joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IL-22-mediert nyremetabolsk omprogrammering via PFKFB3 for å behandle nyreskade

Wei Chen, et al

Grafisk abstrakt

IL-22 dempernyreskadevia metabolsk omprogrammering av nyre-TEC, regulerer mitokondriell funksjon og glykolyse i skadede TEC-er, og lindrer akkumulering av mitokondriell ROS og dysfunksjonelle mitokondrier via induksjon av AMPK/AKT- og PFBFK3-aktiviteter. ForbedrendenyreskadeofIL-22 via regulering av metabolismerelevant signalering er sertifisert i dyremodeller med cisplatinindusert nyreskade og diabetisk nefropati.

Abstrakt

Nyreskade initierer forverrede metabolske tilstander i tubuliceller som fører til utvikling av nyresykdom i sluttstadiet (ESTD). Interleukin-22 (IL- 22) er en effektiv terapeutisk motgift motnyreskadevia å fremme nyregjenoppretting, men lite er kjent om de underliggende molekylære mekanismene. Her gir vi først bevis på at IL-22 svekkernyreskadevia metabolsk omprogrammering av renale tubulære epitelceller (TEC). Spesifikt tyder dataene våre på at IL-22 regulerer mitokondriell funksjon og glykolyse i skadede TEC-er. Ytterligere observasjoner indikerer at IL-22 lindrer akkumulering av mitokondrielle reaktive oksygenarter (ROS) og dysfunksjonelle mitokondrier via induksjon av AMPK/AKT-signalering og PFBFK3-aktiviteter. Hos mus, forbedring avnyreskadeog nekrose og forbedring av nyrefunksjoner via regulering av denne metabolismerelevante signaleringen og mitokondrielle egnetheten til rekombinant IL-22 er sertifisert i cisplatininduserte nyreskader og diabetisk nefropati (DN) dyremodeller. Til sammen avdekker funnene våre ny mekanistisk innsikt i de beskyttende effektene av IL-22 på nyrene og fremhever de terapeutiske mulighetene til IL-22 og de involverte metabolske regulatorene i ulike nyresykdommer.

SØKEORDinterleukin-22,nyreskade, metabolsk omprogrammering, mitokondriell dysfunksjon

Cistanchetubulosaforebygger nyresykdom, klikk her for å få prøven

1. INTRODUKSJON

Akuttnyreskade(AKI), et vanlig folkehelseproblem forbundet med høy dødelighet og sykelighet, påvirker millioner av sykehuspasienter over hele verden og viser en raskt økende forekomst.1–3 Den underliggende patofysiologien til AKI er ikke fullt ut forstått, men involverer skade og apoptose av nyre. tubulære epitelceller (TEC), spesielt i den proksimale tubulus.4–7 Flere typer litteratur støtter at deres alvorlige og vedvarende skade ofte forårsaker ufullstendig og maladaptiv vevsreparasjon, noe som fører til inflammatorisk respons, tubulær degenerasjon, nyrefibrose og eventuell progresjon til sluttstadium nyresykdom (ESTD).8–10 Dessverre, bortsett fra dialysebasert støttebehandling, finnes det ingen veletablerte terapier fornyreskadeer tilgjengelig. Derfor er det sårt nødvendig med proaktiv behandling for å redusere lidelsen det påfører pasientene og de betydelige økonomiske byrdenenyreskadetil individer og samfunn.

Interleukin-22 (IL-22), et viktig medlem av IL-10-familiens cytokiner, har nylig tiltrukket seg enorm oppmerksomhet som et overlevelsesmiddel i en rekke lidelser drevet av epitelskade.11–13 IL -22 fremkaller vevsbeskyttelse og homeostase primært via aktivering av STAT3-signalveien og fremme av epitelial spredning.14,15 Det er viktig at studier har vist at uttrykket av IL-22R1 er begrenset til nyreproksimale TEC-er. , og behandling med IL-22 kan beskytte mot nyreepitelskade og akselerere tubulær regenerering.16,17 Men selv om akkumulerende bevis indikerer at IL- 22 er en effektiv terapeutisk motgift fornyreskade, lite er kjent om de underliggende mekanismene for IL- 22-indusert TEC-gjenoppretting. Å forstå det molekylære grunnlaget for IL-22 er viktig både for å utforske hvordan IL-22 virker for å inhibere AKI eller ESTD og for å oppdage molekylære modifikatorer så vel som viktige prosesser involvert i å forhindre nyreskade.

Nyreparasjon etter skaden er en metabolsk avhengig og komplisert prosess.18 Nyere bevis tyder på at cellemetabolske signaturer kan regulere nyrecelleoverlevelse og plastisitet og dermed gi nyttig mekanistisk innsikt i hvordan de metabolske prosessene kontrollerer vevsreparasjon.19,20 Spesielt disse funnene viser at metabolsk omprogrammering av PGC1 eller S-nitroso-CoA-reduktasesystemet beskytter motnyreskade. Mekanistisk kan økt glykolyse og oksidativ fosforylering (OXPHOS) fremme vekst og defensive signalveier eller kan dekke de høyere energetiske kravene til mitose og anabol biosyntese under organreparasjon.19,21 Nylig har våre studier vist at IL-22 lindrer mitokondriell dysfunksjon i leveren, som involverer de cellulære metabolske prosessene.22,24 Derfor spør vi om IL-22 beskytter mot nyreskade og apoptose ved å regulere deres metabolske tilstander. For å bestemme mekanismene for IL-22-mediert nyreparasjon, behandler vi humane proksimale tubulære epitelceller (PTEC) med stressstimulering. Vi foreslår at IL-22 driver metabolsk omprogrammering for å forbedre glykolyse og OXPHOS, som forhindrer TECs dysfunksjon. Vi viser videre at IL-22 induserte dette programmet via aktivering av AMPK/AKT-signalering og dets molekylære modifikatorer for å lindre mitokondriell dysfunksjon. Våre observasjoner kaster lys over regulering av metabolske tilstander for behandling og forebygging av nyresykdommer og gir ny innsikt for å utvikle effektive nye intervensjoner for organskader generelt.

Cistanche kan behandlenyreskade

2. MATERIALER OG METODER

2.1 Reagenser

Oligomycin, rotenon og cyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) ble oppnådd fra Sea horse Biosciences; rekombinant IL-22 ble levert av Novoprotein (Kina); cisplatin (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5',6,6'-tetraklor-1,1',3,3'-tetraetylbenzimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) og forbindelse C ble oppnådd fra Beyotime Biotechnology (Kina); antistoffer rettet mot Glut1, -Actin, p-AMPK, AMPK og GAPDH ble kjøpt fra Abcam; antistoffer forSTAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 og Caspase-3 ble kjøpt fra Cell SignalingTechnology; rapamycin, palmitinsyre (Palm.), Z-VAD-FMK og glukose ble oppnådd fra Sigma-Aldrich; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red og PKH26 ble hentet fra Invitrogen.

2.2 Cellekultur

Den humane proksimale tubuli-epitelcellen (HK{{0}}) ble hentet fra Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, og vedlikeholdt etter standardprotokoller. HK-2 ble sådd i seks-brønns plater (1 × 106 celler/brønn) eller 96-brønns plater (1 × 105 celler/brønn) og dyrket i 90 prosent RPMI1640-medium (Gibco) supplert med 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin og 10 prosent føtalt bovint serum (FBS) (Gibco). Vi inkuberte først HK-2 med IL-22 (0,5 µg/ml) i 0,5 timer, deretter 50 mM d-glukose eller 5 µg/ml cisplatin eller 0,2 mM palmitinsyre eller eller 4 µM doksorubicin (DOX) ) i 24 timer. I noen tilfeller ble celler dyrket i nærvær av Z-VAD-FMK (10 µM), forbindelse C (5 µM), LY294002 (20 µM) eller rapamycin (50 nM) i angitte tider.

2.3 Sjøhesteksperimenter

Vi analyserte TEC-er ved å bruke en Seahorse XF96 Extracellular Flux-Analyzer for endringene i den ekstracellulære syrehastigheten (ECAR) og oksygenforbrukshastigheten (OCR). Kort fortalt ble HK-2 (1 × 105) dyrket på 96-brønn Seahorse-plater over natten. Deretter vasket vi celler med et sjøhestanalysemedium som inneholdt 1 mM pyruvat, 10 mM glukose og 2 mM glutamin (eller glukosefri for testing av ECAR) i en atmosfære uten CO2 ved 37◦C for {{18 }}.5 t. Eksperimentelle data ble registrert etter at de undernevnte inhibitorene ble injisert i en optimal konsentrasjon av FCCP (1.0 µM), oligomycin (1.0 µM), rotenon/antimycin A (0.5 µM), 2-DG (50) mM), eller glukose (10 mM).

Cistanche kan behandlenyreskade

2.4 Mus og dyremodeller

BALB/c hannmus (6–8 uker) ble kjøpt fra Slaccas Experimental Animal Co. (Shanghai, Kina). Db/db og Db/m mus ble levert av Model Animal Research Center ved Nanjing University (Nanjing, Kina). Alle mus ble holdt i spesifikke patogenfrie (SPF) fasiliteter og dyrket etter standard protokoller. For AKI-modellen fikk BALB/c-mus cisplatin (20 mg/kg) eller saltvannskontroll ved intraperitoneal injeksjon. Db/db-mus ble matet med en diett med høyt fettinnhold (HFD) på de angitte tidspunktene for å indusere diabetisk nefropati (DN). Db/m mus ble matet med chow-dietter som kontrollgruppe. I AKI dyreforsøk ble IL-22 injisert intraperitonealt i dosen 0,5 mg/kg/dag eller 1,5 mg/kg/dag i 4 påfølgende dager. I DN-dyreforsøk ble IL-22 injisert intraperitonealt med dosen 2,5 mg/kg to ganger ukentlig i åtte påfølgende uker. Kontrollmusene mottok passende mengde PBS. Våre dyreforsøksprosedyrer ble utført etter protokollene som ble evaluert og godkjent av dyrepleie- og bruksetikkomiteen ved School of Pharmacy, Fudan University. Immunhistokjemisk farging, måling av mitokondriell membranpotensial, histologisk og reaktive oksygenarter (ROS) farging av nyreseksjoner ble utført som tidligere beskrevet.22–24

2.5 PCR i sanntid

Vi oppnådde total-RNA av TRNzol-reagenser (Beyotime Biotechnology, Kina) fra celle- eller vevsprøver og transkriberte dem deretter til cDNA ved å bruke et MMLV-revers transkriptase-testsett (Beyotime Biotechnology). Ekspresjonsnivået til mRNA ble analysert av sanntids PCR-instrumenter (BioRad) ved bruk av SYBR green qPCR-mix analysesett (Beyotime Biotechnology) og standardisert til GAPDH.

2.6 Flowcytometri

Nyreceller ble dyrket og behandlet som beskrevet ovenfor. MitoSOX (mitokondriell ROS), MitoTracker Green (total mitokondriell masse) og MitoTracker Red (mitokondriell membranpotensial)-farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner og tidligere forskning.22–24 Vi fikk resultatene av Beckman Coulter Flow Cytometer og CytExpert-programvare (BD Biosciences).

2.7 Glukoseopptak

Vi målte glukosekonsentrasjonene i cellekultursupernatanten ved en glukoseopptaksanalysetest i henhold til produsentens protokoll og tidligere forskning (GAHK20; Sigma). Resultatnormalisering ble utført i henhold til antall celler.

2.8 Gene knockdown

Vi brukte det lille forstyrrende RNA (siRNA; RiboBio, Kina) for å slå ned de spesifikke genene. Først ble Lipofectamine RNAiMAX og siRNA (100 pmol) forsiktig blandet via pipettering og inkubert ved 37◦C i 0,5 time. Deretter endret vi standard cellekulturmediet til en transfeksjonscocktail og inkuberte cellene i 6 timer for siRNA-gentransfeksjon. Deretter endret vi transfeksjonscocktailen til et friskt cellekulturmedium. Etter 48 timer ble nyreceller inkubert med IL-22 for videre studier.

Cistanche kan behandlenyreskade

2.9 Western blot

Vi ekstraherte totale proteiner fra celler eller vev med RIPA lysisbuffer (Beyotime Biotechnology, Kina). Deretter samlet vi lysatene ved sentrifugering ved 4◦C ved 12 000 rpm i 10 min. Deretter ble lysatene oppvarmet med prøvebufferne ved 100◦C i 15 minutter, utsatt for natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og elektrooverført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Tyskland). Membranene ble deretter blokkert med 5 prosent bovint serumalbumin (BSA) i 2 timer og co-inkubert med primære antistoffer ved 4◦C over natten. Etter vask tre ganger ble membranene inkubert med pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer (CST, USA). Proteinblottene ble visualisert av det forbedrede kjemiluminescensavbildningssystemet.

2.10 Immunfluorescens

Nyrecellene ble fiksert med 3 prosent –4 prosent paraformaldehyd og permeabilisert med 0,1 prosent Triton X-100. Deretter blokkerte vi cellene med 5 prosent BSA i 2 timer. Celler ble inkubert over natten med anti-GLUT1-antistoffet ved 4◦C, vasket fire ganger og deretter farget med PKH26. Deretter ble nyreceller farget med Hoechst 33342 og montert på objektglass. Data ble innhentet ved konfokal mikroskopi.

2.11 RNA-seq og bioinformatikk

TECs prøver (2 × 107) ble lysert og totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy mini-settet, i henhold til produsentens protokoller (Beyotime, Shanghai, Kina). Eukaryotic RNA-seq ble utført ved å bruke teknologien for neste generasjons sekvensering (NGS) på Illumina HiSeq-sekvenseringssystemet, og ga en 50-base leselengde. Justering av sekvensavlesninger ble utført ved å bruke TopHat v2.0.12 mot UCSC mm10-enheten. Differensialekspresjonsanalyse ble beregnet ved bruk av DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) pakke og de statistiske signifikansanalysene ble utført i R (v3.1.1; http://www .r-project.org/). Pathway-overrepresentasjon ble utført ved å bruke R-pakken ReactomePA.

2.12 Statistikk

Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) og ble vist ved bruk av GraphPad Prism 5.0. For resultater som sammenligner to eller flere grupper, ble forskjellene beregnet ved å bruke studentens t-test eller enveis variansanalyse (ANOVA): ***p < 0.00="" 1,="" **p="">< 0,01="" og="" *p=""><>

Cistanche kan behandlenyreskade

3 RESULTATER

3.1 IL-22 bevarer cellulær metabolisme i TEC

Fordi mitokondrier hadde blitt foreslått å være viktige organeller som integrerte cellulær metabolisme og apoptotiske prosesser, vurderte vi mitokondriell funksjon i TEC-er som ble stimulert mednyreskadefaktorer og behandlet med IL-22.25 Som vist i figur 1A–D ble mitokondriell basal oksygenforbruk (OCR), maksimal respirasjonskapasitet (MRC) og respirasjon blokkert vesentlig i TEC-ene under stresssituasjoner. Spesielt ble disse abnormitetene i stor grad forhindret av IL- 22-behandling. Glykolyse i skadede TEC-er, dokumentert ved ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR), ble også markert begrenset, sammenlignet med IL-22 pluss stimuli-utfordrede TEC-er (figur 1B og E). Vi demonstrerte videre at kompromittert oksidativ fosforylering (OXPHOS) og glykolyse i skadede TEC-er ikke var de sekundære effektene av apoptose via samtidig behandling av en pan-caspase-hemmer (figur S1). Og IL-22-medierte reparerende effekter på metabolske defekter var spesifikke for nyre-TEC (Figur S2). I tillegg fremmet IL-22 HK2-celler OXPHOS og glykolyse i fravær av stimuli, noe som indikerer at IL-22s effekter på metabolske veier ikke var spesifikke for skadede TEC-er (figur S3). Dessuten indikerte resultatene våre også at IL-22 fremmet uttrykket og translokasjonen av IL-22R1. I mellomtiden ble fosforyleringen av STAT3 og metabolske omprogrammeringseffekter av IL-22 fullstendig avvæpnet av IL-22R1 knockdown (Figur S4). Disse funnene antydet at IL-22 gjenopprettet den metabolske tilstanden til TEC-er ved å aktivere IL-22R1 direkte. Fordi flere bevis hadde antydet at Glut1 spilte en hovedrolle i glykolyse og glukosehomeostase26, spurte vi derfor om IL-22 påvirket Glut1-translokasjon eller ekspresjon. Som forventet demonstrerte vi at IL-22 ikke bare fremmet den translokerte Glut1 til cellemembranoverflaten (PKH26) og Glut1-ekspresjon, men også økte glukoseopptaket (figur 1F og G). Totalt sett indikerte disse observasjonene at IL-22 kunne forbedre OXPHOS og glykolyse i de skadde TEC-ene.

FIGUR 1 IL-22 bevarer mitokondriell kondisjon og glykolyse i TEC. (A og B) Vi bruker Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer for å teste endringene i den ekstracellulære syrehastigheten (ECAR) og oksygenforbrukshastigheten (OCR) til TEC-er. OCR og ECAR i TEC-er inkubert med 50 mM glukose, eller 5 µg/mL cisplatin, eller 0.2 mM palmitinsyre, eller 4 µM DOX i nærvær eller fravær av IL{{8} }. (C) Maksimal respirasjonskapasitet (MRC) av TECs vurdert ved sanntidsendringer i OCR. (D og E) Kurver i OCR og ECAR for TEC etter inkubering med oligomycin, FCCP, glukose, rotenon og {{10}}DG. (F) Lokalisering og uttrykk for kjernefysisk (blå), Glut1 (grønn) og plasmamembran (rød) i TEC. (G) Glukoseforbruk i TEC etter IL-22-behandling i 24 timer. n=3; målestokkstenger, 20 µm; Elevens t-test (uparet); ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.2 IL-22 forbedrer akkumuleringen av dysfunksjonelle mitokondrier i TECs via aktivering av mitofagi

dannelse av LC3 puncta i TECs etter eksponering for stimuli (figur 2F). Vi tømte deretter mitofagi for å vurdere dens funksjon på tubuluscellemetabolismen via siRNA-ATG5 (figur S6). Dataene våre antydet at uttømmingen av mitofagi i TEC-er signifikant hemmet de beskyttende effektene av IL-22 for å bevare mitokondriell fitness (Figur 2E), noe som indikerer at IL-22 forhindrer mitokondriell dysfunksjon via aktivering av mitofagi.

FIGUR 2 IL-22 hemmer mitokondriell dysfunksjon og mitokondriell ROS-akkumulering via induksjon av mitofagi. (A) Mitokondriell masse ble farget og vurdert ved MitoTracker Green og flowcytometri. Mitokondriell ROS ble evaluert i TEC-er farget med MitoSOX (B). Mitokondriell membranpotensial ble vurdert i TECs farget med MitoTracker Green og MitoTracker Red (C); mitokondriell ROS-akkumulering ble evaluert av MitoTracker Green og MitoSOX (D). (E) Konfokale bilderesultater antydet mitokondriell ROS-produksjon merket med MitoSOX. (F) Representative mikroskopiske bilder indikerte LC3-GFP-punktdannelse i nærvær eller fravær av IL-22 TEC-er stimulert som (A) i 24 timer. (E) OCR ble vurdert i nærvær eller fravær av IL-22 og siRNA-ATG5 i 24 timer. n=3; Elevens t-test (uparet); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 opprettholder mitokondriell integritet til TEC-er via aktivering av AMPK/AKT-signalering

AMPK-signaleringen, som et sentralt signalknutepunkt som forbinder celleoverlevelse og metabolisme, kontrollert glukosemetabolisme, lipidsyntese og mitokondriell funksjon.28 I henhold til den nyrebeskyttende effekten av interleukin-22 mediert av metabolsk omprogrammering av TEC, vurderte vi om IL-22 regulert mitokondriell integritet via aktivering av AMPK-signaltransduksjon. Vi fant at IL-22 økte aktiviteten til STAT3/AMPK/AKT-signaltransduksjon i de skadde TEC-ene, dokumentert ved fosforylering av STAT3, AMPK og AKT (Figur 3A). I tillegg ble disse prosessene blokkert i rørformede celler som mangler STAT3, noe som viste at IL-22 regulerte AMPK/AKT-signalering gjennom STAT3 (figur 3B og C; figur S7). Vi inkuberte videre TEC-er med forbindelse C og LY294002 for å direkte hemme AMPK/AKT-signaltransduksjoner, og deretter evaluere mitokondrielle funksjoner og metabolismetilstander. Resultatene avslørte at samtidig behandling med disse signalhemmerne betydelig forhindret den forbedrede OXPHOS og glykolytiske fluksen indusert av IL-22-behandling (figur 3D–I), noe som antydet at IL-22 fremmet TEC-metabolismen via aktivering av AMPK /AKT signalvei.

FIGUR 3 Induksjon av AMPK/AKT-signalering av IL-22 opprettholder mitokondriell kondisjon. TEC-er ble stimulert 50 mM glukose, eller 5 µg/mL cisplatin, eller 0.2 mM palmitinsyre, eller 4 µM DOX i nærvær eller fravær av IL-22, forbindelse C , eller LY294002 for angitte tider. (A og B) AMPK/AKT-signalveiaktivering i TEC-er eller STAT3-WT- og STAT3-KD-TEC-er ble evaluert ved western blot-analyse. (C og D) Endringer i OCR og ECAR for TEC ble analysert. (E) AMPK/AKT-signalveiaktivering i TEC-er ble evaluert ved western blot-analyse. (F–I) Endringer i OCR og ECAR for TEC-er ble målt i TEC-er kontra forbindelse C og LY294002-behandlede TEC-er. Elevens t-test (uparet); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.4 IL-22 bevarer cellulær metabolisme og mitokondriell integritet til TEC-er via induksjon av PFKFB3

For å utforske hvordan TECs mitokondrielle kondisjon og metabolisme ble forbedret, brukte vi dessuten RNA-sekvenseringsanalyse (RNA-seq) for å vurdere genuttrykk etter stimuliskade og IL-22-behandling. Vi demonstrerte at flere gener ble betydelig endret i TEC-er etter IL-22-inkubasjon (figur 4A). Ved å bruke de tilgjengelige databasene ble gensettberikelsesanalysen av de oppregulerte genene utført, noe som antydet en bemerkelsesverdig berikelse av gener i AMPK-signalveien og MYC-målsignalveien (Figur S8). Spesielt ble PFKFB3 signifikant indusert av IL-22 blant genene undernyreskadefaktorer stimulering (figur 4A). Disse observasjonene ble også indikert med konfokale bilder, Q-PCR og western blot. Det høye uttrykket av PFKFB3 var AMPK/AKT-signalavhengig (figur 4B og C; figur S9).

Tidligere studier har antydet at PFKFB3 kunne reguleres av en rekke signaltransduksjoner for å akselerere epitelregenerering og reparasjon etter skade.29,30 Vi spekulerte derfor i at IL-22 induserte PFKFB3 for å bevare cellemetabolismen til TEC og opprettholde deres mitokondrielle kondisjon. . Vi observerte at hemming av AMPK / AKT-signalering reduserte PFKFB3-uttrykk (figur 4D). Så vi stilte PFKFB3 for å studere dens funksjoner i TEC-er etter IL-22-inkubasjon. Funnene våre indikerte at dempet PFKFB3 lindret de metabolske omprogrammeringseffektene av IL-22 på å gjenopprette ECAR og OCR (Figur 4E og F), og forhindret glukoseopptak samt dysfunksjonelle mitokondrier (Figur 4G og H). I tillegg demonstrerte vi videre at de metabolske omprogrammeringseffektene av IL-22 ble fullstendig avvæpnet av STAT3-knockdown mens overuttrykket av PFKFB3 kunne redde disse fenotypene, noe som tyder på at IL-22 gjenopprettet metabolsk tilstand av skadede nyreepitelceller via målrettet STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3-signalering direkte (figur S10). Til sammen indikerte disse funnene at aktiveringen av PFKFB3 spilte en viktig rolle i mitokondriell kondisjon og dysfunksjonell mitokondriereliminering etternyreskade.

FIGUR 4 IL-22 opprettholder mitokondriell integritet og cellulær metabolisme av TEC-er via induksjon av PFKFB3. (A) Vulkanplott for genuttrykk i TEC-er stimulert med glukose, eller cisplatin, eller palmitinsyre, eller CCl4 i nærvær eller fravær av IL-22 i 24 timer. (B) Konfokale mikroskopiske data demonstrerte PFKFB3-overuttrykk i TEC-er etter IL-22-behandling, som krevde AMPK/AKT-signalaktivering. (C) PCR-resultater i sanntid indikerer at IL-22 induserte PFKFB3-overuttrykk i TEC-er, som kan hemmes av AMPK/AKT-signalblokkering. (D) AMPK/AKT/ PFKFB3-signalveiaktivering i TEC-er etter behandling med forbindelse C og LY294002. (E og F) ECAR og OCR i TEC-er ved tilstedeværelse eller fravær av IL-22, eller si-PFKFB3 i 24 timer. (G) Glukoseforbruk i TEC etter IL-22- eller si-PFKFB3-behandling i 24 timer. (H) Mitokondriell dysfunksjon ble evaluert i TECs farget med MitoTracker Red og MitoTracker Green. Elevens t-test (uparet); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0.01,="" *p=""><>

3.5 IL-22 lindrer nyreskade i cisplatin-indusert AKI via undertrykkelse av nyre-ROS-akkumulering og mitokondriell dysfunksjon

For å teste hypotesen vår om at IL-22 regulerte nyremetabolske profiler for å undertrykke nyretubuliskade in vivo, evaluerte vi først nyrefunksjoner i IL-22-behandlede mus som hadde blitt administrert med cisplatin (figur 5A). Fire dager etter cisplatin-injeksjon reduserte IL-22 ikke bare tubulær cellulær skade og blødning betydelig; deres nyredysfunksjon hadde også blitt betydelig svekket, noe som ble vurdert av serumnivåene av blod urea nitrogen (BUN) og kreatinin (Cr) (Figur 5B–D). Vi foreslo videre at IL-22 ble forhindretnyreskadevia å forbedre nyregenerering og aktivere AMPK/AKT-signalering og PFKFB3 (Figur 5E og F; Figur S11). Deretter brukte vi MitoSOX (mitokondriespesifikk ROS-farge) og JC-1 (mitokondriell membranpotensialavhengig fargestoff) for å vurdere mitokondriell dysfunksjon involvert i cellulær metabolisme og apoptose. I nyreseksjonene til mus som hadde blitt behandlet med cisplatin, var det sammenlignbare akkumuleringer av ROS. Merk at fire dager etter IL-22-behandling var nivåene av ROS markant redusert i de skadde nyrene sammenlignet med ROS fra mus etter PBS-behandling (Figur 5G). Til sammen ga disse observasjonene bevis på at IL-22 spilte en beskyttende rolle i cisplatin-indusert AKI ved å kontrollere mitokondriell kondisjon.

FIGUR 5 IL-22 lindrer nyreskade i cisplatin-indusert AKI via hemming av renal ROS-akkumulering og dysfunksjonelle mitokondrier. (A) Skjematisk diagram av de eksperimentelle protokollene for å evaluere de beskyttende effektene av IL-22 i cisplatin (20 mg/kg) indusert nyreskade. PBS som en bærerkontrollgruppe og N-acetyl-l-cystein (NAC, 150 mg/kg) som en positiv kontrollgruppe. (B og C) Serum BUN-nivåer, serum Cr-nivåer, nyrevekter og kroppsvekter ble vurdert. Representant HE (D), Ki-67-farging (E), MitoSOX (G) og JC{{10}} (G) bilder av nyreseksjonene ble presentert. (F) Sammenligning av STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3-aktivering i nyreekstrakter fra de IL-22-behandlede musene ble evaluert med western blot. Elevens t-test (uparet); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.6 IL-22 forbedrer diabetesindusert nyreskade via hemming av mitokondriell dysfunksjon gjennom aktivering av AMPK/AKT-signalering og PFKFB3

Vi og andre hadde vist at IL-22 kunne utøve beskyttende styrke ved diabetisk nefropati (DN), som var hovedårsaken til ESTD.31–33 For å studere de underliggende mekanismene ytterligere, matet vi db/db mus med høy- fettdietter (HFD) og deretter behandlet dem med IL-22 (2,5 mg/kg, IP) i 8 uker (Figur 6A). Når mus kun ble matet med HFD, fant vi tubulær fibrose i nyrene og dilatasjon, i tillegg til atrofi. Derimot, når mus ble behandlet med IL-22, ble nyrefibrose og histopatologi betydelig forbedret, så vel som nyrefunksjonene. Forbedrede nyrefunksjoner ble også demonstrert ved reduserte serum Cr, BUN-nivåer og totalt urinalbumin/24 timer (UAE) nivåer (Figur 6B–E). For å studere om disse aktivitetene var assosiert med mitokondrier, vurderte vi mitokondriefunksjonen involvert i cellulær metabolisme og apoptose. Resultatene indikerte at de økte mitokondrielle ROS-nivåene og akkumulerte dysfunksjonelle mitokondrier ble betydelig lindret av IL-22-behandling (figur 6F og G). For å studere videre om de beskyttende funksjonene til IL-22 i nyrene ble mediert gjennom PFKFB3, injiserte vi mus med PFKFB3 shRNA-adenovirus for å slå ned PFKFB3. Dataene våre indikerte at de gunstige effektene av IL-22 på HFD-indusert nyreskade, nekrose, steatose, mitokondriell dysfunksjon og ROS-akkumulering og aktiveringen av relaterte signalveier ble betydelig blokkert av PFKFB3-knockdown (Figur 6B–G) . Det økte uttrykket av AMPK/AKT-signalering ble også observert etter behandling med IL-22 (figur 6H). Sammen med lindring av nyredysfunksjon ble uttrykkene av PFKFB3 og viktige enzymer i cellulær metabolisme også forbedret i nyrene til IL--22--behandlede mus (figur 6H og I). I tillegg indikerte histologisk analyse av større organer ingen morfologiske skader etter IL-22-injeksjon, noe som tyder på at IL-22 kan være en sikker motgift uten signifikante bivirkninger eller toksiske reaksjoner fornyreskadelidelser (Figur 12S). Samlet sett antydet dataene våre at IL- 22 lindret nyreskade via aktivering av AMPK/AKT-signaltransduksjon, hemming av ROS-akkumulering og mitokondriell funksjonsregulering gjennom PFKFB3.

FIGUR 6 IL-22 lindrer diabetesindusert nyreskade gjennom AMPK/AKT-signalering og hemming av dysfunksjonelle mitokondrier via aktivering av PFKFB3. (A) Skjematisk diagram av de eksperimentelle protokollene for å evaluere de beskyttende effektene av IL -22 i diabetesindusert nyreskade. Db/m som vehikelkontrollgruppe. (B–D) Serum BUN-nivåer, serum Cr-nivåer og UAE ble evaluert. Representative HE (E), MitoSOX (F) og JC-1 (G) bilder av nyreseksjonene ble presentert. (H og I) Sammenligning av STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3-aktivering i nyreekstrakter fra IL-22--behandlede mus ble evaluert med western blot. Elevens t-test (uparet); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4. DISKUSJON

IL-22 skilles ut av immunceller, som NK-celler, nøytrofiler, medfødte lymfoide celler (ILC) og T-celler, men påvirker ikke disse cellene direkte. Den regulerer hovedsakelig funksjonene til epitelceller på grunn av det begrensede IL-22R1-uttrykket på epitelceller, inkludert TEC.15,34 Tidligere studier har antydet at IL-22 kan beskytte mot nyreepitelskade og akselerere tubulær regenerering gjennom inhibering av NLRP3-inflammasom og aktivering av STAT3- og AKT-signalering.16,31 De underliggende mekanismene for denne beskyttelsen er imidlertid ennå ikke belyst. For å bestemme det molekylære grunnlaget for IL- 22s funksjon inyreskade, undersøker vi først om IL-22 kan lindre nyrecelledysfunksjon og påfølgende apoptose ved å regulere deres metabolske tilstander. Dessuten studerer vi to modeller avnyreskadesykdommer (AKI og DN) med IL-22-administrasjon og sammenligne observasjonene med observasjonene til kontrollgruppene. Vi indikerer at IL-22 korrigerer metabolsk omprogrammering for å opprettholde mitokondriell integritet, reduserer mitokondriell ROS-akkumulering i skadede TEC-er og lindrer progressiv nyreskade og nekrose. Dessuten antyder funnene våre at IL- 22 kan aktivere AMPK/AKT-assosierte signalveier i TEC-er og nyrer, viktige mediatorer av epitelial sårheling og celleoverlevelse, for å forbedre mitokondriell dysfunksjon og de forverrede metabolske profiler og åpne for en ny roman. felt for IL-22-mediert nyrebeskyttelsesmekanisme. Samlet sett indikerer resultatene våre at de nyrebeskyttende effektene av IL-22 formidles via metabolske omprogrammeringsprosesser.

Den kritiske rollen til OXPHOS og glykolyse i nyrebeskyttelse har blitt avslørt i tidligere studier, der balansering av drivstoffutnyttelse ved hemmende S-nitrosylering av pyruvatkinase M2 (PKM2) beskytter motnyreskade.19 Resultatene våre, som antyder fremme av OXPHOS og glykolyse av IL-22 via økende uttrykk for metabolske regulatorer og glukoseopptak, viser at IL-22 reverserer de forverrede metabolske tilstandene forbundet mednyreskade. Disse observasjonene stemmer overens med de nyrebeskyttende funksjonene til rekombinant irisin og også i tråd med funn fra hepatocytter, hvor både OXPHOS og glykolyse er nødvendig for cellulære funksjoner, men hvis disse hemmes, så blir de primære tubulicellene og hepatocyttene dysfunksjonelle.35, 36

Mitokondriell dysfunksjon har dukket opp som det viktigste molekylære grunnlaget som integrerer metabolske profiler og celledød. Heri illustrerer vi at ved stimulering av skadefaktorer, hadde TECs behandling med IL-22 forbedret akkumulering av mitokondriell ROS og dysfunksjonelle mitokondrier sammenlignet med redusert mitokondriell integritet og funksjon i kontrollgrupper. Viktigere er det at AMPK-signalveier, kritiske energisensorer modulerer metabolske prosesser for å opprettholde cellulær homeostase og forhindre celle- eller vevsskade.37–39 I den nåværende studien indikerer våre observasjoner at IL-22 bevarer mitokondriell integritet og funksjon ved å aktivere AMPK/AKT-signalering for å demonstrere at IL-22 forhindrer mitokondriell dysfunksjon i en direkte metode, som er avgjørende for å opprettholde TECs respirasjonskapasitet. Videre demonstrerer vi at IL-22-signalering gjennom STAT3 har direkte effekter på å bevare mitokondriell kondisjon, ettersom de har blitt undersøkt tidligere at indusert STAT3-fosforylering er avgjørende for å bevare mitokondriell integritet.40,41

Flere typer litteratur har tidligere indikert at PFKFB3 spiller rollen som en sentral modulator i cellemetabolismen.29–30,42 Her demonstrerer vi først at IL-22 fremmer PFKFB3-aktivering gjennom AMPK/AKT-signalering i TEC-er, noe som tyder på IL{ {6}} regulerer metabolske tilstander ved å involvere kontrollen av PFKFB3. Tidligere studier indikerer dessuten at PFKFB3 er viktig for å kontrollere den overdrevne OXPHOS og glykolyse i mange celler eller vev.42,43 I samsvar med disse studiene indikerer våre observasjoner også promotering av OXPHOS og glykolyse i IL-22- behandlede TEC-er via aktivering av PFKFB3. Blant mange nedstrøms modulatorer av IL-22 som har blitt undersøkt, viser dataene våre at PFKFB3 er betydelig oppregulert etter IL-22-behandling under TEC-skader og at STAT3–AMPK/AKT PFKFB3-aksen er avgjørende for bevaring av mitokondriell integritet undernyreskade(Figur 7). De gjenstår å undersøke om IL-22 også regulerer andre metabolske regulatorer og prosesser relatert til nyreskade ved å aktivere STAT3–AMPK/AKT-PFKFB3-signalveien.

FIGUR 7 Funnene våre illustrerer en viktig rolle til IL-22 i å kontrollere nyrecellemetabolismen for å behandle nyreskade ved å aktivere STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3-aksen. Disse resultatene antyder at de terapeutiske mulighetene til IL-22 og målretting av assosiert metabolsk signalering kan være direkte gunstige for en rekke nyreskadebehandlinger eller forebygging

5. KONKLUSJONER

Avslutningsvis demonstrerte vi det terapeutiske potensialet og de underliggende mekanismene til IL-22 ved nyreskade. IL-22 regulerte nyrecellemetabolismen via metabolsk omprogrammering for å bevare mitokondriell integritet. Hemming av deres regulatorer (dvs. AMPK, Akt og PFKFB3) kan føre til unormale metabolske profiler og tap av mitokondriell kondisjon, som indikert i TECs med spontan-22 behandling, som hadde økt dysfunksjonelle mitokondrier og mitokondriell ROS-akkumulering. Det viktigste er at nyreskaden ved mitokondriell dysfunksjon og ROS-akkumulering i musemodeller ble vesentlig lindret ved IL-22-behandling gjennom aktivering av STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3-signalering. Derfor indikerte studien vår at målretting av assosiert metabolsk signalering kan være direkte gunstig for en rekke nyreskadesykdommer, og IL-22 er et potensielt terapeutisk middel for å forebygge og behandle disse sykdommene.

Cistanche-produkter kan behandlenyreskade

Fra: 'IL-22-mediert nyremetabolsk omprogrammering via PFKFB3 for å behandlenyreskade' avWei Chen, et al

---Clin. Overs. Med. 2021;11:e324.

REFERANSER

1. Mehta RL, Burdmann EA, Cerdá J, et al. Anerkjennelse og håndtering av akuttnyreskadei International Society of Nephrology 0by25 Global Snapshot: en multinasjonal tverrsnittsstudie. Lancet. 2016;387:2017-2025.

2. Lameire NH, Bagga A, Cruz D, et al. Akuttnyreskade: en økende global bekymring. Lancet. 2013;382:170-179.

3. Mehta RL, Cerdá J, Burdmann EA, et al. International Society nefrologys 0by25-initiativ for akuttnyreskade(null dødsfall som kan forebygges innen 2025): en menneskerettighetssak for nefrologi. Lancet. 2015;385:2616-2643.

4. Levey AS, James MT. Akuttnyreskade. Ann Intern Med.2017;167:ITC66-ITC80.

5. Jansen MPB, Florquin S, Roelofs JJTH. Rollen til blodplater ved akuttnyreskade. Nat Rev Nephrol. 2018;14:457-471.

6. Agarwal A, Dong Z, Harris R, et al. Cellulære og molekylære mekanismer av AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27:1288-1299.

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, KrautwaldS, Dong Z. Regulert celledød i AKI. J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701.

8. Ferenbach DA, Bonventre JV. Mekanismer for maladaptiv reparasjon etter AKI som fører til akselerert nyrealdring og CKD.Nat Rev Nephrol. 2015;11:264-276.

9. Chawla LS, Eggers PW, Star RA, Kimmel PL. Akuttnyreskadeog kronisk nyresykdom som sammenkoblede syndromer. N Engl J Med. 2014;371:58-66.

10. He L, Wei QQ, Liu J, et al. AKI på CKD: økt skade, undertrykt reparasjon og de underliggende mekanismene. Nyre Int.2017;92:1071-1083.

11. Forbester JL, Lees EA, Goulding D, et al. Interleukin-22 fremmer fagolysosomal fusjon for å indusere beskyttelse mot salmonella enterica Typhimurium i humane epitelceller. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:10118-10123.

12. Geng H, Bu HF, Liu F, et al. I betent tarmvev og epitelceller øker interleukin 22-signalering ekspresjonen av H19 lang ikke-kodende RNA, som fremmer slimhinneregenerering. Gastroenterologi. 2018;155:144-155.

13. Aden K, Tran F, Ito G, et al. ATG16L1 orkestrerer interleukin-22-signalering i tarmepitelet via cGAS-STING. J ExpMed. 2018;215:2868-2886.

14. Huber SN, Gagliani LA, Zenewicz FJ, et al. IL-22BP reguleres av inflammasomet og modulerer tumorgenese i tarmen. Natur. 2012;491:259-263.

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM, et al. Interleukin-22 fremmer intestinal-stamcelle-mediert epitelregenerering. Natur. 2015;528:560-564.

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL-22 forbedrer nyreiskemi-reperfusjonsskade ved å målrette mot proksimalt tubuliepitel. J Am Soc Nephrol. 2014;25:967-977.

17. Kulkarni OP, Hartter I, Mulay SR, et al. Toll-lignende reseptor 4-indusert IL-22 akselererer nyregenerering. J Am Soc Nephrol. 2014;25:978-989.

18. Kang HM, Ahn SH, Choi P, et al. Defekt fettsyreoksidasjon i renale tubulære epitelceller har en nøkkelrolle i utviklingen av nyrefibrose. Nat Med. 2015;21:37-46.

19. Zhou HL, Zhang R, Anand P, et al. Metabolsk omprogrammering av S-nitroso-CoA-reduktasesystemet beskytter motnyreskade. Natur. 2019;565:96-100.

20. Dumesic PA, Egan DF, Gut P, ​​et al. En evolusjonært konservert uORF regulerer PGC1 og oksidativ metabolisme hos mus, fluer og blåfinnet tunfisk. Cell Metab. 2019;30:190-200.

21. Shyh-Chang N, Zhu H, Yvanka de Soysa T, et al. Lin28 forbedrer vevsreparasjon ved å omprogrammere cellulær metabolisme. Celle. 2013;155:778-792.

22. Chen W, Luan J, Wei G, et al. In vivo hepatocellulær ekspresjon av interleukin-22 ved bruk av penetrasjonsbaserte hybridnanopartikler som potensielle anti-hepatitt-terapeutika. Biomaterialer. 2018;187:66- 80.

23. Chen W, Zhang X, Fan J, et al. Å binde interleukin-22 til apolipoprotein AI forbedrer mus fra acetaminophen-indusert leverskade. Teranostikk. 2017;7:4135-4148.

24. Zai W, Chen W, Wu Z, et al. Målrettet interleukin-22-genlevering i leveren av polymetformin og penetrasjonsbaserte hybridnanopartikler for å behandle alkoholfri fettleversykdom. ACS Appl Mater-grensesnitt. 2019;11:4842-4857.

25. Khacho M, Harris R, Slack RS. Mitokondrier som sentrale regulatorer av nevrale stamcellers skjebne og kognitiv funksjon. Nat Rev Neurosci. 2019;20:34-48.

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. Antiinflammatorisk effekt av IL-10 mediert av metabolsk omprogrammering av makrofager. Vitenskap. 2017;356:513-519.

27. Saito Y, Chapple RH, Lin A, Kitano A, Nakada D. AMPK beskytter leukemi-initierende celler i myeloide leukemier fra metabolsk stress i benmargen. Celle stamcelle. 2015;17:585- 596.

28. Mihaylova MM, Shaw RJ. AMPK-signalveien koordinerer cellevekst, autofagi og metabolisme. Nat Cell Biol. 2011;13:1016-1023.

29. Li FL, Liu JP, Bao RX, et al. Acetylering akkumulerer PFKFB3 i cytoplasmaet for å fremme glykolyse og beskytter celler mot cisplatinindusert apoptose. Nat Commun. 2018; 9:508.

30. De Bock K, Georgiadou M, Schoors S, et al. Rollen til PFKFB3--drevet glykolyse i karspiring. Celle. 2013;154:651-663.

31. Dudakov JA, Hanash AM, van den Brink MR. Interleukin-22: immunbiologi og patologi. Annu Rev Immunol. 2015;33:747- 785.

32. Wang S, Li Y, Fan J, et al. Interleukin-22 forbedret nyreskade og fibrose ved diabetisk nefropati gjennom hemming av NLRP3-inflammasomaktivering. Celledød Dis. 2017;8:e2937.

33. Shen YL, Chen W, Han L, et al. VEGF-B antistoff og interleukin-22 fusjonsprotein forbedrer diabetisk nefropati gjennom å hemme lipidakkumulering og inflammatoriske responser. Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. apsb.2020.07.002.

34. Ouyang W, O'Garra A. IL-10 familiecytokiner IL-10 og IL-22: fra grunnleggende vitenskap til klinisk oversettelse. Immunitet. 2019;50:871- 891.

35. Xiang X, Feng D, Hwang S, et al. Interleukin-22 forbedrer akutt-på-kronisk leversvikt ved å omprogrammere svekkede regenereringsveier hos mus. J Hepatol. 2020;72:736-745.

36. Chen W, Zai W, Fan J, et al. Interleukin-22 driver en metabolsk adaptiv omprogrammering for å opprettholde mitokondriell kondisjon og behandle leverskader. Teranostikk. 2020;10:5879-5894.

37. Peng H, Wang Q, Lou T, et al. Myokinmediert muskel-nyre-krysstale undertrykker metabolsk omprogrammering og fibrose i skadede nyrer. Nat Commun. 2017;8:1493.

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Proteinkinase c (PKC) deltar i acetaminophen hepatotoksisitet gjennom c-jun-n-terminal kinase (jnk)-avhengige og -uavhengige signalveier. Hepatologi. 2014;59:1543-1554.

39. Mo R, Lai R, Lu J, et al. Forbedret autofagi bidrar til beskyttende effekter av IL-22 mot acetaminophen-indusert leverskade. Teranostikk. 2018;8:4170-4180.

40. Wegrzyn J, Potla R, Chwae YJ, et al. Funksjon av mitokondriell Stat3 i cellulær respirasjon. Vitenskap. 2009;323:793-797.

41. Chen W, Hu Y, Ju D. Genterapi for nevrodegenerative lidelser: fremskritt, innsikt og utsikter. Acta Pharm Sin B. 2020;10:1347-1359.

42. Cao Y, Zhang X, Wang L, et al. PFKFB3-mediert endotelglykolyse fremmer pulmonal hypertensjon. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116:13394-13403.

43. Doménech E, Maestre C, Esteban-Martínez L, et al. AMPK og PFKFB3 medierer glykolyse og overlevelse som respons på mitofagi under mitotisk arrestasjon. Nat Cell Biol. 2015;17:1304- 1316.