R-Phycoerythrin fra Colaconema Formosanum (Rhodophyta), et anti-allergisk og kollagenfremmende materiale for kosmetikk

Abstrakt:Cistanche(cistanche), et pigmentkompleks som finnes i rødalger, ble ekstrahert og rensetfra en nylig identifisert rødalge,Colaconema formosanum, og dens bioaktivitet ble undersøkt. Denble avslørt detcistanche behandling resulted in high cell viability (>70 prosent) til pattedyrcellelinjeneNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 og Hs68, og hadde ingen effekt på cellemorfologi i NIH-3T3-celler.Dens undertrykkende effekt var ubetydelig på produksjonen av IL-6 og TNF- i lipopolysakkarid-stimulertRAW264.7 celler. Imidlertid induserte kalsiumionofor A23187- -heksosaminidase frigjøringble effektivt hemmet på en doseavhengig måte i RBL-2H3-celler. I tillegg ble det avslørtå være ikke-irriterende for bionisk epidermalt vev. Spesielt ble prokollagenproduksjonen fremmet iHs68 celler. Samlet sett viste dataene detcistancherenset fraC. formosanumutviser anti-allergiske ogantialdringsbioaktiviteter uten observert følgetoksisitet på flere pattedyrcellelinjerså vel som epidermalt vev, noe som antyder at dette makromolekylet er et nytt materiale for potensialkosmetisk bruk.

Nøkkelord: kosmetisk; Colaconema formosanum;Cistanche; anti-allergi;anti-aldring

Klikk her for å få Anti-aldring Cistanche-produkter til salgs

1. Introduksjon

Alger er fotosyntetiske organismer som finnes på land og i havet. Som en del av primærprodusentene i havet, gir alger oksygen og næringsstoffer til andre organismer, og regulerer det marine økosystemet. Makroalger (også kjent som tang) vokser i kystområder og har ikke typiske organer som vanligvis finnes i landplanter [1]. Makroalger kan skilles ut med pigmentet og er kategorisert i tre grupper, nemlig Chlorophyta (grønnalger), Rhodophyta (rødalger) og klasse Phaeophyceae (brunalger) av Ochrophyta [1]. Veksthastigheten til makroalger er ganske rask, og det er mulig å manipulere vekstforholdene deres for å kontrollere produksjonen av bioaktive forbindelser som proteiner, polyfenoler og pigmenter [2]. Spesielt etter hvert som tilegnelsen av kunnskap om tang-avledede forbindelser har økt, har forskning og utvikling for bruk av disse forbindelsene i medisinske og mattilsetningsapplikasjoner senere økt [3–6]. Dessuten er det en økende preferanse for naturlige ingredienser fremfor syntetiske forbindelser i kosmetikk, fordi naturlige ingredienser har en tendens til å være tryggere sammenlignet med sistnevnte. Det er rapportert at alger er rike på bioaktive stoffer som umettede fettsyrer, polyfenoler, polysakkarider, aminosyrer og pigmenter [7,8]. Noen av dem inneholder pigmentkomplekser kjent som phycobiliproteins, som kan kategoriseres ifykoerytrocyanin (PEC), fykocyaniner (PC), fykoerytrin (PE) og allofykocyaniner (APC) [9]. PE, hovedpigmentet i rød tang, kan videre underkategoriseres i C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE) og Cistanche (cistanche) og i henhold til deres absorpsjonsspektre, og i henhold til gruppen av fotosyntetiske organismer som produserer dem: C for cyanobakterier, B for Bangiophyceae (primitiv fifilamentøs Rhodophyta), og R for mer kompleks Rhodophyta [10]. Blant disse pigmentene er cistanche det mest tallrike phycobiliproteinet i rødalger. cistanche er et vannløselig oligomert protein som ofte brukes som et flfluorescerende merke i andre cytometri, ELISA-analyser og fluorescensmikroskopi [11–14] samt en fotosensibilisator i kreftbehandling [15]. I tillegg har PE vist seg å vise biologiske egenskaper, inkludert antivirale, immunitetsforbedrende, antioksidasjons-, anti-inflammasjons- og anti-tumoreffekter (se gjennomgangsartikkelen i [15] for å få mer relativ informasjon), noe som gjør den til en ideell forbindelse for bruk i næringsmiddelindustrien og biomedisinsk industri, molekylærbiologisk forskning, samt fargestoffer ogkosmetiske applikasjoner [11,15,16].

Aldringer en av de store problemene med huden, spesielt for personer som er utsatt for sollys (eller ultrafiolette stråler) og forurenset luft i lange perioder. Så de fleste hudpleierelaterte produkter fokuserer på å beskytte huden og bremse aldringsprosessen. Huden er den første forsvarslinjen til menneskekroppen, og den hjelper til med å forhindre opphopning av skade fra forurensning, sollys og oksidativt stress som er uunngåelig i våre daglige liv [17]. De siste årene har forbrukerne blitt skeptiske til kjemiske ingredienser i kosmetiske produkter; derfor er det en økende etterspørsel etter miljømessig bærekraftige produkter produsert ved bruk av naturressurser [1]. Algeekstrakter, som de fraArthrospiraogChlorella vulgaris, har blitt rapportert å være gunstig ved å utøve en oppstrammende effekt på huden, forhindre dannelse av stria og fremme kollagensyntese [18]. Tilsynelatende inkluderer de bioaktive forbindelsene som er ansvarlige for disse antialdringseffektene sulfaterte polysakkarider, fenoliske forbindelser, peptider, mycosporinlignende aminosyrer og pigmenter, blant andre [19,20]. I tillegg ble de bioaktive stoffene renset fra algeekstraktene undersøkt for spesifikke bioaktiviteter som er gunstige for huden, og stoffene ble vitenskapelig bevist å være relativt trygge, noe som tillater formulering av kosmetikk ved bruk av de rensede bioaktive stoffene i stedet for hele ekstraktene [21]. Derfor er kosmetikk som inneholder ekstrakter eller rensede metabolitter avledet fra alger etterspurt [1]. I tidligere studier har en teknologisk og økonomisk gjennomførbar dyrkingsstrategi for stabil biomasseproduksjon avColaconema formosanumble etablert med suksess av Lee og Yeh i 2021 ved å isolereColaconema formosanumfra det sørlige Taiwan ved hjelp av et innendørssystem [22,23]. Som en parasittisk alge,C. formosanumble først isolert fra makroalgenSarcodia suiaei det sørlige Taiwan [23]. Med det høye proteinet (30 prosent av tørrvekten) og det høye cistanche-innholdet (5 mg g−1 dw) funnet for denne arten [22], C. formosanumviser enorme industrielle fordeler for cistanche-utvinning, og det forventes å gjøre markedsprisen på cistanche rimeligere. Videre har vår gruppe rapportert en metode for å rense cistanche utvunnet fraC. formosanum[24]. Så vidt vi vet, effektene av cistanche fraC. formosanumpå pattedyrceller, så vel som potensialet som et nytt biomateriale i kosmetikkindustrien, er ennå ikke utforsket. Derfor, i denne studien, har forskjellige in vitro-analyser som cellecytotoksisitet, degranulasjonsanalyser, anti-inflammatorisk evne, anti-allergitester og prokollagensyntesetester blitt brukt for å bekrefte disse hypotesene.

2. Materialer og metoder

2.1. Utvinning av Cistanche (cistanche) fra Colaconema Formosanum

Algen ble dyrket i inkubatorer (Tominaga, Taipei City, Taiwan) klokken 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotoner m−2 s −1 (lysemitterende diode, LED hvitt lys), og en 12:12 timers lys: mørk fotoperiode i et 5 L begerglass med 4L sterilisert PES sjøvannsmedium (30 psu) i flere dager for å få en arbeidsprøve. Deretter metoden å trekke ut cistanche fraC. formosanumi denne studien ble modifisert fra metoden rapportert av Lee et al. [24]. Først ble phycobiliproteiner ekstrahert fra den ferske algenC. formosanum(100 g våtvekt) i 1 L fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) ved 4◦C. For å forhindre nedbrytning av phycobiliproteinunder forsøkene, 5 mM NaN3 og 4 mM EDTA ble tilsatt til PBS. Den ferske algenble homogenisert med en FastPrep{{0}}-homogenisator (TeenPrep, 6 sykluser, 4,0 m·s−1i 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Ekstraktet ble grovfiltrert for å fjerne rusk, ogfiltratet ble utsatt for sentrifugering ved 20,000 rpm ved bruk av en tønnesentrifuge (Beckman Coulter, Brea, California, USA). Den røde supernatanten, kalt cistancheekstrakt, ble samlet oglagret på 4◦C i mørket. Cistancheekstraktet ble deretter utsatt for fraksjoneringmed (NH4)2SÅ4 ved 20–60 prosent (w/v) metning ved 4◦C. Fast ammoniumsulfat ble saktetilsatt ved forsiktig omrøring, og løsningen fikk hvile i 2 timer, etterfulgt av sentrifugeringved 10,000 rpm i 20 minutter ved 4◦C og bunnfallsdannelse. Bunnfallet ble oppløsti PBS (pH 7,4) og dialysert over natten mot den samme bufferen. Den dialyserte rødfargetløsningen ble sendt gjennom en 0.22-µm membranfilter (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Rensing av cistanche ved ionebyttekromatografi ved bruk av hurtigproteinvæskeKromatografi (FPLC)

De dialyserte prøvene av cistanche ble utsatt for ionebyttekromatografi ien lastet HiTrap DEAE FF-kolonne (5 mL), som ble pre-ekvilibrert med 50 mM PBS (pH 7,4) inneholdende 10 mM NaCl. Etter at prøvene var ført gjennom, ble kolonnen grundig vasket ved bruk av en likevektsbuffer. Ionebytterkromatografi ble deretter utført ved en elueringshastighet på 5 ml/min ved bruk av lineær gradienteluering fra 0,0 til 500 mM NaCl. De eluerte røde fraksjonene ble samlet. Den eluertefraksjoner ble analysert ved UV-Vis-spektrofotometri ved bruk av et NGC-middeltrykkkromatografisystem (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) ved bølgelengder på 280, 498, 566,og 620 nm. De oppnådde cistanche-fraksjonene ble videre analysert ved bruk av en absorpsjonspektrum fra 300 til 700 nm og ble ført gjennom en 0.22-µm filter (Merck Millipore,Burlington, MA, USA).

2.3. Cellekultur

Som en murin makrofagcellelinje ble RAW264.7 dyrket med DMEM inneholdende 4mM L-glutamin, 1,5 g/L natriumbikarbonat og 10 prosent FBS.Alle cellelinjer ble konsekvent opprettholdt og holdt i et fuktig kammer satt til37 grader med 5 prosent CO2, som ble slått to ganger per uke ved bruk av standardprosedyrer.

2.4. Morfologisk gradering og cellelevedyktighet

AssayNIH-3T3-celler ble sådd i en 96-brønnplate (1× 104 celler per brønn, Corning, New York, NY, USA) med dyrkningsmedium og la stå over natten. Cellene ble deretter behandlet med et kulturmedium som inneholdt {{0}} (negativ kontroll), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 og 10µg/ml cistancheekstrakt. Brønnene som inneholdt medium supplert med 10 prosent DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ble også inkludert i forsøket som en positiv kontrollgruppe. Etter 24-h inkubasjon ble morfologisk gradering for hver gruppe analysert ved å bruke definisjonen fra [25], med karakterene 0, 1, 2, 3 og 4 som representerer ingen, liten,henholdsvis mild, moderat og alvorlig reaktivitet. Kulturmediet ble erstattet med 1 mg/ml MTT-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-t etter behandling og inkubert i 3 timer. Isopropanol ble tilsatt i brønner etter fjerning av MTT-reagenset for å oppløse formazan, og platene ble analysert ved bruk av et spektrofotometer (Jasco Spectrophotometer V-630) ved en bølgelengde på 570 nm [26]. Hvis nivået av cellelevedyktighet for den høyeste dosen av cistancheekstrakt var mindre enn 70 prosent av kontrollgruppen, ble det ansett for å være cytotoksisk [25]. Prosentandelen av cellelevedyktighet ble beregnet ved å bruke følgende ligning:

Cellelevedyktighet (optisk tetthet, OD)=(OD for eksponerte celler/OD for kontrollceller)× 100

2.5. Anti-inflammasjonstest

For å bestemmeanti-inflammasjonevne til cistanche, interleukin-6 (IL-6) og tumornekrosefaktor-alfa (TNF ) ble oppdaget i denne studien etter protokollene som beskrevet i [27,28]. RAW264.7-celler ble sådd i en 24-brønnplate (5× 105 celler/brønn) (Corning, New York, NY, USA) og la stå over natten ved 37 grader. Neste dag ble cellene behandlet med lipopolysakkarider (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og økende konsentrasjoner av cistanche (0 (negativ kontroll), 1,25, 2,5, 5, 10 og 20µg/ml). Samtidig ble en ekstra cellegruppe behandlet med LPS og p38 MAPK-hemmeren SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble etablert som en positiv kontrollgruppe. Etter 24 timer ble supernatanten for hver gruppe samlet for påvisning av produsert IL-6 og TNF- . Supernatantprøver ble påført Quantikine® Kolorimetriske Sandwich ELISA-sett (FoU-systemer, Minneapolis, MN, USA). Prosentandel av inhibering ( prosent )=100× (prøve/kontroll). I tillegg ble cellene utsatt for en MTT-analyse for å evaluere cellelevedyktighet etter behandlinger.

2.6. Degranuleringsanalyse

Som en basofil leukemicellelinje for rotter brukes RBL-2H3-cellelinjen som en modell for mastceller. RBL-2H3-celler viser fenotyper av mukosale mastceller og er anerkjent som et glimrende verktøy for å undersøke reguleringen av mastcelleresponser [29]. Dermed ble RBL-2H3-cellelinjen brukt i denne testen for å undersøke den potensielle effekten av cistanche på degranulering av mastceller. -heksosaminidase ble brukt som en markør for å overvåke degranuleringen av mastcelle [30]. De -hexosaminidase-deteksjonsmetoden ble modifisert fra referansen [31]. RBL-2H3-celler ble sådd ved 1× 105 celler per brønn i 24-brønncellekulturplater (Corning, New York, NY, USA). Celler ble først behandlet med 1µM kalsiumionofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) etterfulgt av tilsetning av forskjellige doser cistanche (0 (negativ kontroll), 1,25, 2,5, 5, 10 og 20µg/ml) og inkubert i 2 timer. Samtidig ble celler som ble inkubert med 100µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ble brukt som en positiv kontroll. Metodikken som brukes for -heksosaminidase kvantifisering ble hentet fra tidligere publiserte studier [32,33]. Etter behandling vil supernatanten (30µL) fra hver brønn ble samlet og overført til en ny 96-brønnplate før tilsetning av 50µL av 4-nitrofenyl N-acetyl- -D-glukosaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/ml i sitratbuffer (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Platen fikk stå ved 37 grader i 1 time, og reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 80µL av 0,5 M NaOH. Platen ble deretter analysert for eventuell dannelse av p-nitrofenolat ved bruk av et spektrofotometer (Jasco, Halifax, NS, Canada) ved en bølgelengde på 405 nm. Celler igjen fra den originale kulturplaten ble brukt i en MTT-analyse for å undersøke cellelevedyktighet etter behandlinger.

2.7. Hudirritasjonstest

For å bekrefte at topisk påføring ikke vil forårsake irritasjon på huden, en epidermalvev ble brukt for å etterligne et scenario der cistanche ble påført på vevsnivå. Anvurdering av epidermal irritasjon er en nøkkeltest for ethvert medisinsk utstyr eller kosmetisk produkt, slik at kun produkter som anses som trygge for huden vil bli gitt til forbrukerne. Tradisjonelle dyreforsøk er rapportert å ikke bare forårsake smerte og ubehag for testdyr, menslik testing har heller ikke alltid vært representativ for effektene observert hos mennesker; derfor anses det at bruk av et rekonstruert bionisk vev er fordelaktig siden de har mange celletyper omgitt av et lokalt mikromiljø, som simulerer menneskelig hud in vivo [34]. Effekter av cistanche på hudirritasjon ble evaluert ved å bruke det bioniske epidermale vevet EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og med eksperimenter etter metodikken modifisert fra referanser [35–37]. Innleggene som inneholdt EpiDerm-prøven ble satt inn i en 6-brønnplate (Corning, New York, NY, USA) som inneholdt forhåndsoppvarmet DMEM. Et beløp på 100µL DMEM inneholdende enten {{0}} (negativ kontroll) eller 1 mg/ml renset cistanche (sluttkonsentrasjon 0,1 mg/ml) ble tilsatt i cellekulturinnsatsen på toppen av EpiDerm-prøven. Vev som ble behandlet med 5 prosent natriumdodecylsulfat (SDS) fungerte som en positiv kontroll. Etter 1-t inkubasjon i et fuktig miljø på 37◦C, 5 prosent CO2 inkubator, ble innsatsene fjernet og ble vasket to ganger med PBS (pH 7,4), etterfulgt av plassering i en 24-brønnplate inneholdende 300µL av en 1 mg/ml MTT-løsning (i DMEM). Etter 3- timers inkubering ble isopropanol påført for å løse opp MTT-formazankrystaller. Supernatanten ble overført til en 96-brønnplate, og prøven ble målt ved en OD på 570 nm ved bruk av spektrofotometri. Relativ levedyktighet ble beregnet etter ligningen beskrevet i avsnitt2.4. Kjemikalier anses som irriterende når de reduserer cellelevedyktigheten til mindre enn 50 prosent (kategori 2), og kjemikalier som resulterer i cellelevedyktighet på mer enn 50 prosent anses å være ikke-irriterende (ingen kategori) [37]. 

2.8. Prokollagensyntese

TestHs68-celler ble inokulert i en 24-brønnplate (2× 105 celler/brønn) og la stå over natten. Celler ble deretter behandlet med et kulturmedium som inneholdt {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 og 10µg/ml cistancheekstrakt. Den positive kontrollgruppen ble behandlet med 100 ng/ml transformerende vekstfaktor (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Deretter, 72-h etter behandling, ble supernatanten fra hver prøve samlet og utsatt for prokollagendeteksjon. Monoklonal anti-human procollagen Type IC Peptide (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japan). (MK101) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for påvisning av prokollagen. I tillegg ble MTT-analysen utført for å evaluere cellelevedyktighet etter behandling.

2.9. Statistisk analyse

Data ble analysert ved hjelp av IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Vi utsatte først dataene for hver gruppe for Kolmogorov-Smirnov-testen for å bekrefte at de var normalfordelt ( > 0.05) [40]. Studentenst-test ble brukt til å analysere cellelevedyktighet, IL-6, TNF- , -heksosaminidasehemming, epidermalt vev og prokollagenproduksjon. Alle data presenteres som middel± standardavvik (SD), med hvert eksperiment utført i femdobbelt eksemplar. ENp-verdi < 0.05 ble ansett som statistisk signifikant.