I tillegg ble den MPTP-induserte reduksjonen i GSH-Px-aktiviteten reversert av PC(16 μg/ml) behandling (figur 7d) og PCer (4,8 og 16 ug/ml) økte MPTP-induserte reduksjoner i CAT- og SOD-aktivitet (figur 7e,f).
Figur 7. Effekter av PCer på oksidativt stress av sebrafisk larver behandlet med MPTP. (a) ROS-nivåer ble målt ved fluorescerende mikroskopi- og bildeanalyse;(b)ROS-nivåer ble målt via imageJ-programvare;(c) MDA-nivåer;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD-aktivitet. F- og p-verdiene for enveisvariasjonen presenteres over hvert diagram. Resultatene av Tukeys post hoc-test presenteres for utvalgte sammenligninger: ns, p>0,05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">
2.8. Effekter av PCer på Nr2/ARE Patlhroay i MPTP-indusert Sebrafish Laroa
Behandling av sebrafisklarver med PC understreket forutsetningen om at aktivering av Nr2/ARE-veier var involvert i PC-medierte beskyttelsesegenskaper. Uttrykket av Nrf2-, HO-1-, NQO1-, GCLC- og GCLM-markører ble oppregulert ved PC-behandling sammenlignet med MPTP-eksponering alene (figur 8a-e).
Figur 8. Effekter av PCer på Nrf2/ARE-banen i MPTP-induserte sebrafisklarver. (a) Nrf2 nivåer;(b)HO-1 nivåer;(c)NQO1 nivåer;(d) GCLClevels;(e) GCLM nivåer. F- og p-verdiene for enveisvariasjonen presenteres over hvert diagram. Resultatene av Tukeys post hoc-test presenteres for utvalgte sammenligninger: ns,p>0,05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">
3. Diskusjon
PCer viser sterke radikale scavenging evner og antioksidant aktivitet, og oksidativt stress, forårsaket av overdreven generasjon av ROS eller / og svekket antioksidant forsvar system, spiller en kritisk rolle i PD[37-39]. Hvorvidt PCer kan spille en nevrobeskyttende rolle gjennom antioksidanteffekter er imidlertid fortsatt uklart. Denne forskningen hadde som mål å undersøke den molekylære mekanismen til PCer mot MPP +/MPTP-induserte PD-modeller.
Cistanche kan forbedre immuniteten
I denne studien, sammenlignet med den MPP+/MPTP-alene gruppen, økte PCer aktivitetsnivået til antioksidantenzymer (inkludert GSH-Px, CAT og SOD) og reduserte nivåer av ROS og MDA. De nåværende funnene er i samsvar med en tidligere studie som antyder at et lavt PC-tilskudd via kosthold forbedrer aktivitetene til GSH-Px, CAT og SOD i avvennede smågris [40]. En annen studie antyder også at PCer øker CAT- og SOD-aktivitetene betydelig og reduserer MDA-innhold, og dermed forbedrer kvaliteten på geite sperm[41]. Disse funnene tyder på at PCer har en beskyttende effekt på oksidativ skade på nerveceller. I tillegg forbedret PCer celle levedyktighet sammenlignet med MPP + alene-gruppen i MPP + -induserte PC12-celler, betydelig økt total avstand flyttet, og redusert TH + celletetthet i forhold til MPTP-gruppen i MPTP-induserte sebrafisk larver. Disse dataene indikerer at PCer har en beskyttende effekt på nerveceller.
Vi observerte videre at PCer økte kjernefysisk Nrf2-akkumulering betydelig sammenlignet med MPP+ alene i PC12-celler. PCer oppregulerte faktisk uttrykksnivåene til NQO1, HO-1, GCLM og GCLC[42]. Videre ble Nfr2gene-silencing via Nrf2 siRNA brukt til å undersøke rollen som Nrf2/ARE-aktivering i PC-mediert nevrobeskyttelse mot MPP+-indusert oksidativ skade: Nrf2-siRNA-transfekterte celler indikerte en markert reduksjon i Nrf2-uttrykket. Denne nåværende studien fant også at Nrf2 knockout avskaffet både PCer-mediert beskyttelse mot MPP +-behandlede svekkelser i celle levedyktighet og antioksidant effekter av PCer. Disse resultatene er i samsvar med en tidligere studie som antyder at forbedring av aktivering av Nrf2/ARE-banen bidrar til nevrobeskyttelse [43].
Nrf2/ARE-banen er en betydelig antioksidantbane [44-46]. Normalt bor Nrf2 i cytoplasma, hvor det er bundet til det hemmende proteinet Keapl[47,48]. Når celler gjennomgår oksidativt stress, dissosierer Nrf2 fra Keap1, initierer det endogene antioksidantforsvaret, og omfordeler deretter til kjernen [46,49,50]. Deretter samhandler den med ARE for å aktivere en rekke cellebeskyttende og antioksidantgener, inkludert GCLC, GCLM, NQO1 og HO-1 [51-54]. Som svar på oksidativt stress dissosierer Nrf2 fra Keap1 i cytosolen og blir deretter omplassert til kjernen, bindende til ARE-sekvensen for å aktivere transkripsjon av kryobeskyttende gener [53-58]. De nåværende resultatene indikerer at PCer kan aktivere Nrf2/ARE-banen, overføre Nrf2 fra cytoplasma til kjernen, akkumuleres i kjernen, oppgulere uttrykket for GCLC, GCLM, NOO1 og HO-1 og forbedre cellenes evne til å motstå oksidativt stress. Faktisk kan Nrf2/ARE-banen representere et farmakologisk mål for PCer for forebygging av PD.
4. Materialer og metoder
4.1. Kjemiske forbindelser og reagenser
MPP+ og MPTP-agenter ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA), og Cell Counting Kit-8 ble hentet fra Beyotime (Shanghai, Kina). PCene, 2',7/-Dichlorofluorescin diacetate, MDA, GSH-Px, SOD og CAT diagnostiske sett ble alle hentet fra Solarbio (Beijing, Kina). RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT Reagent Kit med gDNA Eraser, og SYBRPremix Ex TaqTMII.I ble kjøpt fra Takara (Shiga, Japan); Nrf2-siRNA, control-siRNA og Lipofectamine 2000 ble hentet fra GenePharma (Shanghai, Kina). Til slutt ble de primære antistoffene, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, Antityrosine Hydroxylase (TH) og tilsvarende sekundære antistoffer hentet fra Proteintech (Wuhan, Kina).
4.2.Cellekultur
PC12-celler ble hentet fra National Collection of Authenticated Cell Cultures. Cellene ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% foster bovint serum og penicillin-streptomycin (100 U / ml; 100 ug / ml) i en fuktet atmosfære inkubator ved 37 °C med 5% CO2 [59].
4.3. Analyse av celle levedyktighet
PC12cells (1×104 celler/brønn) ble inkubert med 1,2or4ug/mLof PCsor deprenvl (30 μM) i 24 timer, og deretter inkubert med 1,5 mM MPP + i 24 timer. Deretter ble 10 μL celletellingssett-8-løsning lagt til hver brønn og inkubert i 1 time. Absorbansen ble målt til 450 nm [60].
4.4. Fiskevedlikehold
Etisk godkjenning for dyrebruk ble gitt av dyrevern- og brukskomiteen til det eksperimentelle dyresenteret, Zhejiang University (ZJU20200125). Voksen sebrafisk (AB-stamme) ble hentet fra laboratoriet dyresenter ved Zhejiang University (Hang Zhou, Kina) og opprettholdt ved 28±1°Cunder 14h lys/10h mørke sykluser. Fisken ble matet Artemia nauplii to ganger daglig [61]. For å produsere embryoer ble voksen sebrafisk plassert i avlstanker over natten med et 1:1 mann: kvinnelig forhold. Gyting ble utløst etter at lysene ble slått på neste morgen og fullført i 2 timer. Embryoer ble hevet i embryovann (13,7 mM NaCl,540 μM KCl,25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHCO3, pH 7,4) ved 28°C【62,63】.
4.5. ROS-måling
For å måle ROS-produksjon ble PC12-celler (2×104 celler/brønn) eksponert for 1,2 eller 4 μg/ml PCer eller avskriving (30 μM) i 24 timer og deretter inkubert med 1,5 mM MPPt i 24 timer 【64】. Cellene ble eksponert for 10 μM 2',7'-Dichlorofluorescin diacetatoppløsning i mørke forhold i 30 min; fargestoffoppløsningen ble deretter fjernet, og cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS)3 ganger. Bildene av cellene ble observert ved hjelp av et Olympus laserskanningskonfokalt mikroskop (Olympus, Tokyo hovedstad, Japan). Fluorescensintensiteten til cellene ble kvantifisert ved hjelp av Image J-programvaren v1.8.0(Olympus, Tokyo capital, Japan). Resultatene uttrykkes som en prosentandel av området for ROS-områdene i kontrollgruppen.
For å måle ROS-produksjonen ble sebrafisk larver på 3 dager etter befruktning (dpf) utsatt for avskriving (40 μM) eller 4,8 eller 16 ug / ml PCer med eller uten 400 μM MPTP i 4 dager. Sebrafisk larver ved 7 dpf ble overført til en 24-brønns plate (10 larver per gruppe), behandlet med 20 μM 2',7'-Dichlorofluorescin diacetate løsning, og inkubert i 60 min i mørket ved 28,5 °C [65]. Larvene ble deretter vasket tre ganger med embryomedium for å fjerne overflødig 2',7'-Dichlorofluorescin diacetate. Bildene av de fargede larver ble observert ved hjelp av en Olympus laser skanning konfekt mikroskop. Fluorescensintensiteten til den enkelte larven ble kvantifisert ved hjelp av Image J-programvare. Resultatene uttrykkes som en prosentandel av området for ROS-områdene i kontrollgruppen. 4.6.Vurdering av MDA, GSH-Px, SOD og CAT
PC12-celler (2×104 celler/brønn) ble eksponert for 1,2 eller 4 ug/ml PCer eller avskriving (30 μM) i 24 timer, og deretter inkubert med 1,5 mM MPP+ i 24 timer. Deretter ble 1 ml ekstrakt lagt til 4× 10 ° celler, og cellene ble ødelagt av ultralyd sentrifugering ved 8000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten ble deretter satt på is for testing, og reagenser ble lagt til for bestemmelse av henholdsvis MDA, GSH-Px, SOD og CAT. Hver indeks ble gjentatt i triplikat.
Sebrafisk larver ved 3dpf ble inkubert med deprenyl (40 μM) eller4,8 eller 16 μg / ml PCer med eller uten 400 μM MPTP i 4 dager. Deretter ble 0,05 g sebrafisk larver vev og 0,5 ml ekstrakt homogenisert i et isbad og deretter sentrifugert ved 4 °C i 10 minutter. Supernatanten ble satt på is for testing. Reagenser ble senere lagt til for fastsettelse av henholdsvis MDA, GSH-Px, SOD og CAT. Hver indeks ble gjentatt i triplikat.
4.7. Fremstilling av helcellet, cytoplasmatisk og kjernefysisk protein
For proteinutvinning i hele celler ble celler samlet inn og inkubert med RIPA lysisbuffer som inneholdt 1% PMSF og 1% proteasehemmercocktail i 30 min på is. Cellelysater ble sentrifugert, og supernatanten ble samlet inn og lagret. For subcellulær fraksjoneringspreparat ble celleprøver behandlet ved hjelp av det kjernefysiske og cytoplasmatiske proteinekstraksjonssettet. Proteininnholdet ble analysert ved hjelp av BCA(Beyotime, Shanghai, Kina) analysen.
4.8. Nrf2 siRNA Transfeksjon
Nrf2-siRNA ble brukt til å slå ned Nrf2. PC12-celler ble transfektert med Nrf2-siRNA (80 nM) eller kontroll-siRNA ved hjelp av Lipofectamine 2000, i henhold til håndboken. 4.9.Vestlig Blotting
Proteinprøver ble løst av SDS-PAGE og overført til polyvinyllid di-fluoride (PVDF) membraner. Blottene ble eksponert for passende primære antistoffer: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH og peroksidasekonjugede sekundære antistoffer. Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av ECL(Beyotime, Shanghai, Kina) pluss vestlige blotting deteksjon reagenser [36,43].
4.10.Locomotor Behaioral Test
Sebrafisk larver på 3dpf ble inkubert med deprenyl (40 μM) eller4,8or16 ug / ml PCer med eller uten 400uM MPTP i 4 dager. De 7 dpf sebrafiskene ble deretter plassert i 24-brønnsplater (1 fisk per brønn og 12 larver per gruppe), og den totale avstanden hver fisk svømte over 10 min ble registrert. Sebrafiskadferd ble overvåket og analysert ved hjelp av et automatisert videosporingssystem (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, USA)[66].
4.11.Total RNA-ekstraksjon, omvendt transkripsjon og kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon
RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNAiso Plus i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble omvendt transkribert ved hjelp av et PrimeScriptTMRT reagenssett med gDNA Eraser, i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ PCR-analyse i sanntid ble utført på et Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PCR-system ved hjelp av SYBRPremix Ex TaqTM II(Takara, Shiga, Japan).β-actin ble brukt som referansegen og relativt genuttrykk ble beregnet ved hjelp av 2-△Ct-metoden. De viktigste sekvensene som benyttes i forskningen er oppført i tabell 1.
4.12. Sebrafisk antityrosinhydroksylase (TH)Helfjellsimmunostaining
Sebrafisk larver ved 1 dpf ble inkubert med avskriving (40 μM) eller 4,8 eller 16 ug / ml PCer med eller uten 400 uM MPTP i 2 dager (10 fisk / gruppepartier). Larver ble festet med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 min. Etter fiksering ble de behandlet for helmontert immunstaining av TH [67]. Ved romtemperatur ble 2% (v / o) lammeserum og 0,1% (m / ø) bovint serumalbumin (BSA) blokkert i fosfatbufret saltvann Tween-20 (PBST) i 1 time. De ble deretter eksponert i blokkeringsbufferen forTyrosinhydroksylase antistoff (1:200 fortynnet, Proteintech) i 2 timer, og skylles deretter 6 ganger med PBST. Det siste helmonterte immunoppnåelsestrinnet ble utført i fargingsbuffer med 488 geit antirabbit (1:500) i 1 time og vasket igjen med PBST. Etter tilstrekkelig fargeutvikling var sebrafisken flatmontert med 3,5%metylcelluloseog avbildet ved hjelp av et Olympus laserskanningskonfektmikroskop.
4.13. Statistisk analyse
Enveisanalyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukeys multisammenligningstest ble brukt til å sammenligne gjennomsnittet for forskjellige grupper. Graphpad Prism v6.01(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) ble brukt til statistisk analyse og plotting av grafene.
5. Konklusjoner
Til slutt indikerer våre funn at PC-er utøver nevrobeskyttende effekter via aktivering av Nrf2/ARE-banen og dens nedstrømsavgiftningogAntioksidant Enzymer. Samlet sett antyder denne innsikten at PCer kan være nyttige for behandling av PD.
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules
