Proteiner ble funnet med en frekvens på minst 2 i hver undersøkt tilstand
Sep 06, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Videre, fra søylediagrammene i figur 5B og 6B, er den særegne proteinfordelingen i henhold til den utskillende cellens hypoksiske prekondisjonering merkbar. I dette tilfellet, for fullstendig informasjon, ble proteiner som ikke overstiger terskelen til DAve og DCI-sett også rapportert. Fosteret har sekretomresultater beriket med 60 kDa varmesjokkproteinet (HSPD1, figur 5B, venstre panel) i sin hypoksiske formulering, mens den perinatale motparten sterkt uttrykte glattmuskelcelle kontraktilt myosin regulatorisk [52]lett polypeptid 9 (MYL9, figur). 5B, høyre panel). En viktig del av forskjellen mellom svangerskapsstadier ser ut til å avhenge mer av hypoksisk prekondisjonering i hAFS. elbiler; f-have-EVs oppnådd fra hypoksisk cellepriming ble funnet beriket med faktorer inkludert Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subunit -5 og -1(LAMA5 og LAMB1), Thrombospondin{{17 }} (THBS1, figur 6B, venstre panel). Hypoksiske p-hAFS-EV-er inneholdt Ferritin Heavy Chain (FTH1), stillasproteiner som Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6(ANXA6), Rab GDP-dissosiasjonshemmer beta (GDI2), sammen med Thy -1 membranglykoprotein (THY1), Neuropilin-1(NRP1) og Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, figur 6B, høyre panel).
Proteiner ble funnet med en frekvens på minst 2 i hver undersøkte tilstand i f-hAFS. EV-er og p-hAFS-EV-er ble ytterligere sammenlignet med Vesciclepedia-databasen [53]. Som forventet er flertallet av de identifiserte proteinene (96 prosent) tidligere beskrevet i elbiler og eksosomer i referansedatabasen (figur S3A).cistanche fordelerI denne forbindelse ble Gene Ontology (GO) anrikningsanalyse utført ved hjelp av FunRich [54]. Overfloden av GO-termer i datasettet ble sammenlignet med deres naturlige mengde i referansedatabasen for å finne statistisk overrepresenterte grupper av proteiner, i henhold til deres involvering i biologiske prosesser, molekylær funksjon og cellulære komponenter (for dette siste aspektet er data ikke vist, men tilgjengelig på forespørsel). Når det gjelder analysen av de molekylære funksjonene assosiert med identifiserte proteiner, indikerte hAFS-CM-fraksjoner berikelse i en strukturell bestanddel av ekstracellulær matrise og cytoskjelett, cytoskjelettproteinbinding og strukturell molekylaktivitet (Figur S2), mens hAFS-EV-er ble beriket med en strukturell bestanddel av cytoskjelett og ribosom, DNA- og RNA-binding og GTPase og chaperon-bindingsfaktorer (figur S3C).
Anrikningsanalyse av biologiske prosesser for både hAFS-CM og have-EVs indikerte at flertallet av proteiner som er modulert i de føtale og perinatale hAFS-sekretomfraksjonene tilhører cellevekst/vedlikehold og proteinmetabolisme (figur 5C og 6C). Innenfor hAFS-EVs la vi merke til at begrepet "ekstracellulære matrix strukturelle bestanddeler" utelukkende var assosiert med hypoksiske f-hAF-EVs; begrepene "kalsiumionebinding" og "strukturell molekylær aktivitet" ble hovedsakelig beriket i hypoksiske f-hAFS- og p-hAFS-prøver (figur S3B).
Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I og en DCI (confidence of differential expression) Større enn eller lik I5I passerte filtrene og ble ansett som differensielt uttrykt; se tabell S3 for den fullstendige listen og detaljerte parametere for de rapporterte proteinene. (C) Biologiske prosesser berikelsesanalyse av proteiner identifisert med en frekvens på minst 2 i f-hAFS-EVs (venstre panel) og p-hAFS-EVs (høyre panel) etter hypoksisk forkondisjonering. Basert på FunRich-verktøyet, vises genontologitermer i søylediagrammer som rapporterer prosentandelen av gener beriket for hver kategori (mørkegule søyler for f-hAFS-EVsnormo, røde søyler for f-hAFS-EVShypo, lysegrønne søyler for p-hAFS -EVsnormo og mørkegrønne søyler for p-hAFS-EVShypo). Bare genontologitermer med Bonferroni korrigert*s<0.05 are="">
Cistanche kan anti-aldring
2.6. Cytokin- og kjemokinprofileringen av føtal vs. perinatal har-CM og har-EV-er avslørt forskjellige distribusjonsmønstre
Vi har tidligere validert den regenerative kapasiteten til f-hAFS-CMhypo på skadde kardiovaskulære celler via parakrine effekter [34,35,49]. Her sammenlignet vi cytokin- og kjemokininnholdet i f-hAFS-CMHypo med den tilsvarende p-hAFS-motparten (figur 7A, figur S4A og tabell S4) og fant noen diskriminerende faktorer.
ANGIOGENIN, Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN), Interleukin 8 (IL-8), og Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) ble funnet utelukkende beriket inf-hAFS-CMNypo og ble ikke funnet. oppdaget i p-hAFS-CMhypo. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP2) og Osteopontin (OPN) ble signifikant økt i f-hAFS-CMhypo over p-hAFS-CMHypo med 3.5-og 3.8- ganger (" s<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">
Mens føtal-versus perinatal have-CM viste differensielt uttrykk i deres cytokin- og kjemokinprofil, var de tilsvarende føtale versus perinatale EV-motstykkene mer homogent fordelt, men med lavere ekspresjonsprofiler (figur 7B, figur S4B og tabell S5). Ikke desto mindre kan noen forskjeller forstås: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), Vekst/differensieringsfaktor 15 (GDF-15) og IL-8 ble bare uttrykt av f-hAFS-EVSHypo, men ved lav nivåer; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND og vitamin D-bindende protein (VDBP) ble bare funnet i p-hAFS-EVShypo, til tross for nok en gang oppdaget i lave mengder. Andre cytokiner som hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, Stromal Derived Factor{ {23}} alfa (SDF-1a), ble funnet i både f-hAFS-EVShypo og p-hAFS-EVSHvpo, med PAI-1 og EMMPRIN som er mer uttrykt (Figur 7B)
BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 og SDF-lo ble utelukkende beriket i alle hypoksiske have-EVs sammenlignet med den tilsvarende hAFS-CM, uavhengig av svangerskapsstadiet. Dessuten, mens EMMPRIN ikke ble påvist i p-hAFS-CMhypo, ble det funnet anriket i den EV-korresponderende fraksjonen; omvendt var OPN mer rikelig i f-have-CMhypo enn i f-have-EVShypo, mens det var sammenlignbart blant de tilsvarende p-hAFS-sekretomfraksjonene. FGF-19,MIF og PTX3 ble på samme måte uttrykt i både føtal- og perinatal has-CM og i de tilsvarende hAFS-EV-ene. PAI-1 var sterkt beriket i hypoksiske sekretomfraksjoner.
Figur 7. Cytokin- og kjemokinprofilering i føtal- og perinatale hAFS-sekretomformuleringer. (A) Ekspresjon av cytokiner og kjemokiner oppdaget i det hypoksiske foster-versus perinatale have-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) rapporteres i pikseltetthet ved vilkårlig enhet [AU]. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ±sem av uavhengige eksperimenter og rapportert i tabell S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Cytokin- og kjemokininnhold påvist i det hypoksiske fosteret- versus perinatale hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) og uttrykt ved pikseltetthet i vilkårlige enheter [AU].cistanche kolesterolVerdier er uttrykt som gjennomsnitt±sem av n=3 uavhengige eksperimenter og rapportert i tabell S5. CST3: Cystatin C;EMMPRIN:Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer;FCFF-19: Fibroblast Growth Factor-19;IGFBP2:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 2;IL-8:Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF:Macrophage Migration Inhibitory Factor; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Plasminogen Activator Inhibitor-1; BDNF: hjerneavledet nevrotrofisk faktor; DPPIV: Dipeptidyl Peptidase IV; GDF-15:Growth Differentiation Factor-15;IGFBP3:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Stromal Derived Factor-1 alfa; VDBP: Vitamin D-bindende protein.
2.7. Føtale- og perinatale elbiler er beriket med RNA-informasjon i lasten deres
Siden små ikke-kodende RNA-er har blitt ansett som masterregulatorer for EV-parakrin påvirkning på målceller [4,55], fokuserte vi hovedsakelig på RNA-sekvenseringsanalyse på mikroRNA (miRNA)-innhold i f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs. Liten RNA-profilering viste anrikning av miRNA i både føtal- og perinatale hAFS-EV-er (rundt 35-36 prosent) sammenlignet med den totale lille RNA-mengden (Figur 8A). MiRNA-komponenten var faktisk blant de to mest representerte RNA-artene i begge EV-formuleringene, sammen med rRNA(***p) p < 0.0001).="" følgende="" mirna-er="" var="" de="" mest="" berikede="" i="" ev-prøvene="" som="" ble="" analysert:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,la-7a-5p,la-7b-5p,la-7f{="" {27}}p,la-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" og="" mir-221-3s.="" merk="" at="" føtal-="" og="" perinatale="" har-ev-er="" delte="" flertallet="" av="" slike="" mirna-er="" (nemlig="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" la-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" og="" mir-221-3p,="" figur7b).="" de="" 15="" mest="" anrikede="" mirna-artene="" dekket="" mer="" enn="" 60="" prosent="" av="" det="" totale="" mirna-innholdet="" i="" hver="" prøve.="" på="" den="" annen="" side="" ble="" det="" funnet="" rundt="" 100="" mirna="" i="" de="" resterende="" 30="" prosent="" av="" det="" vesikulære="" mirna-innholdet="" (figur="">
For ytterligere å karakterisere miRNA-innholdet i hAFS-EV-er, undersøkte vi om hAFS-svangerskapsstadiet eller prekondisjonering av hypoksiske celler in vitro kunne påvirke anrikningen av spesifikke miRNA-er. Den sterkeste moduleringen ble funnet mellom svangerskapsstadier, der nesten alle modulerte miRNA-er ble beriket i f-hAFS-EVs over den perinatale motparten (figur 9A og tabell 1). Hypoksisk prekondisjonering hadde en mildere effekt på miRNA-last, mens i denne sammenligningen var modulering i begge retninger, med noe miRNA anriket i hypoksiske og andre i normoksiske kontrollforhold (Figur 9A).
Som en komplementær analyse fokuserte vi på identifisering av undersøkte miRNA-er med den laveste variasjonen på tvers av de forskjellige giverne og kulturprekondisjonering, for EV-er avledet fra begge undersøkte svangerskapsstadier. miRNA som følge av denne analysen spenner fra høye til lave ekspresjonsnivåer (figur 9B). Innenfor den mest stabile miRNA-kjernen av hAFS-EVs-last ble noe delt miRNA mellom f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs identifisert (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p på høyt nivå; miR-221-3p,miR-221-5p og miR-22-3p på dempet nivå, tabell 2).
Figur 9. Analyse av differensiell anrikning av miRNA i føtal- og perinatale hAFS-EVs. (A) Vulkanplott for differensiell berikelse av hAFS-EV miRNA-last i henhold til svangerskapsstadiet (venstre panel) og in vitro hypoksisk prekondisjonering av utskillende celler (høyre panel). For miRNA-detaljer, se Tabell 1. (B) Spredningsplott av korrelasjonen mellom variabilitet (X-aksen) og berikelsesnivået (Y-aksen) av stabile miRNA-er innenfor fosterets hAFS-EV-er (venstre panel) og perinatale hAFS-EV-er (høyre panel) i henhold til høye (gule prikker), svak (grønne prikker) og lav (mørk lilla prikker) berikelse. For miRNA-detaljer, se tabell 2. RPM: avlesninger per million.
3. Diskusjon
Rester av kasserte prøver av humant fostervann har blitt identifisert som en verdifull kilde til stromaceller med lovende potensiale innen regenerativ medisin og vevsteknikk. Etiske bekymringer knyttet til deres isolasjon er minimale, siden de kan hentes fra enten gjenværende prøver av rutinemessig fostervannsprøver ved fostervannsundersøkelse, i løpet av svangerskapets andre trimester (fetal hAFS), eller fra fostervann som kastes som klinisk avfall i planlagt keisersnitt i III trimester. prosedyrer (perinatal hAFS). De siste årene har hAFS blitt foreslått som potensielle terapeutiske midler for reparasjon og regenerering av menneskelig vev gitt oppmuntrende bevis fra eksperimentelle sykdomsmodeller. Interessant nok har de også blitt foreslått for in utero terapi av føtal-neonatale nevrologiske sykdommer; faktisk, prekliniske studier antydet at hAFS administrert prenatalt via intra-amniotisk levering sikret ryggmargen under svangerskapet via parakrin aktivitet i en rottemodell av myelomeningocele [56-58], og reduserte skaden av eksponert tarm i eksperimentell gastroschisis hos gnagere [59 ]. Fra et translasjonsperspektiv kan in utero-transplantasjon av hAFS erstattes av administrering av det mest passende preparatet av deres sekretom (hAFS-CM eller hAFS-EVs).cistanche deserticola bivirkningerDenne strategien vil tillate rask og rettidig intervensjon under svangerskapet ved å overvinne begrensninger ved kanonisk celleterapi (dvs. tidkrevende in vitro celleekspansjon) samtidig som det tilbys hyllevare og klar til bruk farmasøytiske formuleringer.
Den nylige utviklingen av mindre invasive prenatale diagnostiske teknikker kan resultere i en reduksjon i fostervannsprøver i nær fremtid, og dermed foreslår perinatal hAFS som det mer tilgjengelige alternativet. Ikke desto mindre, siden fosterets hAFS er mer utviklingsmessig umodne, kan de ha et mer effektivt parakrint potensial. Innenfor dette scenariet sammenlignet vi her føtal- og perinatal c-KITt hAFS, og vi fokuserte på å profilere sekretomfraksjonene deres. Vi fremhevet relevante distinksjoner som må tas i betraktning for den mulige kliniske oversettelsen av deres parakrine kapasitet.
I samsvar med tidligere uavhengige studier viser vi at svangerskapsstadiet ikke påvirket den heterogene hAFS-morfologien og deres mesenkymale antigenprofil [25,26]. Vi evaluerte deretter parametere som var mer sannsynlig å påvirke cellesekretorisk og parakrin aktivitet utover kanonisk stromal immunfenotype. Spesielt tilstedeværelsen av en CD146-positiv, CD107a-høy subpopulasjon i benmargs mesenkymale stamceller har nylig vist seg å korrelere med bemerkelsesverdig modulerende og terapeutisk parakrin aktivitet [47]. Her avslørte vi at både føtal- og perinatal hAFS er sterkt preget av denne molekylære signaturen som støtter deres sekretoriske styrke med relevante translasjonsimplikasjoner. Dessuten var føtal hAFS preget av ineffektiv aerob metabolisme, mens mer modne perinatale viste høyere oksygenforbruk og ATP-syntese. Dette kan tyde på en mer umoden metabolsk profil av II trimester hAFS som ligner navlestrengs stromaceller fra premature nyfødte, som har vist samme trend [60].
For å utløse parakrint potensial ble hAFS utsatt for 24 timers serumfri hypoksisk priming, en strategi vi tidligere har utviklet med suksess [34,35,37] for føtale celler og som vi her undersøkte på deres perinatale motstykke for første gang. Prekondisjonering av føtal- og perinatal hAFS under hypoksi resulterte i en positiv trend i økningen av sekretomkonsentrasjonen deres og i mengden frigjorte EV-er, mens svangerskapsstadiet ikke hadde noen effekt på cellesekretomutbyttet eller på EV-morfologi og størrelsesfordeling.
Spesielt avslørte karakterisering av hAFS parakrine last noen spesifikke forskjeller, i henhold til de forskjellige forholdene vi evaluerte. Den proteomiske profileringen av fosterets hAFS-sekretom avslørte merkbare faktorfordelinger basert på svangerskapsstadiet og cellehypoksisk prekondisjonering. Dette indikerer at hAFS parakrine potensialet kan få en distinkt identitet under modning fra Ⅱ til Ⅲ svangerskapstrimester som igjen kan moduleres ved å stimulere de utskillende cellene in vitro. Anrikningsanalyse av biologiske prosesser av hAFS-CM og hAFS-EVs antydet at de fleste av de modulerte proteinene kan stemme overens med cellevekst/vedlikehold og proteinmetabolisme, og dermed støtte de cellegunstige parakrine effektene som er rapportert langt. Spesielt ble det hypoksiske føtale hAFS-totalesekretomet funnet beriket med varmesjokkproteinet HSPD1 (HSP60), som ble demonstrert å støtte sårheling i en diabetisk musehudskademodell og fremme makrofag-pro-oppløsende skjevhet til M2-fenotype [61] . På samme måte ble hypoksiske føtale hAFS-EV-er beriket for faktorer som fremmer nevrogenese (HSPG2[62], selvfornyelse av celler og hjerne- og kardiovaskulær utvikling (LAMA5[63]og LAMB1[64]og migrasjon (THBS1 [2]). Proteoglykanen AGRN ble også funnet i elbiler etter hypoksisk priming av føtal hAFS.cistanche dosering redditFunnene våre er i tråd med tidligere bevis på at AGRN er oppregulert i proteomet til mesenkymale stromaceller under inflammatoriske og hypoksiske instruktive stimuli [65]. AGRN har også vist seg å være implisert i immunsynapsesignalering [66] og å stemme overens med neonatal musehjerteregenerering [67], og støtter dermed en uttalt predisposisjon av utviklingsmessig ung fosterhAFS mot regenerative parakrine effekter. Dessuten ble føtal hAFS bekreftet å være mer responsiv på hypoksisk prekondisjonering som vist ved berikelse av prediktorer for vaskulær regenerativ effekt, som ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 og MCP-1 cytokin[68], i deres betingede medium. Dette støtter tidligere bevis på den parakrine potensen til føtal hAFS-CM for å øke endogen neo-arteriogenese i prekliniske gnagermodeller av hjerteinfarkt, iskemi i bakbenet og iskemisk fasciokutan klaff [34,69-71]I tillegg er føtal hAFS totalt sekretom ble funnet betydelig mer beriket med IGFBP2 og OPN sammenlignet med det perinatale, noe som tyder på en mer uttalt pro-oppløsnings- og antialdringsmodulerende profil[72-75]. Den perinatale have-CM, mens den var mindre forsterket i parakrine faktorer, ble på samme måte supplert med nevrotrofiske og immunmodulerende faktorer, slik som CST3[76,77] og MIF[78].
Sammenlignet med total hAFS-CM, viste de tilsvarende hypoksiske føtal- og perinatal-EV-motstykkene lavere ekspresjon av cytokiner og kjemokiner, med unntak av den vaskulære remodelleringsmediatoren EMMPRIN [79], som for det meste var anriket i vesikkelrommet. Den tidligere rapporterte kardio-aktive og pro-regenerative profilen til føtale hAFS-EVs[34,37] er bekreftet her av bevis på deres eksklusive uttrykk for kardiobeskyttende IL-8 [80] og GDF-15, en viktig parakrin faktor som utløser endogen hippocampus neurogenese hos voksne [81, 82], samt motvirker antracyklin-indusert kardiotoksisitet [78]. Både føtal- og perinatale hAFS-EV-er viste lignende uttrykk for stamceller/stamcellehandelsregulatoren SDF-1 [83-85]. Den proteomiske analysen rapporterte økt ekspresjon av proteiner relatert til angiogenese, som NRP1 [86] og MP14[87] i hypoksiske perinatale hAFS-EVs; slik stimulerende profil kan forklare tidligere resultater på de endoteliale regenerative egenskapene til Ⅲ trimester hAFS i en preklinisk musemodell av iskemisk skade i skjelettmuskulaturen [25], til tross for bevis på at deres hAFS-CM er mindre pro-angiogene enn den tilsvarende føtale. Spesielt ble den nevrale vekstfaktoren BDNF funnet i både føtal og perinatal EV-last, men i lave mengder, og antyder dermed en antatt nevrotrofisk aktivitet for hAFS-EV-er i nevronal overlevelse og nevroutviklingsprosesser, som også observert for ekstracellulære vesikler som skilles ut av menneskelig bein marg- og navlestrengsblod-MSC[8889]. Både sekretomformuleringer fra føtal- og perinatal hAFS som gjennomgikk hypoksisk stimulering viste seg å være beriket med PAI-1, en tilrettelegger for endotelaktivering [90] som også har vært involvert i polariseringen av M2-makrofager i hjertet og utstyrt med kardiobeskyttende og anti-fibrotisk potensial [91].
MikroRNA-er (miRNA-er) har bredt blitt adressert som avgjørende regulatorer av stamcelle- og mesenkymal stromalcelle-EV parakrin aktivitet [92,93]. Her fant vi at de 15 mest berikede miRNA-artene i hAFS-EV-ene dekker mer enn 60 prosent av det totale miRNA-innholdet i hver prøve. Disse miRNA-ene har blitt rapportert å karakterisere den molekylære lasten til mesenkymale stromale celle-EV-er (la-7a-5p [4,95]), beskytte mot myokardiskemi ved å påvirke vaskulær regenerering og hemme fibrose (la -7b-5p, la-7f-5p, miR-21-5p og miR-155-5p [96,97]), promotere sårheling ved å regulere keratinocyttfunksjonen (miR-16-5p [98]) og motvirke nevronal død etter forhjerneiskemi (miR-29a-3p [99,100]). På den annen side ble det funnet rundt 1000 miRNA i de resterende 30 prosent av vesikulært miRNA-innhold. En slik ubalansert fordeling er i samsvar med tidligere studier [4] og fremhever de mest berikede miRNAene som de antatte ansvarlige for den viktigste biologiske aktiviteten til hAFS-EVs. Interessant nok delte føtal- og perinatale hAFS-EV-er flertallet av 15 miRNA-er. Merk at vi også observerte at både føtale hAFS-EV og perinatale inneholdt et sett med veldig stabile miRNA på tvers av forskjellige berikelsesnivåer. Slike bevis kan foreslå et bredt spekter av "husholdning"-kandidater som skal brukes som en intern referansekontroll i qPCR-eksperimenter på hAFS-EV-er. Dessuten, en konsistent undergruppe av slike stabile miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) deles mellom de to svangerskapsstadiene og overlapper med de 15 for det meste berikede, noe som antyder en enda mer konstant oppførsel og en pålitelig pre-oppløsnings molekylær signatur([96,{{45 }}]). Et par kandidater innenfor en slik særegen kjerne har nylig blitt rapportert som referanse-miRNA-er i nevrobeskyttende EV-er hentet fra fostervannsavledede mesenkymale stromaceller (miR-29a-3p og miR{{ 49}}s[95]). Ikke desto mindre la vi også merke til at svangerskapsalderen kan modulere miRNA-lasten mer enn hypoksisk prekondisjonering. Utviklingsmessig ble flere juvenile EV-er oppnådd fra føtal hAFS i III trimester anriket med miRNA-er som tidligere har vist seg å støtte levedyktigheten til embryonale stamceller (miR-302-3p [101]), celleproliferasjon og osteogen differensiering av benmargsstromaceller (miR) -217 [102]), mens den også inneholder tumorsuppressorpotensial (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).
Basert på resultatene våre bekrefter vi her at føtal- og perinatal hAFS kan representere attraktive parakrine kilder som skal utnyttes for regenerativ medisin. Mens deres fenotype og sekretoriske aktivitet var like, har vi fremhevet noen særegne aspekter i deres sekretomformuleringer som nyttig innsikt for deres fremtidige terapeutiske oversettelse.
4. Materialer og metoder
4.1. Humant fostervannsstamcelleisolering og in vitro-kultur
Humane fostervannstamceller (hAFS) ble isolert fra gjenværende prøver av fostervann (AF) samlet inn ved rutinemessig prenatal screening via Ⅱ trimester fostervannsprøve (fetal hAFS, f-hAFS), eller som klinisk avfall under planlagt levering av keisersnitt i løpet av Ⅲ trimester. (perinatal hAFS,p-hAFS) ved Prenatal Diagnosis and Perinatal Medicine Unit, IRCCS San Martino Hospital, ved Fetal- og perinatal Medical and Surgery Unit og Human Genetics Laboratory ved IRCCS Istituto Gaslini sykehus (Genova, Italia). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle givere i henhold til den lokale etiske komiteens autorisasjon (protokoll PR428REG2015) og i samsvar med retningslinjer for Helsinki-erklæringen. II trimester føtal AF-prøver ble tatt fra kvinnelige donorer med en gjennomsnittsalder på ca. 37,42±0,32 år (n=15 fra 36-opp til 41 år);Ⅲ trimester perinatale AF-prøver ble tatt fra kvinnelige givere med en gjennomsnittsalder på 34,25±1,31 år (n=10 fra 26- opp til 42 år). Foster- og perinatal hAFS ble hentet fra prøver validert for normal karyotype og isolert ved immunomagnetisk sortering for c-KIT-ekspresjon (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italia) fra adherente AF mesenkymale stromale celler [16].cistanche ekstrakt fordelerc-KIT* hAFS ble dyrket i Minimal Essential Medium (MEM)-alfa med 15 prosent FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), 18 prosent Chang B og 2 prosent Chang C Medium (Irvine Scientific) , Santa Ana, CA, USA) med 1 prosent L-glutamin og 1 prosent penicillin/streptomycin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), i en inkubator ved 37 grader med 5 prosent CO2 og 20 prosent Oz atmosfære og dyrket opp til 5 passasjer in vitro før de brukes til å isolere sekretomet deres.
4.2.Biokjemisk evaluering av hAFS-metabolisme
Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) celler ble brukt for hvert eksperiment. For å evaluere basal respirasjon ble hAFS permeabilisert med 0.03 mg/ml digitonin i 10 minutter og suspendert i fosfatbuffer saltvann (PBS). 10 mM pyruvat pluss 5 mM malat eller 20 mM succinat ble tilsatt for å stimulere banen -måter sammensatt av henholdsvis kompleks I, II og IV eller komplekser Ⅱ og IV [60].
For å evaluere de relative bidragene til respirasjon av glutamin, langkjedet fettsyreoksidasjon og glukose, etter digitonin-permeabilisering, ble celler suspendert i et vekstmedium og 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir og 4 uM UK5{{22} }99 ble tilsatt for å hemme henholdsvis glutaminase, karnitin palmitoyl-transferase 1A(CPT1A) eller den mitokondrielle pyruvatbæreren (MPC). Fi-F.ATP-syntase(ATP-syntase)-aktivitet ble påvist ved å måle ATP-produksjon ved den svært sensitive luciferin/luciferase-metoden. Analysene ble utført ved 37 grader i 2 minutter, og data ble samlet inn hvert 3.0 sekund. I et første sett med eksperimenter ble 10 graders celler inkubert i 10 min i medium som inneholdt 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenosin-5')penta-fosfat, 0,040 mg/ml ampicillin og 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Etterpå ble ATP-syntese indusert ved tilsetning av respiratoriske substrater (10 mM pyruvat pluss 5 mM malat eller 20 mM succinat) og 0,1 mM ADP. Reaksjonen ble målt ved å bruke luciferin/luciferase ATP bioluminescensanalysesettet CLSII (Roche, Basel, Sveits) i et Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, Italia)ATP standardløsninger (Roche, Basel, Sveits) som strekker seg {{ 42}}/M ble brukt for kalibrering. I det andre settet med eksperimenter ble ATP-syntese evaluert i nærvær av 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir eller 4 uM UK5099. I dette tilfellet ble 10 celler inkubert i 10 minutter i et vekstmedium i fravær eller nærvær av en metabolismehemmer, og ATP-syntese ble indusert med 0,1 mM ADP. OxPhos (oksidativ fosforylering) effektivitet (P/O-forhold) ble beregnet som forholdet mellom konsentrasjonen av produsert ATP og mengden forbrukt oksygen i nærvær av respiratorisk substrat og ADP. Når oksygenforbruket er fullstendig viet til energiproduksjon, bør P/O-forholdet være ca. 2,5 og 1,5 etter tilsetning av henholdsvis pyruvat pluss malat eller succinat. i vekstmediet. Glukoseforbruket ble evaluert av heksokinase (HK) og glukose-6-fosfatdehydrogenase(G6PD)-koblingssystemet, etter reduksjon av NADP ved 340 nm. Analysemediet inneholdt 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IE heksokinase og 2 IE glukose-6-fosfatdehydrogenase. Laktatfrigjøring ble analysert etter reduksjon av NAD pluss ved 340 nm. Analysemediet inneholdt 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD pluss og 1 IU/ml laktatdehydrogenase. Prøver ble analysert før og etter tilsetning av 4 ug renset laktatdehydrogenase. I begge tilfeller ble data normalisert til cellenummeret og uttrykt som henholdsvis mM glukose/10 graders celler eller mM laktatfrigitte/10 graders celler [107].
4.3.Flowcytometrikarakterisering av hAFS
Ett hundre tusen (105) føtale- og p-hAFS-celler ble løsnet og inkubert med mus anti-human-CD107a-Alexa Fluor 647-og anti-human CD146-FITC- konjugerte antistoffer (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Celleapoptose ble vurdert ved å bruke et FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italia) etter produsentens instruksjoner. Hendelser ble innhentet på en BD Bioscience FACS Aria II sorterer og analysator, utstyrt med FACS Diva-programvare (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milan, Italia). Data ble analysert ved bruk av FlowJo V9.0-programvare (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan , Italia). 4.4. Aldringsfarging
Senescensfenotypen til hAFS dyrket opp til passasje 5 i standard in vitro-betingelser ble evaluert med Senescence -Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hånd p-hAFS ble fikset med 1x fikseringsløsning ved 70 prosent konfluens og farget for SA- -gal ved 37 grader over natten, i henhold til produsentens instruksjoner. Aldrende hendelser ble registrert på et Leica DMil-mikroskop (utstyrt med Leica Acquire-programvare V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italia) og evaluert som en prosentandel av SA- -gal-positive celler over det totale antallet celler per felt.
4.5. Separasjon og konsentrasjon av hAFS-sekretomfraksjonene
f-hAFS og p-hAFS ble dyrket i 24 timer i serumfritt medium (SF) i 1 prosent O2-hypoksi versus 20 prosent O2-normoksi (kontroll), sistnevnte ble brukt som basislinjereferanse. Denne forkondisjoneringsstrategien ble brukt for å forbedre frigjøringen av bioaktive parakrine faktorer, som vi tidligere rapporterte [34,35,37,49]. hAFS ble dyrket i 24 timer i serumfritt (SF) medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium med høy glukose, DMEM, med 1 prosent L-glutamin og 1 prosent penicillin/streptomycin, alt fra Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), under normoksiske (20 prosent O2 og 5 prosent CO2 ved 37 grader) eller hypoksiske (1 prosent O2 og 5 prosent CO2 ved 37 grader i CellXpert C170i og Galaxy 48R CO2-inkubatorer, fra Eppendorf, Milano, Italia) forhold.
f-hAFS-CM og p-hAFS-CM ble samlet og sentrifugert ved 4 grader ved 300x g i 10 minutter og 2000x g i 20 minutter for å fjerne celleavfall; hAFS-CM ble konsentrert ved bruk av ultrafiltreringsmembraner med en 3kDa selektiv cut-off (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Tyskland) ved 4 grader ved 3000× g i 90 minutter og deretter ytterligere konsentrert ved 4 grad ved 3000× g i 30 min. hAFS-EV-er ble separert og konsentrert ved seriell ultrasentrifugering fra hAFS-CM. Kort fortalt ble hAFS-CM samlet og sentrifugert ved 4 grader ved 300 x g i 10 minutter, og 2000 x g i 20 minutter for å fjerne celleavfall. Supernatanten ble deretter behandlet ved 10 000 x g i 40 minutter. Pelleten ble kastet og supernatanten ble viderebehandlet ved ultrasentrifugering i en Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Italia) ved 10 000×g i 120 minutter ved bruk av Beckman Coulters svingende bøtte SW55Ti sentrifugerotorer. Pelleten som inneholdt heterogene hAFS-EVs ble vasket i PBS med endelig sentrifugering ved 100 000 x g i 120 minutter og deretter resuspendert i PBS filtrert med en 0,22 um pore filtermembran. Proteinkonsentrasjoner i hAFS-CM og på overflaten av hAFS-EV-er ble målt ved å bruke BiCinchoninic Acid (BCA)-analysen (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia). Prøver ble innhentet på en Gen5 mikroplateleser ved 570 nm for å evaluere hAFS-CM og hAFS-EVs utbytte i form av ug av løsning/10 graders produserende celler.
4.6. Karakterisering av hAFS-EV ved transmisjonselektronmikroskopi og nanopartikkelsporingsanalyse
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM)-analyse ble utført på et Hitachi TEM-mikroskop (HT7800-serien, Hitachi High Technologies, Monza, Italia). Digitale bilder ble tatt med et Mega view 3-kamera og Radius-programvare (EMSIS, Münster, Tyskland). f-hAFS og p-hAFS ble fiksert i 3,7 prosent paraformaldehyd (PA)-løsning fortynnet 1:1 med hAFS komplett medium, vasket i 0.1 M kakodylatbuffer og deretter umiddelbart inkubert i 1 time ved romtemperatur i 0,1 M kakodylatbuffer inneholdende 2,5 prosent glutaraldehyd (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Cellepelleter ble etterfiksert i osmiumtetroksid i 1 time og i en 1 prosent uranylacetatløsning i 1 time. Prøver ble dehydrert i 24 timer ved 42 grader og 48 timer ved 60 grader gjennom en gradert etanolserie og innebygd i epoksyharpiks (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Tyskland). Ultratynne seksjoner (50 nm) ble kuttet med Leica Ultracut mikrotom (Leica Microsystems, Milano, Italia) og motfarget med en 5 prosent uranylacetat i 50 prosent etanolløsning. f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs ble resuspendert i 20 uL PBS-løsning og fiksert ved å tilsette et likt volum av 2 prosent paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbufferløsning (pH 7,4). EV-er ble deretter adsorbert i 10 minutter på formvar-karbonbelagte kobbergitter ved å flyte gitterne på 5 μL dråper på parafilm. Deretter ble rutenett med vedheftende elbiler skylt i PBS og negativt farget med 2 prosent uranylacetatløsning i 5 minutter ved romtemperatur. Farget gitter ble innebygd i 2,5 prosent metylcellulose for forbedret konservering og lufttørket før undersøkelsen. Morfometrianalyse av hAFS-EV-er ble målt på 10 tilfeldig tatt mikrofotografier ved 40.000× g forstørrelse. Størrelsen ble beregnet ved hjelp av den vilkårlige linjefunksjonen innebygd i måledialogboksen til Radius-programvaren (EMSIS, Muenster Tyskland). For å visualisere hAFS-EVs størrelsesfordeling ble resultatene plottet som spredningspunktplott og som frekvensfordeling der hver størrelse er representert som et punkt sammen med linjer for medianverdien og området.
f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs ble også analysert ved hjelp av Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for å vurdere partikler frigjort av 10 graders celler. hAFS-EV-er ble fortynnet 1:100 i PBS-løsning og anskaffet på en NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Storbritannia) som registrerte minst 3 forskjellige rammer på 60 s hver. Tre forskjellige anskaffelser av hver prøve ble analysert ved bruk av Batch Process-alternativet i programvaren. 4.7.LC-MS/MS Analyse av hAFS-CM og hAFS-EVs 4.7.1.In-Solution Digestion
Proteomisk analyse ble utført på 3 biologiske replikater av hAFS-CM og hAFS. EVs fra f-hAFS og p-hAFS etter normoksisk eller hypoksisk prekondisjonering (n=24 forskjellige tilstander). hAFS-CM og hAFS-EVs prøver ble suspendert i 0.1M NHCO3 pH 7,9 og behandlet med RapigestIM SF-reagens (Waters Co, Milford, MA, USA) ved sluttkonsentrasjonen på 0,25 prosent (vekt/volum). De resulterende suspensjonene ble inkubert under omrøring ved 100 grad i 2{{40}} min. Fordøyelsen ble utført på hver prøve ved å tilsette Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega Inc, Madison, WI, USA) ved et enzym/substrat-forhold på 1:50 (w/w) over natten ved 37 grader i 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9 buffer med 10 prosent CHSCN. En ytterligere aliquot av trypsin (1:100 w/w) ble tilsatt om morgenen, og fordøyelsen fortsatte i 4 timer. Dessuten stoppet tilsetningen av 0,5 prosent trifluoreddiksyre (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) den enzymatiske reaksjonen, og en påfølgende inkubasjon ved 37 grader i 45 minutter fullførte RapiGest-syrehydrolysen [108]. De vannublandbare nedbrytningsproduktene ble fjernet ved sentrifugering ved 13. 000 rpm i 10 min. Til slutt ble de tryptiske fordøyelsesblandingene avsaltet ved bruk av PierceTM C-18 spinnkolonner (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia), i henhold til produsentens protokoll, og ble resuspendert i 0,1 prosent maursyre (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) i vann (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) i en konsentrasjon på 0,1 ug/μL.
4.7.2.Væskekromatografi
Trypsinfordøyde blandinger ble analysert ved hjelp av en plattform bestående av et nano-væskekromatografisk system, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, en del av AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA) konfigurert i trap-elueringsmodus, kombinert med et høyoppløselig massespektrometer. Kort fortalt ble prøver (0.8 ug injisert) først lastet på en peptidfelle (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) og vasket med ladepumpen i isokratisk modus med 0,1 prosent maursyre i vann i 10 minutter med en strømning på 3 μL/min. Den automatiske vekslingen av en ti-ports ventil eluerte deretter den fangede blandingen på en nano-reversert fasekolonne (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um, 120 A) gjennom en 150 min gradient av eluent B (eluent A, 0,1 prosent maursyre i vann; eluent B, 0,1 prosent maursyre i acetonitril) ved en strømningshastighet på 300 nL/min. I dybden var gradienten: fra 5-10 prosent Bin 3min,10-40 prosent Bin 130min,40-95 prosent Bin 10 min og hold på 95 prosent B i 7min. 4.7.3.Massespektrometri
MS/MS-analyser ble utført på et LTQ-OrbitrapXL massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia) utstyrt med en nanosprayionekilde. Spraykapillærspenningen ble satt til 1,7 kV og ioneoverføringskapillærtemperaturen ble holdt på 220 grader. Fulle MS-spektre ble registrert over et 400-1600 m/z-område i positiv ionmodus, med en oppløsningsevne på 60 000 (full bredde ved halv maksimum) og en skannehastighet på 2 spektre/s. Dette trinnet ble fulgt av fem lavoppløselige MS/MS-hendelser som ble sekvensielt generert på en dataavhengig måte på de fem øverste ionene valgt fra hele MS-spekteret (ved 35 prosent kollisjonsenergi), ved bruk av dynamisk ekskludering på 0,5 minutter for MS/MS analyse. Massespektrometerskannefunksjoner og høyytelses væskekromatografiløsningsmiddelgradienter ble kontrollert av Xcalibur-datasystemet versjon 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia).
4.7.4.Proteomisk databehandling og datautvinning
Alle genererte data ble søkt ved hjelp av Sequest HT-søkemotoren i Thermo Scientific Proteome Discoverer-programvaren, versjon 2.1. De eksperimentelle MS/MS-spektrene ble korrelert til tryptiske peptidsekvenser ved sammenligning med de teoretiske massespektrene oppnådd ved silico-fordøyelse av Uniprot Homo Sapiens proteomdatabase (74600-oppføringer), lastet ned 2. januar 020 (www.uniprot.org, åpnet 10 2. mars021). Følgende kriterier ble brukt for identifikasjon av peptidsekvenser og relaterte proteiner: trypsin som et enzym, tre savnede spaltninger per peptid, massetoleranser på ±50 ppm for forløperioner og ±0,8 Da for-fragmentioner. Perkolatornode ble brukt med en mål-lokkestrategi for å gi en endelig falsk oppdagelsesrate (FDR) på Peptide Spectrum Match (PSM) nivå på 0,01 (streng) basert på q-verdier, tatt i betraktning en maksimal deltaCN på 0,05 [109]. Bare peptider med minimum peptidlengde på seks aminosyrer og rang1 ble vurdert. Proteingruppering og strenge sparsomhetsprinsipper ble brukt. MS-dataene er deponert til ProteomeXchange Consortium via PRIDE [10]partnerdepotet (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, tilgjengelig 10. mars 2021) De 48 proteinene som ble oppnådd fra SEQUEST-algoritmen ble justert, normalisert , og etikettfri sammenlignet. En intern algoritme, nemlig Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa) ble brukt for dette formålet, ved å bruke gjennomsnittlig peptidspektrummatch (aPSM) [111,112] som tilsvarer gjennomsnittet av alle spektrene identifisert for et protein, og følgelig , til dens relative overflod, i hver analyserte tilstand. I dybden, for å velge differensielt uttrykte proteiner, ble undergrupper (for både føtal- vs perinatal-hAFS-CM og hAFS-EVs, tatt i betraktning også hypoksisk celle-prekondisjoneringsstimulering), parvis sammenlignet ved å bruke en terskel på 0,4 og 5 på de to MAProMa indekser henholdsvis DAve (Differensial Average) og DCI (Differential Confidence Index). DAve, som evaluerer endringer i proteinuttrykk, ble definert som (XY)/(X＋Y)/0,5, mens DCI som evaluerer konfidensen til differensielt uttrykk, ble definert som (X pluss Y)×(XY)/2 X og Y termer representerer PSM for et gitt protein i to sammenlignede prøver. I tillegg ble de gjennomsnittlige proteinlistene, hentet fra hver undersøkte tilstand, utsatt for lineær diskriminantanalyse (LDA), og proteiner med det største F-forholdet (Større enn eller lik 4,5) og minste p-verdi (Mindre enn eller lik 0,001) ble beholdt og behandlet ved hierarkisk klynging, ved å bruke Wards metode og den euklidiske avstandsmetrikk ved bruk av JMP 15.2-programvare. Konkret representerte F-forholdet modellmiddelkvadraten delt på feilmiddelkvadraten, mens p-verdien indikerte sannsynligheten for å oppnå en F-verdi som er større enn den beregnet hvis det i realiteten ikke var noen forskjell mellom gjennomsnittsgruppene. 4.8. Cytokin- og kjemokinprofilering av hAFS-CM og have-EVs
Cytokin- og kjemokinprofilering av hAFS-CM og have-EVs oppnådd ved f-hAFS og p-hAFS etter hypoksisk prekondisjonering ble vurdert ved hjelp av Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array-settet (R&D System, Minneapolis, MN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Tjue ug av hAFS-CM- og hAFS-EVs-prøvene ble brukt. Membranbilder ble ervervet av en Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Spesifikt cytokin/kjemokininnhold ble evaluert ved kvantifisering av positiv pikselintensitet (ved hjelp av den vilkårlige enheten) for hvert påvisbart cytokin ved bruk av ImageJ-programvare (tilgjengelig på https: //imagej.nih.gov/ij/, åpnet 10. mars 2021 [13]). 4.9.RNA-ekstraksjon fra hAFS-EVs og Next
Generasjonssekvensering
RNA ble isolert fra f-hAFS-EVs og p-have-EVs med miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milano, Italia) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-integritet og størrelsesfordeling ble evaluert ved å bruke Agilent Small RNA Kit med den lille ikke-kodende RNA-brikken for å vurdere innholdet av små RNA-er fra 6 til 150 nukleotider (nt). Qubit microRNA-analysesettet (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia) ble brukt til å kvantifisere innholdet av mikroRNA (miRNA), etter produsentens instruksjoner. miRNA-sekvenseringsbiblioteker ble forberedt og amplifisert ved å bruke QIAseq miRNA Library-settet (Qiagen, Milano, Italia) ved å bruke 18,5 ng isolerte miRNA-er som input og følge produsentens instruksjoner. Biblioteker ble samlet etter en kvalitetssjekk og kvantifisering av TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, USA) ble utført ved bruk av Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Samlede biblioteker ble vurdert for kvalitetskontroll ved sanntids qPCR etter "Sequencing Library qPCR Quantification" Guide (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) og sekvensert av Illumina NextSeq-plattformen ved bruk av High Output Hit v2.5 (75 sykluser) ( Illumina Inc, San Diego, CA, USA). Basisanrop ble utført med standard arbeidsflyt for Illumina NextSeq500.
4.10. Bioinformatisk dataanalyse av miRNA-sekvensering
Fastq-filer ble først behandlet ved å trimme av 3'-adapteren og baser av lav kvalitet ved å bruke Cutadapt [114]. Etter trimming ble innsettingssekvensene og UMI-sekvensene identifisert. Avlesninger uten adaptersekvens, avlesninger med mindre enn 16 bp innsettingssekvenser og avlesninger med mindre enn 10 bp UMI-sekvenser ble forkastet. For å kommentere innsettingssekvensene ble avlesningene justert til GRCh38 humant genomsammenstilling ved bruk av Bowtie [15] For hver prøve ble alle avlesninger tilordnet et bestemt miRNA talt, og de tilknyttede UMI-ene ble aggregert for å telle unike molekyler. Sekundæranalyse ble utført av tilpassede R-skript tilgjengelig på rimelig forespørsel. Differensiell anrikningsanalyse ble utført ved bruk av Limma [116] og EdgeR Bioconductor-pakker [117].
4.11. Statistiske analyser
Resultatene presenteres som gjennomsnitt ±sem av minst tre(n{0}}) uavhengige eksperimenter. Sammenligninger ble trukket ved enveis ANOVA etterfulgt av posthoc Tukeys multiple sammenligningstest eller ved Students t-test. Analyser ble utført ved bruk av Graph-Pad Prism versjon 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, åpnet 10. mars 2021) med statistisk signifikans satt til* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">
Som konklusjon ble føtal- og perinatal hAFS funnet fenotypisk ekvivalent med sammenlignbar sekretorisk styrke og EV-anrikning i størrelse og distribusjon; men noen distinksjoner i deres sekretomprofil kunne verdsettes. Spesielt kan den utviklingsmessig umodne profilen til føtal hAFS rekapituleres av deres sekretomformuleringer utstyrt med et mer uttalt pro-vaskulogent, pro-regenerativt og foryngende sekretom. Imidlertid beholder perinatal hAFS fortsatt en relevant parakrin profil via uttrykk for faktorer relatert til endotelcellemigrasjon, immunmodulerende, antiinflammatorisk og nevrotrofisk potensial som ligner på føtal hAFS. Disse funnene kan gi nyttig innsikt som støtter en fremtidig parakrin terapi av skaderelatert og inflammatorisk/iskemisk-basert sykdom. Derfor bør valget av enten føtal eller perinatal hAFS som den mest ideelle cellekilden vurderes med tanke på det spesifikke kliniske scenariet.
Denne artikkelen er hentet fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms
