Kvalitetsmarkører av Cistanches Herba basert på antioksidantspektrum-effektforhold

Abstrakt

Mål: Å etablere en forskningsmetode for kvalitetsmarkørene (Q-markørene) tilCistanches Herba(CH)basert påantioksidant spektrum-effekt forhold, som gir et grunnlag for studiet av dets farmakologiske stoffer og kvalitetskontroll. Metoder: Ultra-high-performance væskekromatografi (UPLC) ble brukt for å etablere fingeravtrykksprofiler for 10 batcher av CH. En celleoksidativ skademodell ble etablert ved bruk av H2O2, og antioksidantkapasiteten til CH ble bestemt basert på den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen av reaktive oksygenarter, samt nivåene av superoksidedismutase og katalase som farmakologiske indikatorer. Spektrum-effekt-forholdet ble konstruert gjennom hovedkomponentanalyse, Pearson-korrelasjonsanalyse og delvis minste kvadraters regresjonsanalyse. De aktive komponentene ble gjenstand for farmakologisk validering. Resultater: Fingeravtrykksprofiler for CH ble etablert ved bruk av UPLC, og identifiserte 17 vanlige topper. Basert på spektrum-effekt korrelasjonsanalyse ble ni komponenter valgt. De farmakologiske valideringsresultatene indikerte at geniposidinsyre, 8-epilogansyre,echinacoside, akteosid,isoakteosid, ogtubulosid Aviste antioksidantaktivitet på en konsentrasjonsavhengig måte. Konklusjon: Denne studien utforsket Q-markører for CH basert på spektrum-effekt-forholdet, og ga referanseinformasjon for dets farmakologiske substansgrunnlag og kvalitetsstandardforbedring.

Nøkkelord:Cistanches Herba; Q-markør;spektrum-effekt forhold; antioksidant

ØKOLOGISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 30 % ECHINACOSIDE OG 12 % ACTEOSIDE FOR NYREFUNKSJON

Cistancheer den tørkede kjøttfulle stilken med skjellete blader av Cistanche deserticola YCMa eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, en plante som tilhører slekten Cistanche i familien Orobanchiaceae. Den ble først spilt inn i "Shen Nong's Materia Medica" og er oppført som toppkarakter [1]. Den er varm i naturen, søt og salt på smak; det går tilbake til nyrene og tykktarmens meridianer; det har effekten av å nære nyre-yang, fylle på essens og blod, fukte tarmene og avføringsmiddel, og er en viktig medisin for å tonifisere nyrene og fylle på essens [2-3]. Nyrene lagrer essens, og essens og blod kommer fra samme kilde. Hvis essens og blod er mangelfull, vil det påvirke den generelle livsaktiviteten til menneskekroppen; den essens-produserende margen er lagret i knoklene, og hjernen er marghavet. Hvis nyreessensen er utilstrekkelig, vil beinene miste næring og hjernen vil være mangelfull, noe som resulterer i bendegenerative endringer som løs tekstur, tanntap, hukommelsestap, demens og nedsatt immunforsvar [4-6]. Cistanche deserticola inneholder fenyletanolglykosider, iridoider, lignaner og andre strukturelle komponenter, inkludert echinaceaside, verbascoside, isorbascoside, genipinic acid og 8-epistryanic acid. , tubulin A, etc. [7]. Den nåværende kvalitetskontrollen av Cistanche deserticola i 2020-utgaven av "Pharmacopoeia of the People's Republic of China" fastsetter bare innholdet av echinaceaside og verbascoside, som ikke fullt ut kan reflektere multikomponent- og multi-target-handlingsegenskapene til tradisjonell kinesisk medisin. , som ikke bidrar til kvalitetskontroll og evaluering.

For å forbedre kvalitetskontrollnivået til tradisjonell kinesisk medisin og optimere kvalitetsevalueringen av tradisjonell kinesisk medisin, foreslo akademiker Liu Changxiao det nye konseptet kvalitetsmarkør (Q-markør) for tradisjonell kinesisk medisin [8]. Blant dem er "effektivitet" kjerneelementet i de "fem prinsippene" til Q-markør [9] og er også kjernen i kvalitetsevalueringen av tradisjonelle kinesiske medisiner.

I lys av dagens forskningsstatus med dårlig korrelasjon mellom kvalitetsstandarder og legemiddeleffektivitet, er det å utforske Q-markører for tradisjonelle kinesiske medisiner og etablere mer vitenskapelige og rimelige kvalitetsstandarder av stor betydning for å forbedre kvaliteten på tradisjonelle kinesiske medisiner. Spektrum-effekt forholdet er å koble fingeravtrykkskromatografiske toppene til tradisjonell kinesisk medisin med spesifikke farmakodynamiske data for å finne de effektive stoffene i tradisjonell kinesisk medisin, og dermed reflektere den iboende kvaliteten til tradisjonell kinesisk medisin [10]. Etableringen av en matematisk modell for spektral effektivitet kan tydeliggjøre QMarker av tradisjonell kinesisk medisin fra et "helhetssyn" perspektiv, og gi mer referanse for senere kvalitetskontroll av tradisjonell kinesisk medisin, formulering av kvalitetsstandarder og screening av aktive ingredienser. Denne studien bruker fingeravtrykk kombinert med halv-inhiberingshastigheten til reaktive oksygenarter (ROS IC50), innholdet av superoksiddismutase (SOD) og katalase (CAT) for å studere spektrum-effektforholdet til tradisjonell kinesisk medisin, og bruker hovedkomponentanalyse (PCA) ), Pearson korrelasjonsanalyse (PCC) og partiell minste kvadraters regresjonsanalyse (PLS) for å analysere Q-markøren til Cistanche deserticola for å gi grunnlag for kvalitetskontrollen.

1 materiale

1.1 Eksempel

Cistanche deserticolable høstet fra Yutian County, Xinjiang og Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) plantebase i indre Mongolia. Det ble identifisert av forsker Zhang Tiejun fra Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight og Cistanche deserticola.

YC Ma, detaljert informasjon er vist i tabell 1.

1.2 Test medisin

Echinaceaside (batchnummer: 111670-201907, renhet: 91,8 %) og verbascoside (batchnummer: 111530-201914, renhet: 95,2 %) ble begge kjøpt fra China Institute of Food and Drug Control; isorescosid (batchnummer: 61303-13 -7), salidrosid (batchnummer: 10338-51-9), 8-epistrychnoic acid (batchnummer: 82509-41-9), genipinic acid (batchnummer: Z24A10X95926) , tuberosin B (partinummer: 112516-04-08), 2-acetyleugenolglykosid (partinummer: 94492-24-7) ble kjøpt fra Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., renhet større enn eller lik 98 %; Cistanche glykosid A (batchnummer: MUST -20062806, renhet: 98,51 %) og vasculin A (batchnummer: MUST19110102, renhet: 98,57 %) ble kjøpt fra Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; kromatografisk ren acetonitril og maursyre ble kjøpt fra Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Renset vann (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Dimetylsulfoksid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, USA); CellTiter 96® AQueous single solution celleproliferasjonsdeteksjonssett (G3580, Promega Company, USA); CAT-deteksjonssett (S0051), SOD-aktivitetsdeteksjonssett S0101M ) og ROS-deteksjonssett (S0033S) ble kjøpt fra Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenter

Waters H-klasse-PDA ultrahøy ytelse væskekromatograf (Waters Company, USA); Sartorius BT25S elektronisk balanse (Sartorius Company, Tyskland); H1650 høyhastighets desktop sentrifuge (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikroplate-leser (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologisk mikroskop (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 celler

Humane embryonale nyreceller HEK 293-celler ble brukt i dette eksperimentet og ble kjøpt fra cellebanken til det kinesiske vitenskapsakademiet.

2 metoder

2.1 Etablering av fingeravtrykkskart

2.1.1 Tilberedning av testløsning: Vei 2 g Cistanche deserticola medisinsk materiale, tilsett 10 ganger mengden vann, varm opp og tilbakeløp 3 ganger, 1 time hver gang, sentrifuger ved 1.0 ×105r·min-1 i 15 minutter (sentrifugalradius er 300 mm), Kombiner supernatantene og konsentrer for å lage en stamløsning med en massekonsentrasjon på 100 mg·mL-1, fortynn den 10 ganger, og filtrer den gjennom en 0,22 µm mikroporøs filtermembran for å oppnå den.

2.1.2 Tilberedning av blandet referanseløsning

Ta 8-epistrrychnic acid, salidroside, echinaceaside, cistanche glycoside A, genipinic acid, verbascoside, antocyanoside A, isorbascoside, and 2'-acetyl eugenol. Glykosid og angiosid B referansestoff ble målt i passende mengder og veid nøyaktig. Tilsett 50 % metanolløsning for å løse opp og klargjør en blandet referansesubstansløsning med en massekonsentrasjon på 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografiske forhold

ACQUITY UPLC®BEH C18 kolonne (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobil fase er acetonitril (A) ~ 0,1% maursyreløsning (B), gradientelueringsprogram (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A ; 6~10 min, 8%~15%A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); deteksjonsbølgelengden er 237 nm; strømningshastigheten er 0,4 mL·min –1; kolonnetemperaturen er 40 grader; injeksjonsvolumet er 3 µL.

2.1.4 Valg av referansetopp

I ultra-performance væskekromatografi (UPLC) kromatogrammet til Cistanche deserticola ble toppen med det største topparealforholdet, moderat retensjonstid og god separasjon valgt som referansetoppen for fingeravtrykkspekteret.

2.1.5 Metodegjennomgang

Presisjonstest: Ta T1-prøven og klargjør testløsningen i henhold til metoden under 2.1.1. Injiser prøven 6 ganger kontinuerlig og registrer fingeravtrykket. Resultatene viser at det relative topparealet RSD for hver topp er 0.10%~4.61%, og den relative retensjonstiden RSD er 0.08%~1.32%, noe som indikerer at instrumentet har god presisjon.

Repeterbarhetstest: Ta T1-prøven og klargjør 6 prøver av testløsningen parallelt i henhold til metoden under 2.1.1, og injiser prøven kontinuerlig. Resultatene viser at det relative topparealet RSD for hver kromatografisk topp er 1,35%~4,80%, og den relative retensjonstiden RSD er 0,10%~1,80%, som oppfyller kravene til fingeravtrykket og viser at repeterbarheten av instrumentet er bra.

Stabilitetstest: Ta T1-prøven og klargjør testløsningen i henhold til metoden under 2.1.1, injiser prøver for testing ved 0, 2, 4, 8 og 12 timer, og registrer fingeravtrykket. Den beregnede RSD for det relative topparealet for hver kromatografisk topp er 0,53 %~4,82 %, og RSD for den relative retensjonstiden er 0,09 %~2,17 %, som oppfyller kravene av fingeravtrykket og indikerer at testproduktet er stabilt innen 12 timer.

2.2 Forskning på antioksidanteffekten til Cistanche deserticola

2.2.1 Tilberedning av Cistanche deserticola moderlut

Ta moderluten under punkt 2.1.1, filtrer og steriliser den, og fortynn den med kulturmedium til ønsket konsentrasjon før bruk.

2.2.2 Cistanche deserticola og positiv kontroll

Effekten av VE på levedyktigheten til HEK 293-celler ble satt som normal gruppe (cellesuspensjon), Cistanche deserticola-administrasjonsgruppe (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE-gruppe (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), sett inn 6 duplikatbrønner for hver konsentrasjon, dyrking i 24 timer, tilsett 20 µL CellTiter 96® AQueous enkeltoppløsningsreagens til hver brønn for å oppdage cellelevedyktighet, fortsett å dyrke i 2 timer, og bruk en mikroplateleser for å påvise cellelevedyktigheten ved 490 nm. Absorbansverdien (OD) for hver brønn ble brukt til å beregne celleoverlevelsesraten i henhold til formel (1). Overlevelsesrate (%)=(OD-eksperimentgruppe/OD-blank gruppe) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola på H2O2-induksjon

Effekt av ROS på HEK 293 celler. Cellene ble delt inn i normal gruppe (cellesuspensjon) og Cistanche deserticola administreringsgruppe (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL-1 Cistanche deserticola og 60 µm·L-1 H2O2), og dyrket 24 timer. Følg trinnene i ROS-deteksjonssettet for påfølgende operasjoner, observer cellefargingen direkte gjennom et mikroskop, og bruk en mikroplateleser for å oppdage fluorescensintensiteten til hver gruppe. Parameterinnstillinger brukte en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og en emisjonsbølgelengde på 525 nm. Eksperimentet ble gjentatt tre ganger.

2.2.4 Cistanche deserticola-par

Effekt av H2O2 på SOD i HEK 293-celler. Cellene ble delt inn i normal gruppe (cellesuspensjon), modellgruppe (60 µm·L–1 H2O2), VE-gruppe (60 µm·L–1 VE og 60 µm·L–1 H2O2), Cistanche deserticola-administrasjonsgruppe (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola og 60 µm·L–1 H2O2), samle opp cellene etter 24 timers dyrking, tilsett SOD-prøveprepareringsløsning for å lysere cellene, og sentrifuger ved 4 grader og 12000 r·min{{22} } min (sentrifugeringsradius er 300 mm), ta supernatanten som prøven som skal testes, og følg trinnene i SOD-deteksjonssettet for påfølgende operasjoner. Eksperimentet ble gjentatt tre ganger.

2.2.5 Cistanche deserticola på H2O2-induksjon

Effektene av CAT på HEK 293-celler ble behandlet i henhold til metoden i 2.2.4 og gruppert i grupper. Etter behandling, tilsett lyseringsløsning, sentrifuger ved 4 grader og 12000 r·min-1 i 10 minutter (sentrifugalradius er 300 mm), ta supernatanten og følg Følg trinnene i CAT-deteksjonssettet for påfølgende operasjoner . Eksperimentet ble gjentatt tre ganger.

2.2.6 Statistisk analyse

SPSS 26.0-programvare ble brukt til statistisk analyse. Hver gruppe data ble representert ved (±±(). Enveis variansanalyse ble utført på dataene som samsvarte med normalfordelingen. Hvis variansene var like, ble metoden minst signifikante forskjeller brukt. Hvis variansene var ujevnt, ble Dunnetts T3-metode brukt til å tegne grafer, og P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Spektrum-effekt korrelasjonsanalyse av Cistanche deserticola antioksidant

2.3.1 PCA Toppområdene til de vanlige toppene av 10-partier av Cistanche deserticola som har etablert fingeravtrykk ble normalisert med Z-verdi og gjort til en 10×17 ordredatamatrise, som ble importert til SPSS 26.0-programvare for PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 ble brukt til å utføre bivariat analyse for å studere det spektrale effektivitetsforholdet mellom Cistanche deserticola-fingeravtrykk og antioksidanter. Signifikanstesting ble utført ved bruk av en tosidig test (T), med P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Importer de eksperimentelle resultatene av Cistanche deserticolas standardiserte toppareal og antioksidant inn i SIMCA-P 14.1-programvaren, sett topparealet som X-variabel, og sett den farmakodynamiske indeksen som Y-variabel for å utføre PLS.

2.4 Verifisering av Cistanche deserticola Q-markør antioksidantaktivitet

2.4.1 Fremstilling av moderløsningen av aktive ingredienser. Vei nøyaktig passende mengder genipinsyre, 8-epistrichnic acid, echinaceaside, verbascoside, isorebascosid og antocyanosid A, og tilsett DMSO for å løse dem opp i 10 mmol·L-1 referanseløsning.

2.4.2 Virkestoffers effekt på HEK 293 cytotoksisitet.

Etter inkubering av HEK 293-celler i 24 timer, tilsett forskjellige konsentrasjoner av oppløsninger av den aktive ingrediensen under 2.4.1 til hver brønn (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, kontinuerlig stimulering

Etter at cellene var inkubert i 24 timer, ble CellTiter 96® AQueous enkeltoppløsningsreagens tilsatt for å påvise cellelevedyktighet.

2.4.3 Den antioksidative skadevirkningen av aktive ingredienser på H2O2-indusert HEK 293-celler.

Cellene er gruppert som følger: normalgruppe, modellgruppe og VE-gruppe er gruppert i henhold til 2.2.4. Eksperimentell gruppe (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktivitetssammensetning og 60 µm·L–1 H2O2), dyrket i 24 timer. Bestem intracellulære ROS-nivåer, SOD- og CAT-enzyminnhold i henhold til metodene under henholdsvis 2.2.3, 2.2.4 og 2.2.5.

Støttetjeneste fra Wecistanche

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop