Rask samtidig bestemmelse av seks effektive komponenter i Cistanche Tubulosa ved nær infrarød spektroskopi

1. Introduksjon

Cistanche (Hoffmg. Et Link) er en flerårig fanerogamisk slekt av Orobanchaceae-familien av planter. De fleste arter som tilhører Cistanche-slekten har vært brukt som medisinplante i årtusener i Kina; har et rykte som en overlegen tonic; og er kjent som "Ginseng of the Deserts". Cistanche tubulosa er en obligatorisk parasitt av røttene til den flerårige planten Tamarix chinensis. Det har blitt dokumentert i den kinesiske farmakopéen som den autentiske kilden tilCistanches Herba(Kinesisk navn: Roucongrong) fra 2005-utgaven. Moderne farmakologisk forskning på Cistanche-arter ble satt i gang på 1980-tallet. Farmakologiske undersøkelser viste at ekstraktene av Cistanche-planter har et bredt spekter av aktiviteter, som å kurere nyremangel og senil forstoppelse, fremme evnen til å lære og huske, anti-Alzheimers sykdom, forbedre immunitet, anti-aldring, anti-fatigue, etc. I løpet av de siste tre tiårene har omfattende og systematiske farmakologiske studier blitt kombinert med fytokjemiske undersøkelser for å belyse det materielle grunnlaget for de gunstige effektene av røttene til Cistanche-planter. Disse undersøkelsene indikerer at fenyletanoidglykosider (PhGs) var de viktigste effektive komponentene i Cistanche-planter som spilte nøkkelroller i behandlingen av nyremangel, impotens, anti-aldring og anti-Alzheimers sykdom. Innholdet av to PhGs (echinacoside og verbascoside) var påkrevd i kinesisk farmakopé. I mellomtiden eier karbohydrater som mannitol, sukrose, glukose og fruktose i Cistanche-planter den lakserende funksjonen og karbohydratklyngene tilCistanche planterhar blitt brukt til behandling av forstoppelse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Villressurser av C. tubulosa er hovedsakelig distribuert i området rundt Taklamakan-ørkenen i den sørlige Xinjiang autonome regionen i Kina. I likhet med mange andre arter som brukes som tradisjonell kinesisk medisin (TCM), er C. tubulosa av stor økonomisk verdi og er nesten utryddet i sitt ville habitat på grunn av overinnsamling. Dyrking av C. tubulosa begynte på 1990-tallet i Kina for å sikre tilgang på råvarer til Cistanches Herba samt beskytte ville planteressurser. Fra og med 2017 eksisterer nesten 13 tusen ha kultivert C. tubulosa i Hotan Prefecture i Xinjiang. Det kreves fremskritt innen planteteknologi for å utvide dyrkingen samt forbedre kvaliteten på C. tubulosa.

Hovedformålet med å dyrke C. tubulosa er å produsere Cistanches Herba, som er rik på de effektive komponentene. Imidlertid er innholdet av de effektive komponentene iCistanches Herba, som PhGs og oligosakkarider, kan påvirkes betydelig av mange faktorer under produksjonen. Et sanntidsdeteksjonssystem for kvaliteten til C. tubulosa bør utforskes. Derfor er det nødvendig å utvikle en høy gjennomstrømningsmetode for å oppfylle kravet om å analysere et stort antall prøver innen en kort periode. Tradisjonelt ble bestemmelsen av de primære effektive komponentene, som PhG og karbohydrater, i C. tubulosa vanligvis oppnådd ved bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC). Selv om den er nøyaktig og pålitelig, er den tidkrevende og arbeidskrevende for datainnsamling og -behandling. I tillegg kreves det også mye tid og krefter for prøvepreparering som vanligvis involverer pulverisering, ekstraksjon og filtrering av HPLC-analyser. Derfor er det nødvendig med et klart prinsipp og lettbetjent verktøy for å få en relativt stor mengde data. Heldigvis har nær-infrarød spektroskopi (NIRS) blitt mye brukt til å vurdere landbruksprodukter, mat, medisinske prøver og farmasøytiske produkter fordi den er rask så vel som ikke-destruktiv. Derfor kunne NIRS nøyaktig matche kravene til effektive målinger av TCM, og, ikke overraskende, har NIRS blitt brukt for kvalitativ identifikasjon og kvantifisering av forbindelser i TCM.

I denne studien er innholdet i seks effektive komponenter, inkludertechinakosid, verbaskosid, mannitol, sukrose, glukose og fruktosei 116 partier av C. tubulosa-prøver som ble samlet inn fra Hotan Prefecture i Xinjiang i 2013–2015, ble først bestemt ved HPLC. Etterpå ble kalibreringsmodellene for disse seks komponentene etablert med metoden med partiell minste kvadraters regresjon (PLSR). Disse modellene ble deretter validert med korrelasjonskoeffisientene og prediksjonsfeilene i kalibreringssettene. Resultatene viste at den utviklede metoden kunne brukes som en pålitelig metode for kvantitativ analyse av C. tubulosa.

2. Resultater

2.1. HPLC-analyse

Innholdet iechinacoside og verbascosideble bestemt ved en veldefinert HPLC-UV-metode i litteraturen og fire karbohydrater (mannitol, sukrose, glukose og fruktose) ble bestemt ved en veldefinert HPLC-ELSD-metode i litteraturen for alle de 116 prøvene. Prøveforberedelse og -bestemmelsesmetoder ble beskrevet i avsnitt 3.1 og 3.3. Figur 1 viser de karakteristiske kromatogrammene til de blandede standardene. Det kan sees at alle seks effektive komponentene var baseline-separert og derfor kunne kvantifiseres. HPLC-metoden ble validert før prøvetestingen. Hovedresultatene for HPLC-metoden er oppført i tabell 1. En gunstig lineær relasjon (r=0.9998) og gjenvinning (98.5%) av metoden for echinacoside-bestemmelse er vist i resultatene, samme resultat som alle fem komponenter. Derfor kan innholdet i de seks effektive komponentene bestemmes nøyaktig. Alle bestemte innholdsområder er oppsummert i tabell 1.

2.2. NIRS Analyse

Figur 2 viser NIR-spektra (4000–10,000 cm−1 ) til C. tubulosa-prøvene. Signifikante absorpsjonstopper dukket opp fra 4000 cm−1 til 7500 cm−1 i alle prøver, mens milde svingninger dukket opp fra 7500 cm−1 til 10.000 cm−1. Grunnlinjedrift av NIR-spektrene skjedde fordi prøven lett ble påvirket av faktorer som partikkelstørrelse og farge (figur 2A). Matematiske forbehandlinger av spektrene ble brukt for å redusere påvirkningen av unødvendig informasjon til en viss grad. De matematiske forbehandlingene inkluderte første avledning (1. avledning), andre avledning (2. avledning), standard normal variasjon (SNV) og multiplikativ spredningskorreksjon (MSC). Figur 2B viser den andre utledningen av NIR-spektrene til C. tubulosa, og de signifikante variasjonene som skjedde fra tre regioner, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 og 7000–7500 cm−1, er observert.

2.3. Etablering av kvantitative kalibreringsmodeller

Partiell minste kvadraters regresjon (PLSR) er en klassisk modelleringsmetode og den har blitt mye brukt i kvantitative modeller på grunn av den høye kvaliteten på resultatene. Fordelene med PLSR inkluderer dens gode prognoseevne og relative enkelhet. PLSR har også blitt mye brukt i etableringen av kvantitative kalibreringsmodeller av TCM [25]. Basert på de forbehandlede NIR-spektrene ble det etablert en kvantitativ NIR-analysemodell for de seks effektive komponentene i C. tubulosa ved bruk av PLSR-metoden med HPLC-analysedata som sanne verdier. De 116 prøvene ble tilfeldig delt inn i kalibrerings- og valideringssett med et 3:1-forhold. De mest passende betingelsene for kalibreringen ble valgt med lav RMSEC og høy korrelasjonskoeffisient.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Valg av bølgebånd for kalibreringsmodellene

Valget av et passende bølgebånd var et viktig skritt for bygging av kalibreringsmodeller. I denne studien ble NIR-intervallspektrene på 4000–7500 cm−1 (anbefalt av TQ-analytikerprogramvare) og 4000–10 000 cm−1 sammenlignet. Det ble observert at dette området er uegnet for kalibrering i intervallet mellom 4000 cm−1 og 7500 cm−1 fra tabell 2. Derfor ble spektralintervallene for de seks kjemiske komponentene i denne studien alle valgt fra intervallet fra 4000 til 10 000 cm−1 ved å sammenligne ytelsen til RMSEC og korrelasjonskoeffisient.

2.3.2. Valg av det optimale antallet faktorer for kalibreringsmodellene

PLSR forklarer den maksimale mengden variasjon i dataene ved å redusere dimensjonaliteten til spektradataene ved å beregne faktorer. Problemet med "underfittedness" dukket opp på grunn av utilstrekkelig informasjon som et resultat av et begrenset antall faktorer; Men å velge faktorene som er større enn de optimale verdiene som er introdusert i modellen vil forårsake "overfittedness"-problemet. Enten "underfittedness" eller "overfittedness" vil redusere prediksjonskraften til de etablerte modellene [22]. Figur 3 viser forholdet mellom RMSECV og faktorer for alle seks forbindelsene. Derfor valgte vi de faktorene som tilsvarer de laveste verdiene av RMSECV. Det optimale utvalget av faktorer for kalibreringsmodellene er oppført i tabell 3.

2.3.3. Valg av spektral forbehandling for kalibreringsmodellene

En annen kritisk innflytelsesrik faktor for kalibreringsmodeller er spektral forbehandling som er rettet mot å redusere påvirkningen av spredning og grunnlinjedrift, forbedre signal-til-støy-forhold og fjerne uregelmessige variasjoner. Multiplikativ spredningskorreksjon (MSC) og standard normalvariatmetoder (SNV) ble brukt for å eliminere påvirkningen av strålingsspredning. For å løse effekten av baseline-drift, ble 1. og 2. derivatspektra sammenlignet og 2. derivativ ble valgt. For den ønskede effekten jevnet vi ut spektrene med Savitzky–Golay (SG) filteralgoritmen før derivering for å forhindre støyforstørrelse. Tabell 3 viser informasjonen om spektral forbehandling og dens resultater for kalibreringsmodellene.

2.4. Evaluering av de etablerte modellene

En god NIRS-kalibreringsmodell bør ha lave RMSEC- og RMSEP-verdier, samt høy korrelasjonskoeffisient (r) og små forskjeller mellom RMSEC og RMSEP. Kalibreringsmodellene for de seks utvalgte forbindelsene ble etablert i henhold til prosedyrene nevnt ovenfor (tabell 3). RMSEC- og r-verdiene for kalibreringssettet av echinacoside var henholdsvis 27,6 og 0.9808. Ytelsesparametrene til andre kjemiske forbindelsesmodeller er oppført i tabell 3, hvorfra vi kan konkludere med at de etablerte modellene fremkommer tilfredsstillende prediksjonsresultater, og kan brukes til rask kvantitativ analyse av C. tubulosa. Spredningsplott av de seks kjemiske forbindelsene er vist i figur 4 for å gjøre kalibreringsmodellene mer beskrivende og observert visuelt. Som vist i figur 4, oppsto mindre forskjeller mellom de prediktive og målte verdiene, fordi de fleste prikkene ble fordelt rundt den regressive kurven med en ligning som y=x. Derfor ble utmerkede prediktive ytelser observert i figur 4.

3. Materialer og metoder

3.1. Prøveforberedelse

Ett hundre og seksten C. tubulosa-prøver ble samlet inn fra Hotan Prefecture i Xinjiang autonome region fra 2013 til 2015. Alle prøvene ble dyrket, men de ble samlet inn i forskjellige vekststadier. Den ferske vekten av prøvene varierte fra 20 g til 1000 g. Etter soltørking ble de tørkede prøvene knust og siktet gjennom en 60-nettsikt.

3.2. NIR Spektroskopisk datainnsamling

NIR-spektrene til prøvene ble samlet med et 8 cm−1 intervall over spektralområdet på 4000–10 000 cm−1 med et Antaris MXFT-NIR System (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) utstyrt med en håndholdt optisk fiberreflektansadapter. Hvert spektrum ble oppnådd ved gjennomsnittlig 64 skanninger. Alle prøvene fikk ekvilibrere til romtemperatur (25 ◦C) før NIR-spektraskanning for å sikre at prøvene ble analysert ved samme temperatur. Fuktigheten i laboratoriet ble holdt på et omgivelsesnivå.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV NYREFUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC-datainnsamling

3.3.1. Ekstraksjonsforberedelse

Ett gram C. tubulosa-pulver ble ekstrahert med 50 ml 50 % metanol i en konisk kolbe med ultralydbehandling (500 W, 40 KHz) i 30 minutter. Ekstraktet ble lagret ved 4 ◦C. Supernatanten av ekstraktet ble filtrert for å oppnå en prøve for HPLC-analyse.

3.3.2. Samtidig bestemmelse av Echinacoside og Verbascoside med HPLC-UV

Væskekromatografisk analyse ble utført på et Shimadzu UHPLC-system (Shimadzu, Kyoto, Japan) bestående av to LC-20ADXR løsningsmiddelleveringsenheter, en LC-20AD-pumpe, en SIL-20ACXR auto prøvetaker, en CTO-20AC-kolonneovn, en SPD-M20A DAD-detektor, DGU-20A3R-avgasser og en CBM-20A-kontroller.

En Grace Prevail Carbohydrate ES-kolonne (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) brukt for de kromatografiske separasjonene ble holdt ved 35 ◦C. Den mobile fasen besto av acetonitril (A) og 0,1 % vandig maursyre (B) og ble levert etter gradientprogrammet som følger: 0–7 min, lineær gradient på 10–20 % EN; 7–15 min, 20 % A; og 15–20 min, lineær gradient på 20–10 % A. Strømningshastigheten til den mobile fasen var 0,4 ml/min. UV-overvåking ble utført ved 330 nm.

3.3.3. Samtidig bestemmelse av mannitol, sukrose, glukose og fruktose med HPLC-ELSD

HPLC ble utført på et Agilent 1100-serien LC-system (Palo Alto, CA, USA) bestående av en G1322A avgasser, en G1311A kvartær pumpe, en G1311A autosampler, en G1316A kolonnetemperaturkontroller og en G1315B DAD detektor.

En Sigma Prevail Carbohydrate ES-kolonne (4,6 × 25 0 mm, 5 µm) ble brukt for kromatografiske separasjoner og holdt ved en kolonnetemperatur på 25 ◦C. Den mobile fasen var sammensatt av acetonitril og vann (77:23, v/v) og isokratisk alliert tilført med en strømningshastighet på 0,7 ml/min. Avløpet ble overvåket ved bruk av en fordampningslysspredningsdetektor (ELSD) med standardparametere.

3.4. Databehandling

TQ Analyst (versjon 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) ble brukt til å utføre delingen av kalibrerings- og valideringssettene, matematisk forbehandling av spektrene, etableringen av kalibreringsmodellene og andre beregninger . Origin (versjon 9.1) ble brukt til å lage figurene.

4. Konklusjoner

I denne studien foreslo vi en rask og ikke-destruktiv metode for samtidig analyse avechinakosid, verbaskosid, mannitol, sukrose, glukose og fruktoseiC. tubulosaav NIRS. Analyser av RMSEC, korrelasjonskoeffisient, RMSEP og Rp-verdier viste at de etablerte kvantitative NIR-modellene kunne brukes til nøyaktig å forutsi innholdet i de seks utvalgte effektive komponentene iC. tubulosa. Sammenlignet med HPLC kan NIRS-metoden rapportert i denne studien spare betydelig arbeidskraft og tid, samtidig som tilfredsstillende kvantitativ analyseevne opprettholdes. Derfor har metoden som er rapportert her potensial til å bli brukt i kvalitetskontrollen avC. tubulosaog dermed å veilede utviklingen av dyrking og prosessteknologi forC. tubulosa.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%