Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian‐feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche har en anti-aldringseffekt

Abstrakt

Bakgrunn: Den tidsrelaterte nedgangen i regenerativ kapasitet og organhomeostase er et hovedtrekk vedaldring. Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus har blitt brukt som tradisjonelle kinesiske urtemedisiner for økt immunitet og forlenget levetid. Mekanismen som denne urtemedisinen bremser aldring er imidlertid ukjent. I denne studien undersøkte vi mekanismen til urtenanti-aldringseffekt.

Metoder: Mus ble matet dietter supplert med R. glutinosa eller A. membranaceus i 10 måneder; kontrollgruppen ble matet med en standard diett. Fenotypene ble evaluert ved hjelp av et graderingsscoresystem og overlevelsesanalyse. Prosentandelen av senescensfenotypene til hematopoietiske stamceller (HSCs) ble bestemt ved fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse. Funksjonen og mekanismen til HSC-er ble analysert ved klonogen analyse og sanntids polymerasekjedereaksjon.

Resultater: Theanti-aldringseffektav R. glutinosa skyldes den forbedrede funksjonen til HSC-er. Mus matet med R. glutinosa viste karakteristikker av en bremsetaldringprosess, inkludert redusert senescens og økt overlevelsesrate. Flowcytometrianalyse viste redusert antall Lin-Sca1 pluss c-kit- (LSK)-celler, langtids-HSC-er (LT-HSC-er) og kortsiktige HSC-er (ST-HSC-er) i R. glutinosa-gruppen. In vitro viste klonogene analyser økt selvfornyelsesevne av LT-HSC-er fra R. glutinosa-gruppen samt opprettholdelse av LSK-ro gjennom oppregulert p18-ekspresjon. R. glutinosa-gruppen viste også reduserte nivåer av reaktive oksygenarter og prosentandelen av -gal pluss-celler gjennom nedregulering av det cellulære senescensassosierte proteinet p53 og p16.

Konklusjon: Rehmannia glutinosa treneranti-aldringeffekter ved å opprettholde roen og redusere senescensen til HSC-er.

NØKKELORD: anti-aldring, hematopoietiske stamceller, hvile, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUKSJON

Aldring er definert som den tidsavhengige funksjonsnedgangen som påvirker de fleste levende organismer.1 Levetiden til organismer opprettholdes hovedsakelig av stamceller.2 Vevsspesifikke stamceller har kapasitet til selvfornyelse og differensierer til en rekke effektorceller. 3 Under aldringsprosessen avtar imidlertid denne selvfornyelseskapasiteten, noe som til slutt fører til akkumulering av ureparert, skadet vev i aldrende organismer.4 Tap av evnen til å opprettholde en balanse mellom hvile og differensiering i stam-/stamceller. kompartment kan resultere i død eller aldersassosierte sykdommer.2 Videre tyder nyere studier på at stamcelleforyngelse kan reversere aldringsfenotypen.5,6 I det hematopoietiske systemet er hematopoietiske stamceller (HSCs) ansvarlige for blodcelleproduksjonen. Hos gamle mus viser det hematopoietiske systemet svekkelse av T- og B-lymfoidceller, og antallet myeloide celler øker. Eldre HSCs viste redusert selvfornyelsesaktivitet og redusert hematopoiesis rekonstruksjonsevne. Spesielt er aldersrelaterte endringer i HSC-avdelingen manifestert i den aldrende verten som anemi, økt tilbøyelighet til myeloproliferative neoplasmer, nedsatt immunfunksjon og økt kreftforekomst.7-9 Imidlertid er mekanismen for HSC-aldring og effekten av urtemedisiner på HSC-aldring er ukjent.10

Folk har vært opptatt av å forsinke aldringsprosessen og holde seg ung fra eldgamle tider oganti-aldringer et nåværende forskningsfokus. Tradisjonell kinesisk medisin har fått økende oppmerksomhet for behandling av ulike aldringsassosierte sykdommer. Mange urter brukt i tradisjonell kinesisk medisin er kjent for å gi positive effekter mot aldring gjennom forskjellige mekanismer. Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus har vært mye brukt på denne måten i tusenvis av år.

Rehmannia glutinosa brukes til å behandle ulike diabetiske lidelser, forbedre benmetabolismen ved osteoporose og hemme leverbetennelse og fibrose. I tillegg har denne urten andre effekter, inkludertmot tretthet, antidepressive og nevrobeskyttende egenskaper. I de siste årene har farmakologiske studier av R. glutinosa og dens aktive komponenter hovedsakelig fokusert på dens brede virkninger på blodet, endokrine, kardiovaskulære og nervesystemer.11-14 R. glutinosa ble derfor vist å ha sterk immunforsvar. ‐forbedringsaktivitet, som har gitt det teoretiske grunnlaget for videre studier.

Astragalus membranaceus har styrkende, hepatobeskyttende, vanndrivende og slimløsende egenskaper15 og har vist seg å utvise immunmodulerende,16anti-inflammatorisk,ogantioksidanteffekter.17 Belysningen av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for effektene av tradisjonelle kinesiske medisiner i klinisk praksis er et nøkkelsteg mot deres verdensomspennende anvendelse, og dette emnet er for tiden et emne av intens forskningsinteresse.

I denne studien matet vi derfor mus dietter supplert med R. glutinosa og A. membranaceus i 10 måneder for å utforske mekanismen som ligger til grunn for R. glutinosas evne til å øke levetiden.

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Dyregruppering og behandling

C57BL/6J hunnmus ble holdt i et patogenfritt miljø og matet med en standard diett. Bruken av dyr i denne studien ble godkjent av Animal Care and Use Committees ved Institute of Laboratory Animal Science ved Peking Union Medical College. Musene (10 måneder) ble tilfeldig delt inn i tre grupper (n=20/gruppe). Kontrollgruppen ble matet med en standard diett (Beijing HFK Biosicence, Beijing, Kina). Diettene til de to andre gruppene ble supplert med henholdsvis malt R. glutinosa og A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang kinesisk medisin, Beijing, Kina), i en dose på 200 mg/d i 10 måneder. Denne dosen ble valgt ved bruk av normaliseringsmetoden for kroppsoverflateareal for å bekrefte medikamentdosene fra studier på mennesker til musestudier. Kroppsvekten ble bestemt hver 2. måned og overlevelse ble registrert daglig.

2.2|Evaluering av graden av alderdom

Et karakterpoengsystem ble tatt i bruk for å evaluere graden av alderdom i henhold til kriterier definert av Takeda et al.18 Hver kategori oppført i protokollen ble valgt fra de kliniske tegnene assosiert med aldringsprosessen. Hver mus ble skåret ved 18 måneders alder, og poengsummen i hver kategori ble summert for å bestemme den samlede karakterskåren.

2.3|Flowcytometri

Celler ble høstet fra thymus, milt, perifert blod (PB) og benmarg (BM). Milten og thymus ble skåret ut umiddelbart, vasket med saltvann og veid. Milt og thymus ble forsiktig homogenisert i en glasshomogenisator og cellene ble suspendert i sterilt fosfatbufret saltvann (PBS). Cellene fra PB ble brukt til lysering av røde blodlegemer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cellene fra BM ble isolert ved å skylle både tibias og femur med steril PBS. Alle cellene ble isolert ved filtrering over et sterilt nylonnett og farget i 30 minutter ved 4 grader med følgende fluoroforkonjugerte antistoffer: fykoerytrin (PE)-konjugert anti-CD3 (G4.18), allofykocyanin (APC)-konjugert antistoffer. - CD4 (OX35) og PE-Cy7-konjugert anti-CD8a (OX8). For BM-cellene ble avstamningsmarkører farget ved bruk av biotin-konjugert anti-mus CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER-119) og Gr1 (RB6-8C5), etterfulgt av farging med antistoffet APC-eFluor 780-konjugert streptavidin ble også hentet fra eBioscience (San Diego, CA, USA). Følgende antistoffer ble brukt for overflatefarging: APC immunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein isothiocyanat (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca- 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) og PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Alle antistoffer ble hentet fra eBiosciences (San Diego, CA, USA). Data ble innhentet av en FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) og analysert ved hjelp av FlowJo-programvare (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Cellesyklusanalyse

For cellesyklusanalyse ble totale BM-celler farget for stamcelleoverflatemarkører (Lin–Sca‐ 1 plus c‐ KitHigh; LSTKs), deretter fiksert og permeabilisert (00–5123–43; Becton Dickinson ) før farging med FITC Ki‐

67 antistoff og 7-aminoactinomycin D (7-AAD). Datainnsamling ble utført på FACS Aria II (Becton Dickinson). Data ble analysert ved hjelp av FlowJo-programvaren.

2,5|Alderdomsassosiert galfarging

Senescensassosiert (SA) -gal aktivitet ble også analysert ved hjelp av flowcytometri ved bruk av C12FDG som beskrevet av produsenten (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt ble stamceller først farget for celleoverflatemarkører og deretter inkubert med 100 nmol L-1 bafilomycin A1 i 1 time ved 37 grader for å indusere lysosomal alkalinisering. Etter vask med PBS ble cellene inkubert med en 2 mmol L−1 C12FDG i 1–2 timer ved 37 grader og deretter analysert ved bruk av en FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Bestemmelse av produksjon av reaktive oksygenarter (ROS).

Celler ble inkubert med diklor-dihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Kina) ved 37 grader i 20 minutter. DCFH-DA diffunderer passivt inn i cellene, hvor det deacetyleres av esteraser for å danne ikke-fluorescerende 2′,7'-diklorfluorescein (DCFH). Mengden fluorescens som sendes ut korrelerer med mengden ROS i cellen. Data ble innhentet på en FACS Aria I (Becton Dickinson) og analysert ved bruk av FlowJo-programvare.

2.7|Sanntidsanalyse av polymerasekjedereaksjon (PCR).

Totalt RNA ble ekstrahert fra celler ved bruk av TRIzol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Gener av interesse ble amplifisert fra DNase I-behandlet total RNA ved bruk av M- MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA)

og poly-dT primere. Primerne som ble brukt for PCR var som følger: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ og 5′‐CGAAGAGACAACGG- CACACT‐3′, Tm=60 grad, 30 sykluser), p53 (5′‐CATGATACCGTC-GACC-GACC 3′ og 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grad , 35 sykluser), p16 (5′‐CGAACTCTTTTCGGTCGTACCC‐3′ og 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC-3′1, Tm 3′1, T3,3} grad sykluser), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ og 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grad , 30 sykluser), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 53′‐ TTCTCTTGGT‐ 53′‐ TTCTTCTGGT‐ 53″ ′, Tm=61 grad , 35 sykluser), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ og 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grad , 30 sykluser), glyceraldehyd 3‐ dehydrogenase (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ og 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 grad, 25 sykluser). Sanntids (RT)- PCR ble utført ved bruk av SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japan) på ABI StepOne™-deteksjonssystemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2.8|Klonogene analyser

Langtids (LT)- HSC-er ble sortert ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og deretter dyrket i 96-brønners celleplater ved bruk av et metylcellulose-basemedium (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . Ti replikatbrønner ble forberedt for hver prøve. Vi brukte 96-brønners cellekulturplate, tre celler per brønn. To uker etter plettering ble antall og størrelser på kolonier talt under et mikroskop.

2.9|Statistisk analyse

Data ble analysert med enveis ANOVA ved bruk av Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) og GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. P < 0.05="" ble="" ansett="" for="" å="" indikere="" statistisk="">

3|RESULTATER

3.1|R. glutinosa og A. membranaceus utøvde antialdringseffekter

For å bekrefteanti-aldringseffekterav R. glutinosa og A. membranaceus, undersøkte vi effekten av administrering som kosttilskudd (200 mg/d). Deretter registrerte vi kroppsvekt, aldersgrad og overlevelsesrate for mus. Kroppsvekten til mus som fôret med R. glutinosa eller A. membranaceus var normal sammenlignet med de i kontrollgruppen, selv om det var en nedgang i kroppsvekten til R. glutinosa- og A. membranaceus-gruppen etter 20 måneder (Figur 1A). Analyse av graden av alderdom avslørte en jevn og irreversibel økning i graderingsskåren med økende alder i gruppene R. glutinosa og A. membranaceus sammenlignet med den i kontrollgruppen, selv om økningen var mer markert i A. membranaceus. gruppe (Figur 1B). Den høye graderingsskåren skyldtes en tidligere inntreden av tap av passivitet og reaktivitet, tap av hudglans og økt grovhet, hårtap, perioftalmiske lesjoner, økt lordokyphose i ryggraden og en mer markert økning i alvorlighetsgraden.18 Mus i A membranaceus musegruppen viste mer markerte senescens-fenotypeegenskaper, inkludert tap av hudglans og hårtap. Overlevelseskurvene viste at levetiden til mus i gruppene R. glutinosa og A. membranaceus var litt lengre enn i kontrollgruppen (Figur 1C). Disse dataene bekreftetanti-aldringseffekterav både R. glutinosa og A. membranaceus, selv om R. glutinosa ble funnet å være mer effektiv til å bremse aldringsprosessen.

FIGUR 1 Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus haddeanti-aldringseffekter. Mus ble matet dietter supplert med malt R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d); kontrollgruppen ble matet med en standard diett. A, Endringer i kroppsvekt til mus målt hver 2. måned. B, Endringer i aldersgraderingen til mus med alderen. C, Overlevelseskurver. Data representerer gjennomsnittet ± SD; n=20 mus/gruppe. Data representerer gjennomsnittet ± SD; n=5 mus/gruppe.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa reduserte antallet hematopoietiske stamceller

Stamcelleutmattelse antas å være den integrerende konsekvensen av flere typer aldringsassosierte skader og en av hovedårsakene til aldring av vev og organismer.1 Nyere studier tyder på at stamcelleforyngelse kan reversere aldringsfenotypen på organismenivå.5 hypotesen atanti-aldringseffekterav R. glutinosa formidles ved å forbedre stamcellefunksjonen. Derfor utførte vi flowcytometrisk analyse av antall hematopoetiske stam-/stamceller isolert fra mus (i alderen 20 måneder) matet dietter supplert med R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (Figur 2A) . Prosentandelen av LSK-er ble redusert i gruppene R. glutinosa og A. membranaceus (figur 2B). Antallet LT- og kortsiktige (ST)- HSC-er ble redusert med omtrent det dobbelte i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrollgruppen (Figur 2C-D). Større antall vanlige lymfoide stamceller (CLP) ble påvist i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrollgruppen (Figur 2I). Det var ingen forskjeller i antall multipotente stamceller (MPP), vanlige myeloide stamceller (CMP), granulocytt-makrofage stamceller (GMP) og megakaryocytt-erytroide stamceller (MEP) i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrollgruppe. I A. membranaceus-gruppen var det ingen signifikant forskjell i antall LT- og ST-HSC sammenlignet med tallene i kontrollgruppen (Figur 2C-D). Videre var det ingen forskjell i antall MPP-, CMP-, MEP- og CLP-celler sammenlignet med tallene i kontrollgruppen (Figur 2E, 2F, 2H og 2I); Imidlertid ble antallet GMP-er redusert i A. membranaceus-gruppen. Mus matet dietter supplert med R. glutinosa viste således redusert antall hematopoetiske stam- og stamceller.

3.3|R. glutinosa forbedret funksjonen og opprettholdt hvilen til HSC-er

For å evaluere funksjonen til HSC-er, ble det klonogene potensialet til LT-HSC-er undersøkt in vitro. Vi sorterte LT-HSCs-celler i et metylcellulose-basemedium ved å bruke FACS og telte antall og størrelse på kolonier etter 14 dager. Sammenlignet med antall og størrelse på kolonier produsert av celler fra mus i kontrollgruppen, viste celler fra mus i R. glutinosa-gruppen en økning i antall kolonier, spesielt for den lille størrelsen (P=0.0241 ) og stor størrelse klon (P=0.0418), mens det ikke var noen forskjell i antall fra mus i A. membranaceus-gruppen (Figur 3). Den økte kolonistørrelsen og antallet i R. glutinosa-gruppen antydet at denne urten forbedrer selvfornyelsespotensialet til LT-HSCs.

De fleste HSC-er hos voksne mus forblir i ro;19 derfor er opprettholdelse av cellulær hvile en essensiell mekanisme for selvfornyelse av stamceller.20,21 De observerte reduksjonene i HSC-er tyder på redusert celleproliferasjon i R. glutinosa og A. membranaceus-grupper; derfor undersøkte vi cellesyklusstatusen til HSC-er gjennom analyse av den proliferative cellemarkøren Ki-67 kombinert med bestemmelse av DNA-innholdet 7-AAD i LSK-populasjonen. Vi observerte et økt antall LSK-celler i G0-fasen i gruppene R. glutinosa og A. membranaceus sammenlignet med det i kontrollgruppen (Figur 4A). Disse resultatene indikerte at R. glutinosa og A. membranaceus opprettholdt hvilen til HSC-er.

Sanntids-PCR-analyse av cellesyklusregulatorer i LSK-celler avslørte at p18, p19 og p57 spilte kritiske roller i opprettholdelsen av HSC-hvilen.22-24 Det var ingen åpenbare endringer observert for p57 og p19 (Figur 4C-) D), og p18 ble oppregulert i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med den i kontrollgruppen, og litt oppregulert i A. membranaceus-gruppen (Figur 4B).

FIGUR 2 Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus påvirket antallet hematopoietiske stamceller/stamceller. Mus (i alderen

20 måneder) ble matet dietter supplert med R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n=5/gruppe); kontrollgruppen ble matet med en standard diett. Nyisolerte benmargsceller (BM) ble farget med de angitte antistoffene og analysert ved flowcytometri. A, Representative fargingsprofiler av BM hematopoietiske stamceller og stamceller. B, Prosentandelen av Lin-Sca1 pluss c-kit-celler (LSKs) i BM-celler. C-I, Celletall på (C) langsiktig (LT; Lin–, Sca‐ 1 pluss , c‐ Kit , CD34 pluss – , Flt3–); D, kortsiktig (ST; Lin–, Sca‐ 1 pluss , c‐ Kit , CD34 pluss pluss , Flt3–); E, multipotent progenitor (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, vanlig myeloid progenitor (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32–); G, granulocytt-makrofage stamfader (GMP; Lin-, Sca-1-, c-Kit-, CD34 pluss, CD16/CD32 pluss); H, megakaryocytt-erytroid stamfader (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); og I, vanlig lymfoid stamfader (CLP; Lin– ​​, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 pluss ). Data representerer gjennomsnittet ± SD; n=5 mus/gruppe. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa forsinket HSCs senescens

Langsiktig kosttilskudd med R. glutinosa kan forlenge levetiden til mus. Cellulær alderdom øker med alderen; derfor undersøkte vi HSC senescens i aldrende mus ved flowcytometrisk analyse av SA‐ ‐gal-fargede HSCs ved bruk av et fluorescerende ‐gal-substrat (C12FDG).25 Prosentandelen av SA‐ ‐gal‐positive celler ble redusert i R. glutinosa-gruppen, noe som indikerer at R. glutinosa forsinker LSK-celle-senescens (figur 5A).

Reaktive oksygenarter spiller en viktig rolle i HSC-senescens, og tap av HSC-ro er ofte korrelert med økt cellulær ROS.26 Analyse av den intracellulære ROS i LSK-er viste at nivåene ble redusert i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med de i kontrollen gruppe (figur 5B). Disse dataene indikerte at R. glutinosa kan opprettholde HSC-ro og forbedre HSC-funksjonen ved å redusere ROS-nivåer.

Vi undersøkte deretter uttrykket flere gener involvert i cellulær senescens ved RT-PCR-analyse av LSK-celler. Sammenlignet

FIGUR 3 Funksjon av hematopoietiske stamceller forbedret ved kosttilskudd av Rehmannia glutinosa. In vitro klonogent potensiale av langsiktige hepatiske stellatceller fra mus (n=3)

med kontrollgruppen ble uttrykket av cellulære senescensassosierte proteiner p53 og p16 nedregulert i R. glutinosa-gruppen (Figur 5D-E). Men uttrykket av p53 og p16 ble ikke signifikant nedregulert mellom A. membranaceus-gruppen og kontrollgruppen (Figur 5D‐E). Til sammen viser disse dataene at flere nøkkelcellesyklus- og cellealder-relaterte gener regulerer funksjonen til HSC-er i mus matet dietter supplert med R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa forbedret B-celle immunitet

B- og T-lymfocytter er begge viktige for immunologiske responser. T-lymfocytter spiller en kritisk rolle i den cellulære immuniteten og dens regulering, mens B-lymfocytter hovedsakelig deltar i humoral immunitet. Lymfocyttproliferasjon er den mest umiddelbare indeksen som reflekterer organisk immunitet. For å undersøke rollen i immunologisk forbedring, ble effekten av R. glutinosa og A. membranaceus på lymfocyttproliferasjon undersøkt.

Mus i R. glutinosa-gruppen viste redusert antall HSC-er og økt antall CLP-er. Flowcytometrisk analyse viste økt antall modne B-celler (B220 pluss) i PB, BM og milt hos mus i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med tallene som ble oppdaget i kontrollgruppen (Figur 6A); Det var imidlertid ingen signifikante forskjeller i antall T-celler (CD4 pluss og CD8 pluss), monocytter og granulocytter (CD11b pluss) mellom de to gruppene (Figur 6B-D). Dermed indikerer disse resultatene at R. glutinosa i kosten forsterker B-celleimmunitet.

FIGUR 4 Kosttilskudd av Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus opprettholdt roen til hematopoietiske stamceller. A, Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen. Flowcytometrisk analyse av 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og Ki-67-farging av Lin-Sca1 pluss c-kit-celler (LSKs). B, Real-time polymerase kjedereaksjon analyse av sortert LSK celle genuttrykk; GAPDH ble brukt for normalisering. Data representerer gjennomsnittet ± SD av tre eksperimenter. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

FIGUR 5 Kosttilskudd av Rehmannia glutinosa reduserte senescensen av hepatic stellate cell (HSC). Mus (i alderen 20 måneder) fikk dietter supplert med Rehmannia glutinosa eller Astragalus membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n {{4 }}/gruppe); kontrollgruppen ble matet med en standard diett. A, Flowcytometrisk analyse av SA- -gal-positive celler Lin-Sca1 pluss c-kit- (LSK) ved bruk av et fluorescerende -galaktosidasesubstrat (C12FDG). B, Prosentandelen av reaktive oksygenarter (ROS) -positive celler i LSK-er. Flowcytometrisk analyse av ROS-positive LSK-er. Data representerer gjennomsnitt ± standardavvik (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" uttrykksmønsteret="" til="" cellulære="" senescensassosierte="" gener="" i="" lsk-er;="" gapdh="" ble="" brukt="" for="" normalisering.="" data="" representerer="" gjennomsnittet="" ±="" sd="" av="" tre="" eksperimenter.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISKUSJON

I denne studien undersøkte vi mekanismen tilanti-aldringseffekterav R. glutinosa eller A. membranaceus ved å supplere dietten til mus med urter i en dose på 200 mg/d i 10 måneder. R. glutinosa ble funnet å vise anti-aldringseffekter, inkludert redusert alderdom og økt overlevelse av HSCs samt

forbedret B-celle immunitet. Når det gjelder mekanismen tilanti-aldringseffekter, fant vi at R. glutinosa reduserte antallet HSC-er, mens spredningskapasiteten ble økt. Videre opprettholdt R. glutinosa HSC-ro og reduserte antallet SA- -gal-positive celler og ROS-nivåer gjennom regulering av p18, p53 og p16. I kombinasjon bekreftet resultatene våre atanti-aldringseffekterav R. glutinosa hos mus blir medisinert ved å opprettholde roen og forbedre funksjonen til HSC-er.

Rehmannia glutinosa, som har blitt brukt som tradisjonell kinesisk urtemedisin i tusenvis av år, kan brukes til å behandle hypoglykemi ved ulike diabetiske lidelser.27,28 Det er også rapportert at R. glutinosa-ekstrakt forbedrer benmetabolismen.29 Videre, R. glutinosa hemmer inflammatoriske responser og syndromer,30,31 og beskytter mot celleskade ved å rense frie radikaler.14,32 I denne studien fant vi at kosttilskudd av mus med R. glutinosa utøvdeanti-aldringseffekterog forbedret B-celle-immunitet ved å øke proliferasjonskapasiteten til LT-HSC-er og redusere antallet SA--gal-positive celler og ROS-nivåer.

Graden av oksidativ skade har vist seg å øke med alderen i en rekke celler og vev. Oksidativt stress er en kritisk determinant for HSC-selvfornyelse. Tap av LT-HSC-hvile korrelerer ofte med økt cellulær ROS, som er negativt assosiert med HSCs selvfornyelse.26 Catalpol er et iridoid glukosid, som er funnet i roten til R. glutinosa. Catalpol viste hemmende oksidativt stress, DNA-skader og telomerforkorting gjennom PGC-1/TERT-veien i en tidligere studie.33 I vår studie ble nivået av ROS redusert i LSK-cellene fra R. glutinosa-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Dermed forlenger R. glutinosa overlevelsen til mus ved å hemme oksidativt stress i HSC-ene.

FIGUR 6 Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av modne immunceller i perifert blod (PB), benmarg (BM), milt og thymus. Mus (i alderen 20 måneder) ble matet dietter supplert med Rehmannia glutinosa eller Astragalus membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n=5/gruppe); kontrollgruppen ble matet med en standard diett. A, Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av B-celler (B220 pluss) i PB, BM og milt. B, Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av monocytt- og granulocyttceller (CD11b pluss ) i PB og BM. C og D, Flowcytometrisk analyse av prosentandelen av CD4 pluss og CD8 pluss celler i PB, milt og thymus. Data representerer gjennomsnittet ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus brukes også i tradisjonell kinesisk medisin for å fremme immunitet, redusere blodsukkeret og fremme tumorcelleapoptose, og har ogsåantioksidasjonoganti-aldringeiendommer. I denne studien fant vi at kosttilskudd med A. memranaceus i 10 måneder ikke hadde noen åpenbare effekter sammenlignet med de som ble observert hos kontrollmusene, mens vekten til mus ble redusert ved 20 måneder. Derfor kan A. membranaceus være uegnet for LT-behandling til matet mus.

Avslutningsvis viser resultatene våre at R. glutinosa kan forlenge levetiden til mus ved å opprettholde roen og forbedre funksjonen til HSC-er. Videre kan R. glutinosa redusere de intercellulære nivåene av ROS og antall SA‐ ‐gal‐positive celler og øke B‐celle immunitet.

TAKK

Denne studien ble delvis støttet av National Science Foundation for China (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016- 12M- 1-012) og PUMC Youth Fund (2017310018).

INTERESSEKONFLIKTER

Ingen.

FORFATTERBIDRAG

Alle oppførte forfattere oppfyller kravene for forfatterskap. CQ og LFZ unnfanget og designet eksperimentene. LB utførte eksperimentene og skrev hovedmanuskripttesten. GYS utførte og analyserte dataene til FACS. YJY designet eksperimentet om tradisjonell kinesisk medisin. WC klarte musene. Alle forfattere har lest og godkjent manuskriptet.