Omkobling av glukose- og lipidmetabolisme indusert av G-proteinkoblet reseptor 17-demping muliggjør overgangen av oligodendrocyttforløpere til myeliniserende celler Ⅱ

3. Resultater

3.1. GPR17 Silencing i å differensiere OPC-er endret uttrykket av gener involvert i lipid- og glukosemetabolisme betydelig

For å fremheve de biologiske prosessene som er betydelig påvirket av GPR17-ekspresjon under OL-differensiering, interfererte vi med uttrykket ved å transfektere rotte-OPC-er med SMART-pool-siRNA-er som er spesifikke for rotte-GPR17. Etter å ha validert vellykket GPR17-knockdown ved qRT-PCR (Figur S1), utførte vi en mikroarray-analyse av 30 584 rottetranskripsjoner i GPR 17-dempede kontra kontroll OPC-er og analyserte de differensielt uttrykte genene (DEGs) med forskjellige bioinformatiske verktøy. For det første har 640 DEG blitt studert av Meta-Core, for å utføre en anrikningsanalyse og identifisere prosessene som er spådd å bli betydelig påvirket. Denne analysen antydet endring av mTOR-signaleringen, som allerede har vist seg å være knyttet til GPR17-funksjonen [37], og av andre prosesser som er kjent for å være relevante for OPC-modning, for eksempel "ombygging av cytoskjelett"og"regulering av lipidmetabolismen" (Tabell 1).

Plus

Klikk her for å vite Cistanche for beinvekst

Tabell 1. Programvaren MetaCore har blitt brukt til å utføre en baneanrikningsanalyse på DEG-ene etter GPR17-demping. Tabellen viser de mest betydningsfulle veiene som er resultatet av analysen, antall assosierte gener og vanlige gener inkludert i datasettet

Deretter ble verktøyet Ingenuity pathway analysis (IPA) brukt til å utføre en analysematch, som automatisk identifiserer kurerte IPA-datasett med betydelige likheter og forskjeller sammenlignet med et spørringsdatasett. Denne analysen styrker den forutsagte koblingen mellom GPR17-ekspresjon og lipidmetabolisme, og viser at uttrykksendringene til 38 gener i datasettet vårt (tabell S1) er assosiert med endret fettsyresyntese (figur 1). Blant disse induserte GPR17-demping oppregulering av LXR (lever X-reseptor alfa, NR1H3 i figur 2 og tabell S1, en kjernefysisk reseptor som reagerer på oksysteroler) og SREBP1 (sterolregulatorisk elementbindende protein 1, SREBF1 i figur 1 og tabell S1), to. nøkkelaktører innen fettsyre- og kolesterolsyntese. I datasettet vårt observerte vi også at flere endrede gener, inkludert PDH (pyruvatdehydrogenase), Ldha (laktatdehydrogenase alfa) og Pdk1 (pyruvatdehydrogenase kinase 1), er relatert til glukosemetabolisme og Krebs' syklus, noe som tyder på potensiell involvering av GPR17-reseptoren i reguleringen av disse metabolske prosessene. I følge dette avslørte en genontologi-basert berikelsesanalyse (ToppGene-suite) på DEG-ene endring av "monokarboksylsyremetabolske prosessen" (GO:{{20}}032787, p- verdi: 0,02), utover andre prosesser relatert til utvikling av sentralnervesystemet og cellemetabolisme, slik som "regulering av utvikling av nervesystemet" (GO:0051960, p-verdi: 0,033) og "sfingolipidmetabolske prosesser" (GO:0006665, p-verdi : 0,043) (Figur 2; fullstendig liste i Tabell S2).

Globalt antyder disse endringene at GPR17-demping kan fungere som en utløser for å adressere celler til myelinisering, ved å justere flere gener involvert i transkripsjonsreguleringen av lipid- og glukosehomeostase, så vel som ved å utnytte kolesterol og lipider for myelinproduksjon.

Figur 1. Verktøy for oppfinnsomhetsveianalyse (IPA, Qiagen) ble brukt til å analysere datasettet og utforske sykdommene og biologiske prosessene som er spådd å øke eller avta basert på mønsteret av differensielt uttrykte gener i datasettet. Fra denne analysen ekstrapolerte vi skjemaet i figuren som inkluderer genene relatert til lipidsyntese differensielt uttrykt i datasettet vårt (p-verdi=9.67 × 10−4). De fulle navnene på disse genene, sammen med den relative foldendringen (log2-forhold) er rapportert i tabell S1. I røde, oppregulerte gener; i grønne, nedregulerte gener

Figur 2. Toppgene-pakken har blitt brukt til GO-basert berikelsesanalyse på DEG-ene. Bildet viser noen av de betydelige biologiske prosessene knyttet til sentralnervesystemet og cellemetabolismen potensielt endret av GPR17-demping. Blå søyler indikerer det totale antallet gener knyttet til hvert ledd; røde søyler indikerer genene som er felles med datasettet vårt for hvert ledd. Den komplette listen over biologiske prosesser som følge av denne analysen og de relative p-verdiene er rapportert i tabell S2.

3.2. Metabolomisk analyse under OPC-differensiering in vitro

For å vurdere korrelasjonen mellom GPR17-uttrykk og aktiveringen av spesifikke metabolske veier, utførte vi en metabolomisk analyse av dyrkede OPC-er under deres fysiologiske modning. OPC-er ble opprettholdt i et differensieringsmedium og deretter lysert på fire forskjellige tidspunkt (etter 0, 1, 3 og 5 dager i differensiering, DID), som tilsvarer forskjellige stadier av OL-modning. Parallelt, for å vurdere at i alle eksperimentene modning skjedde med forventet timing, ble OPC dyrket og farget for GPR17 og MBP. Resultatene viste at antallet GPR17--uttrykkende celler nådde sitt maksimum ved 3 DID og deretter returnerte mot basalnivåer ved 5 DID, mens antallet MBP-positive celler økte gradvis under modning (Figur 3a), i samsvar med tidligere resultater [37]. OPC metabolomisk evaluering ble utført ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) som tidligere beskrevet [38], med fokus på energiske metabolitter involvert i glykolyse, pentosefosfatveien, Krebs-syklusen, fettsyreoksidasjon, deres kofaktorer NADH, NAD pluss, NADPH, NADP pluss, ATP, ADP, AMP, aminosyrer og noen av deres derivater. De metabolomiske profilene til de analyserte firetidspunktene er rapportert i figur 3b. På dag 0 var nivåene av flere metabolitter som tilhører og/eller knyttet til Krebs-syklusen (f.eks. succinat, malat, alfa-ketoglutarat, glutamat, aspartat, alanin og prolin) høyere, som forventet fra celler som kommer fra en svært prolifererende tilstand (figur 3c). På mellomstadier (fra DID 1 til 3) viste OPC en markert oppregulering av molekyler involvert i fettsyre- og kolesterolsyntese. Følgelig observerte vi økte nivåer av acetyl-CoA (figur 3c), som representerer forløperen for kolesterol og fettsyrer og for malonyl-CoA, et spesifikt mellomprodukt for fettsyresyntese. Ved DID 5 observerte vi økte nivåer av flere acyl-karnitiner og aminosyrer parallelt med en signifikant økning av fri intracellulær glukose (Figur 3c). Vi observerte også reduserte nivåer av AMP og ADP fra dag 0 til DID 5 og en forbigående økning av ATP mellom DID 1 og DID 3. Disse dataene indikerer at fra dag 0 til DID 3, tilsvarende det tidsmessige vinduet der GPR17 når sitt maksimale uttrykk, brukte OPC-er hovedsakelig glukose og aminosyrer for å opprettholde kolesterol- og fettsyrebiosyntesen. Ved DID 5, som fremhevet av økte acyl-karnitinnivåer, er OPC sannsynligvis avhengig av fettsyreutnyttelse. Sammen indikerer disse dataene at OPC-er under fysiologisk differensiering gradvis omkobler sin energiske metabolisme til å bli modne myeliniserende OL-er.

3.3. Metabolomisk analyse etter GPR17 Silencing under OPC-modning in vitro

For å avsløre bidraget til GPR17-reseptoren i å drive energimetabolske endringer som skjer under celledifferensiering, utførte vi metabolomikk på GPR17--dempede OPC-er, sammenlignet med kontroll-OPC-er som mottar et kryptert RNA. Vi undersøkte først virkningen av GPR17-demping på OPC-modning ved immunfluorescensfarging for GPR17 og MBP. Som forventet, etter reseptordemping, fant vi en reduksjon i GPR17-farging, tydelig synlig ved 3 DID. Vi observerte også en markant økning i antall modne MBP-positive OL-er ved både 3 DID (ikke vist) og 5 DID (figur S2). Parallelt ble detaljert qPCR-analyse utført på fem tidspunkter (0, 1, 2, 3 og 5 dager i differensiering, DID), og avslørte, i kontroll OPC, en sterk økning i GPR17-uttrykk etter 1 DID, som når signifikante nivåer som starter etter 2 DID, en progressiv økning i MBP-ekspresjon opp til 5 DID og en signifikant reduksjon i den tidlige markøren NG2 (Figur 4a). Motsatt, etter GPR17-demping (Figur 4b), nådde GPR17 mRNA lavere nivåer ved DID1 og forble deretter stabilt lavt, MBP-ekspresjonen økte ytterligere og NG2 reduserte ytterligere. En direkte sammenligning av NG2- og MBP-uttrykk i GPR17-dempet versus kontroll-OPC-er på hvert tidspunkt er vist i figur 4c. Til sammen antyder disse resultatene at under disse eksperimentelle forholdene akselererte GPR17-demping i OPC-er deres differensieringsprosess. Deretter ble OPC metabolomics utført av LC-MS/MS på de fem valgte tidspunktene. Sammenligning av metabolomiske data hentet fra GPR17-dempede og kontrollerende OPCer på hvert tidspunkt gjorde det mulig for oss å identifisere metabolittene som er betydelig påvirket av GPR17-demping

Figur 3. (a) Grafen viser endringer i prosentandelen av GPR17 pluss og MBP pluss celler under differensiering. n=3 per gruppe; enveis ANOVA med Tukeys test. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Varmekartet viser metabolittoverflod i hver enkelt prøve stoppet ved 0, 1 , 3 eller 5 GJORDE. Overfloden av de analyserte metabolittene er representert av en kromatisk skala som strekker seg fra mørkeblått (svært lite forekomst) til mørkebrun (svært høy forekomst). n=4–5 per gruppe. (c) Metabolitter med en overflod som er signifikant forskjellig blant tilstandene (0, 1, 3 og 5 dager i differensiering, DID; enveis ANOVA med Fishers LSD-test).

Ved DID 1 (Figur 5a) fant vi ingen signifikante endringer. Ved DID 2 (figur 5b) fant vi en signifikant økning i noen metabolitter i Krebs-syklusen (malat, fumaratsitrat), en beskjeden økning i fritt karnitin (CO), acetyl-karnitin (C2), propionyl-karnitin (C3: 0), butyryl-karnitin (C4:0), valeryl-karnitin (C5:0), heksadekanoyl-karnitin (C16:0og en betydelig reduksjon i glukose , laktat, kreatin og ornitin. Reduksjonen av oljeaktat og kreatin og økningen av propionyl-karnitin (C3) ble også observert ved DID3 (Figur 5c). Ved DID 5 (Figur 5d) fant vi fortsatt en økning i fritt karnitin ( CO), acetylkarnitin (C2), propionylkarnitin (C3:0), butyrylkarnitin (C4:{{30}}), valeryl-karnitin (C5:0 )tetradekanoylkarnitin (C14:0), heksadekanoylkarnitin (C16:0), oktadekanoylkarnitinC18:0), oktadekenoylkarnitin (C18:1), på samme måte som det som opprinnelig ble observert i mer differensierte celler (se figur 3), en økning i dihydroksyaceton-3-fosfat/glyceraldehyd3-fosfat (DHAP/GAP), fumarat og sitrat, og en reduksjon i acetyl-CoA, Met-SOkreatin, taurin og karnosin.

Figur 4. Effekt av GPR17-demping på OPC-modning. Ekspresjonsnivåene til GPR17 (grønn), NG2blå) og MBP (rød) ble evaluert ved sanntids PCR under differensiering i kontrollforhold (celler transfektert med scramble RNA og etter GPR17 silencing (b), og normalisert versus ekspresjon ved T{{ 6}} (sett til 0). n=6 per hvert tidspunkt. Enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstester (a): ** p < {{10} }.001 VS DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 vs. DID 3-5; ## p < 0.01 mot dag 0; SSS p < {{30}}.001 VS DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 vs. DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 vs. dag 0, # p < 0,05, ### p < 0,001 vs. dag 0.S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) NG2- og MBP-uttrykk i GPR17-dempede OPCsvs. kontrollerer OPC-er (sett til 0) på hvert tidspunkt. Foldendring (FC) er rapportert som LOG,(FC). Én prøve t-test, * p < 0,05, * p < 0,01; *** p < 0,001 vs. relativ DID i kontroll OPC-er.

Figur 5. Metabolomiske endringer indusert av GPR17-demping i OPC-er. (a–d) Forekomsten av hver metabolitt etter GPR17-demping er normalisert til den i den relative kontrollprøven. De resulterende foldendringene ble brukt til å generere et vulkanplott for hvert tidspunkt (1, 2, 3, 5 dager i differensiering). Punktene over den stiplede horisontale linjen representerer metabolittene som har vist en statistisk signifikant endring (Fishers LSD korrigert med FDR; p.adj < 0.1). I grønt, metabolitter med lavere uttrykk, i rødt, de med høyere uttrykk, etter GPR17-demping. n=7–9 per hver gruppe. DID: dager i differensiering.

3.4. GPR17 modulerer laktatfrigjøring under OPC-modning

Basert på metabolomikk-resultatene beskrevet ovenfor, ble GPR17-demping funnet å redusere de intracellulære nivåene av laktat. For å vurdere om denne reduksjonen reflekterer en generell reduksjon i laktatmetabolisme eller en økt frigjøring av denne metabolitten, målte vi nivåene i cellelysater og i tilsvarende media på forskjellige tidspunkter. Som vist i figur 6, under kontrollforhold, nådde intracellulært laktat den høyeste forekomsten ved DID 2 (figur 6a) (når GPR17-reseptoruttrykket også er maksimalt), og deretter reduserte det når cellene ble modne. I stedet, etter GPR17-demping, ble økningen av intracellulært laktat opphevet, og nivåene sank ytterligere mot differensiering. Faktisk, en sammenligning av laktatnivåer i GPR17-dempede OPCer versus kontroll OPCer på hvert tidspunkt fremhevet en reduksjon i nivåene ved DID 2 og 3 (Figur 6b). Det ekstracellulære laktatet fulgte forskjellig kinetikk, og viste en signifikant reduksjon sammenlignet med DID 1 ved DID 2-3-5 i kontrollforhold, mens det i GPR17-dempede OPC-er holdt seg stabilt høyere og deretter signifikant redusert ved DID 5 (Figur 6c) ). Men når man sammenligner laktatnivåer på de forskjellige tidspunktene mellom de to eksperimentelle forholdene, hemmet GPR17-demping den fysiologiske reduksjonen,økende tilstedeværelse av laktati mediet ved DID 2 og 3 (Figur 6d),antyder økt utgivelse.

Figur 6. GPR17-demping i OPC endrer laktatmetabolismen. (a) Laktatoverflod under OPC-modning under kontrollforhold (grønn linje) og etter GPR17-demping (oransje linje). n=7–9 per gruppe. Enveis ANOVA med Tukeys test for flere sammenligninger. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 vs. DID1 siGPR17 (b ) Laktatnivåer etter GPR17-demping ble normalisert versus kontrollprøver (sett til 1) på hvert tidspunkt (n=7–9). ** p < 0,01; en prøve t-test. Kondisjonert media fra GPR17-dempet og kontroll OPC-er ble samlet inn fra den samme kulturen som ble brukt for metabolomisk analyse. Laktatnivåer i media ble evaluert ved LC-MS/MS. (c) Overfloden av laktat i det ekstracellulære rommet under OPC-modning under kontrollforhold (grønn linje) og etter GPR17-demping (oransje linje). Enveis ANOVA med Tukeys test for flere sammenligninger. ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. DID1 CTL; § p < 0,05 vs. DID5 siGPR17. (d) Ekstracellulære laktatnivåer etter GPR17-demping ble normalisert versus kontrollprøver (sett til 1) på hvert tidspunkt. * p < 0,05; ** p < 0,01; en prøve t-test. Effekten av MCT1-hemming i kontroll (e,g) og GPR17-dempede (f,h) OPCer har blitt evaluert ved å analysere uttrykket av MBP, i inhibitorbehandlede prøver vs. relative kontroller (kjøretøybehandlede) , ved 3 og 5 dagers differensiering. n=6 per gruppe.

En av mekanismene somOPC kan frigjøre laktater gjennom monokarboksylattransportøren MCT1. Videre rapporterte nyere studier at OPC-er selv kan skaffe ekstracellulært laktat gjennom MCT-reseptorer som fremmer cellesyklus og differensiering [39]. Derfor lurte vi på om den økte frigjøringen av laktat indusert av GPR17-demping kunne medieres av MCT1 og om dette kan være delvis ansvarlig for effekten observert på OPC-modning under de samme forholdene (figur 4). For dette målet behandlet vi OPC-er med AR-C155858, en selektiv hemmer av MCT1, under normal differensiering og etter GPR17-demping. Som forventet ble laktatfrigjøring vellykket hemmet under begge forholdene (figur S3). Effekten av MCT1-hemming på OPC-modning under de forskjellige eksperimentelle forholdene ble evaluert ved å analysere ekspresjonsnivåene til MBP. En beskjeden reduksjon i genuttrykket til MBP, som er nær statistisk signifikans (p=0.07), er kun funnet i prøver transfektert med spesifikt siRNA for GPR17 (figur 6e–h); ingen signifikant variasjon dukket imidlertid opp i prøvene transfektert med kontroll-RNA (siNEG). Disse resultatene tyder på at økningen i ekstracellulært laktat mediert av GPR17-nedregulering fremmer modningen av OPC; Den lille grad av MBP-reduksjon indikerer imidlertid at denne metabolitten ikke er den eneste faktoren som er involvert i prosessen.

3.5. Lipidomisk analyse etter GPR17 Silencing under OPC-modning

Resultatene av den transkriptomiske analysen etter GPR17-demping fremhevet også en potensiell sammenheng mellom funksjonen og de syntetiske banene til lipider og kolesterol, som er hovedkomponentene i myelin. For ytterligere å undersøke rollen til GPR17 i lipidmetabolisme, brukte vi LC-MS/MS på den lipidomiske analysen av GPR17-dempede OPC etter 2, 3 og 5 dager i differensiering, sammenlignet med dag 0. Listen over de analyserte lipidene, relative foldendringer og p-verdier er rapportert i tabell S4. De to mest tallrike lipidklassene i forsøksgruppene var fettsyrer og diacyl-fosfatidylkolin (PCaa)-familien. Under differensieringen av kontroll OPC-er fant vi ingen signifikante endringer i forekomsten av noen lipidklasse. I stedet viste GPR17-dempede OPC en trend mot en endret overflod av frie fettsyrer, ceramider, acyl-alkyl-fosfatidylkolin (PCae) og fosfatidylinositol (PI) sammenlignet med kontroll OPC, spesielt ved DID 3 og 5, men bare diacyl-fosfatidyletanolamin (PEaa) og sfingomyelin (SM) viste en statistisk signifikant endring (figur 7).

Figur 7. Endringer i overflod av lipidklasser indusert av GPR17-demping under OPC-differensiering. Overfloden av hver lipidklasse under kontrollforhold på forskjellige tidspunkter er rapportert (a) Kinetikken til hver lipidklasse etter GPR17-demping ble analysert: (b) fettsyrer, (C) ceramider (d) LysoPC (lysofosfatidyl-koliner), (e) LysoPE (lysofosfatidyletanolaminer), (f) PCaa(diacyl-fosfatidyl-koliner), (g) PCae (acyl-alkyl-fosfatidyl-koliner), (h) PEaa (di-acylfosfatidyl-etanolaminer), (i) PEae (acyl-alkyl-fosfatidyl-etanolaminer), (i) PI (fosfatidylinositoler), (k) PS (fosfatidyl-seriner), (D SM (sfingomyeliner). n=5 for hver gruppe. Kinetikk: Toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest siGPR17: Toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multiple sammenligningstest.* p.adi < 0.05, ** p.adi < 0,01.

Sammenligning av lipidomiske data hentet fra GPR17-demping og kontroller på hvert tidspunkt gjorde det mulig for oss å identifisere lipidene som ble betydelig påvirket av GPR17-demping. Etter 2 DID ble ingen signifikante endringer funnet (data ikke vist). Etter 3 DID var diacylfosfatidylkolin (PCaa) C40:4 mindre rikelig og diacyl-fosfatidyletanolamin PEaa) C34:3 var mer rikelig i GPR17-dempede OPCer (Figur 8a). Etter 5 dager med differensiering førte GPR17-demping til flere endringer i lipidoverflod: reduksjon av flere diacyl-PCer og diacyl-PE og en samtidig økning i flere plasmalogener (acylalkyl-PC) sammen med sfingomyelin (SM) C18:1 og SM (OH) C16:1 (Figur 8b). Disse dataene indikerer at nedreguleringen av GPR17 endrer lipidprofilen til hovedkomponenten i myelin som PC og PE.

Figur 8.Lipidomiske endringer indusert av GPR17-demping i OPC-er. (a,b) Overfloden av hvert lipid etter GPR17-demping er normalisert til det i den relative kontrollprøven. De resulterende foldendringene ble brukt til å generere en vulkanplott for hvert tidspunkt (3, 5 dager i differensiering). Punktene over den stiplede horisontale linjen representerer metabolittene som har vist en statistisk signifikant endring (Fishers LSD korrigert med FDR; p.adj < 0.1). I grønt, lipider med lavere uttrykk, i rødt, de med høyere uttrykk, etter GPR17-demping. n=5 per gruppe.

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: pluss 86 15292862950

BUTIKK:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop