Salmonella Enterica Serovars i fravær av TtrA- og PduA-gener forbedrer celleimmunresponsen under kyllinginfeksjoner

Salmonella spp. er en av de viktigste matbårne patogenene som er ansvarlige for å forårsake økonomiske tap for fjørfeindustrien og få konsekvenser for folkehelsen også. Både patogenets overlevelsesevne i tarmmiljøet under betennelse, så vel som deres forhold til vertens immunsystem, spiller en nøkkelrolle under infeksjoner hos fjørfe. Målet med denne studien var å kvantifisere tilstedeværelsen av makrofager og CD4+ /CD8+-cellepopulasjoner ved bruk av immunhistokjemiteknikken, i kommersielle avstamninger av kyllinger eksperimentelt infisert av villtype- og mutantstammer av Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium mangler ttrA- og pduA-gener. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA utløste en høyere prosentandel av det fargede området enn villtypen, med unntak av lette verpehøner. Salmonella Typhimurium villtype-stamme og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-infeksjoner fører til et lignende mønster der, ved 1 og 14 dpi, viste blindtarmmandlene og ileum hos fugler et mer ekspressivt farget område sammenlignet med 3 og 7 dpi. I alle avstamninger som ble studert, ble det observert fremtredende infiltrasjon av makrofager sammenlignet med CD4+- og CD8+-celler. Totalt sett viste dyr infisert av mutantstammen et positivt farget område høyere enn villtypen. Slettinger i både ttrA- og pduA-gener resulterte i en mer intens infiltrasjon av makrofager og CD4+- og CD8+-celler i vertsfuglene, noe som tyder på ingen patogendempning, selv i forskjellige Salmonella-stammer.

cistanche fordeler for menn styrker immunsystemet

Salmonella enterica er et matbåren patogen som provoserer tap for husdyr samt direkte innvirkning på folkehelsen. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) og Typhimurium (Salmonella Typhimurium) har hovedsakelig vært assosiert med matinfeksjoner i flere tiår. Mellom 1995 og 2010 ble Salmonella Enteritidis identifisert i 34,2 % av alle prøver som var positive for Salmonella spp1. I tillegg publiserte Winter et al.2 en betydelig studie som undersøkte den tetrationat-kodende genrollen, ved å velge serotypen Salmonella Typhimurium, men bruke mus som en eksperimentell modell. Når dette tas i betraktning, kan utdyping av kunnskapen vår om vert-patogen-interaksjon bidra til å forbedre kontroll- og utryddelsesmålinger. Flere faktorer er involvert i salmonellose-patogenesen, slik som patogenets evne til å replikere i et betent slimmiljø, avhengig av næringsopptak og anaerob respirasjon2. Tilgjengelighet av næringsstoffer garanterer imidlertid ikke bakteriell overlevelse i et konkurransedyktig miljø tett befolket av andre mikroorganismer. Salmonella entericas evne til å metabolisere tetrationat ved å bruke tetrationatreduktase for å produsere 1,2-propandiol som energikilde gir således en fitnessfordel. Dette enzymet består av TtrA, TtrB og TtrC. Den første subenheten som er sitert tilhører molybdopterin-superfamilien (MPT) og har et FeS-grensende domene som er involvert i reduksjonen av tetrationat til tiosulfat (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-propandiol brukes av bakterielle mikrorom (MCP). Denne strukturen består av syv forskjellige proteiner, hvorav PduA er hovedkomponenten i MCP-strukturen5. For det første omdannes 1,2-propandiol til propionaldehyd, som igjen reduseres til propanol og propionat ved propandioldehydrataseaktivitet. Denne prosessen genererer ATP ved fosforylering, en elektron (1-propanol) gradient til NAD-regenerering, og et mellomledd (propionyl-CoA) som kan brukes som karbon og energikilde gjennom metylsitrat via, og er avhengig av B12-vitamin syntetisert på en endogen måte6. Under kyllinginfeksjoner blir Salmonella enterica serovars evne til å invadere og overleve i tarmepitelcellene og makrofagene etterfulgt av immunresponsunndragelse7. I den sammenheng er infeksjonen en kritisk fase som avhenger av interaksjonen mellom bakterie- og vertsceller og bakteriell evne til å overvinne tarmepitelbarrierene for å garantere kolonisering og replikasjon. Ikke desto mindre aktiverer den de inflammatoriske og immunresponsene8 som fører til endocytose og fagocytose av henholdsvis epitel- og antigenpresenterende celler (APC). Den antimikrobielle aktiviteten til disse cellene utløser en medfødt respons via makrofager, og den adaptive immunresponsen er avhengig av aktivering av CD4+ og CD8+9. For å kaste lys over vert-patogen-interaksjonene bak tarminfeksjonen av Salmonella hos kyllinger, evaluerer vi populasjonen av immunsystemceller under tarmkolonisering og systemisk infeksjon hos fugler av kommersielle avstamninger utfordret av villtype mutantstammer av Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium , som bærer slettinger i gener relatert til metabolisering av tetrationat (ttrA) og 1,2-propandiol (PDU).

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Resultater

Eksperiment 1—Salmonella Enteritidis utfordring.

Resultatene av å kvantifisere tilstedeværelsen av immunresponscellene i blindtarmmandler, blindtarm, ileum og lever fra slaktekylling, lette verpehøner og halvtunge verpehøner er vist i tabell 1, 2 og 3. Vi fant flere CD 4+ og makrofagcelleinfiltrasjon fra slaktekyllinger utfordret med Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) enn fra slaktekyllinger utfordret med Salmonella Enteritidis villtypestamme (wt-SE) eller ikke-infiserte fugler, i alt evaluert vev. Et unntak ble funnet for CD4+-celleinfiltrasjon ved 3 dpi i caecal-mandlene, ileum og leveren, og for makrofaginfiltrasjon ved 3 og 14 dpi i leveren fra SEΔttrAΔpduA-utfordrede slaktekyllinger. Dessuten ble antallet infiltrerte CD8+-celler observert i en større mengde fra fugler utfordret med SEΔttrAΔpduA ved 1 og 7 dpi i blindtarmen og leveren, ved 3 dpi i blindtarmmandlene og 14 dpi i ileum. I kontrast hadde wt-SE-utfordrede fugler høy infiltrasjon av CD8+-celler i ileum og caecal-mandlene ved henholdsvis 1 og 7 dpi (Tab. 1; Supplerende Fig. S1). Tabell 2 og tilleggsfigur S2 viser CD4+ og CD8+, og makrofaginfiltrasjon funnet i vev fra halvtunge verpehøner. Generelt var det stor variasjon mellom områdene med celleinfiltrater både når det gjelder utfordringsstammen og vevet som ble studert. Fugler utfordret med SEΔttrAΔpduA viste høyere områder dekket av CD4+-celler (i ileum ved 1 og 14 dpi, og lever ved 7 dpi), og makrofager (i ileum ved 7 dpi, og lever ved 3, 7 og 14 dpi), enn i det samme vevet til wt-SE-utfordrede fugler. På den annen side ble CD8+-celler funnet i større mengder i caecal-mandler (ved 1 og 7 dpi) og blindtarm (ved 3 dpi) hos fugler utsatt for wt-SE-stamme. Ulikt observert hos slaktekyllinger og halvtunge verpekyllinger, utløste Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA en mindre intens immunrespons celleområder enn villtypen, i utfordringen fra lette verpehøner. Wt-SE-utfordrede fugler viste større CD4+ infiltrasjonsområder i blindtarmmandlene (ved 1 og 3 dpi), blindtarm (ved 3, 7 og 14 dpi), ileum (ved 1 og 7 dpi) og lever (ved 14 dpi). På samme måte har utfordringer med SEΔttrAΔpduA resultert i reduserte infiltrasjonsområder av både CD8+ i blindtarmmandlene (ved 1 dpi) og ileum (ved 7 og 14 dpi), og makrofager i blindtarmmandlene og blindtarmen (ved 3 dpi), sammenlignet med wt-SE-utfordrede fugler. Ingen signifikante endringer i immunsystemcelleområdet til CD8+ og makrofagceller ble observert i leveren fra både SEΔttrAΔpduA og wt-SE-utfordrede fugler. De detaljerte resultatene av utfordringen med lette verpehøner er vist i tabell 3 (se tilleggsfigur S3).

Tabell 1. Representasjon av den signifikante forskjellen knyttet til den kvantitative fordelingen av forskjellige immunresponsceller i organer fra slaktekyllinger infisert med Salmonella Enteritidis ville og mutante stammer på forskjellige dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villtype; ns, ingen vesentlig forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell ved toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.05; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0,001; ****P Mindre enn eller lik 0,0001). Stammen presentert i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant innenfor organet og DPI er den som er vist hovedinfltasjonsområdet til hver celle.

Tabell 2. Representasjon av den signifikante forskjellen knyttet til den kvantitative fordelingen av forskjellige immunresponsceller i organer fra halvtunge verpehøner infisert med Salmonella Enteritidis ville og mutante stammer på forskjellige dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villtype; ns, ingen vesentlig forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell ved toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.{{10}}5 ; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0.001; ****P Mindre enn eller lik 0.0001). Stammen presentert i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant innenfor organet og DPI er den som er vist hovedinfltasjonsområdet til hver celle.

Tabell 3. Representasjon av den signifikante forskjellen knyttet til den kvantitative fordelingen av ulike immunresponsceller i organer til lette verpehøner infisert med Salmonella Enteritidis ville og mutante stammer på ulike dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villtype; ns, ingen signifikant forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell med toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.{{10}}5 ; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0.001; ****P Mindre enn eller lik 0.0001). Stammen presentert i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant innenfor organet og DPI er som viser det viktigste infiltrasjonsområdet til hver celle.

cistanche planteøkende immunsystem

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eksperiment 2—Salmonella Typhimurium-utfordring.

Resultatene av å kvantifisere tilstedeværelsen av immunresponscellene i cecal mandler, blindtarm, ileum og lever fra slaktekyllinger, halvtunge verpehøner og lette verpehøner er vist i henholdsvis tabell 4, 5 og 6. Totalt sett viste slaktekyllinger infisert av mutantstammen et positivt markert område høyere enn de som ble utfordret med Salmonella Typhimurium villtype stamme (wt-STM) på alle fire prøvetakingsdagene. Dessuten ble ingen endringer i immunresponsceller observert i de uinfiserte kontrollgruppene. CD4+-celleområdene i alle vev hos slaktekyllinger nådde en statistisk forskjell ved 1 dpi, med større infiltrasjoner for utfordringen med Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). En signifikant forskjell mellom området for den kvantifiserte immunresponsen fra STM∆ttrA∆pduA- og wt-STM-utfordrede fugler hadde vært, med større infiltrasjoner når utfordringen var med mutantstammen i blindtarmen og ileum ved 1 dpi, og lever ved 14 dpi (CD8+ celler); i blindtarmen, ileum og leveren ved 1 og 14 dpi (makrofager) (tabell 4; Supplerende fig. S4). Resultatene fra halvtunge verpefugler viste ingen statistisk forskjell mellom mutant- og villtypestammeutfordringer for CD4+-celler i blindtarmen, og CD8+-celler i blindtarmmandlene og ileum i alle 4 dager etter infeksjoner evaluert (tabell 5; Supplerende Fig. S5). Men når et signifikant konsentrasjonsområde av immunsystemceller ble observert, ble de halvtunge verpehønene utfordret av STM∆ttrA∆pduA: hovedmakrofagers infiltrasjonsområde i alle vev som ble studert (ved 1 og 14 dpi); et stort infiltrasjonsområde av CD4+-celler i caecal-mandlene og leveren (ved 1, 7 og 14 dpi) (tabell 5; tilleggsfig. S5). Tabell 6 og tilleggsfigur S6 viser infiltrasjon av CD4+, CD8+ og makrofager funnet i vev til lette verpehøner. Fugler utfordret med STM∆ttrA∆pduA viste store immunsystemcelleareal av CD4+ og makrofagceller i caecal mandler og blindtarm (ved 14 dpi), og ileum (ved 1 og 14 dpi) sammenlignet med immunresponsceller område av det samme vevet fra wt-STM-utfordrede fugler. Det var ikke funnet noen statistisk forskjell for CD8+-infiltrasjonsområdet i blindtarmmandlene, blindtarmen og ileum fra utfordrede fugler. I motsetning til resultater oppnådd i andre vev, hadde leveren fra STM∆ttrA∆pduA-utfordrede fugler et mer ekspressivt farget område av immunresponsceller for CD4+- og CD8+-celler ved alle fire dpi, og makrofager ved 1 og 14 dpi.

Tabell 4. Representasjon av den signifikante forskjellen relatert til den kvantitative fordelingen av forskjellige immunresponsceller i organer til slaktekyllinger infisert med Salmonella Typhimurium ville og mutante stammer på forskjellige dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villtype; ns, ingen vesentlig forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell ved toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.05; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0,001; ****P Mindre enn eller lik 0,0001). Stammen presentert i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant innenfor organet og DPI er den som er vist hovedinfltasjonsområdet til hver celle.

Tabell 5. Representasjon av den signifikante forskjellen relatert til den kvantitative fordelingen av forskjellige immunresponsceller i organer fra halvtunge verpehøner infisert med Salmonella Typhimurium ville og mutante stammer på forskjellige dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villtype; ns, ingen vesentlig forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell ved toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.{{10}}5 ; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0.001; ****P Mindre enn eller lik 0.0001). Stammen presentert i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant innenfor organet og DPI er den som er vist hovedinfltasjonsområdet til hver celle.

Tabell 6. Representasjon av den signifikante forskjellen knyttet til den kvantitative fordelingen av ulike immunresponsceller i organer til lette verpehøner infisert med Salmonella Typhimurium ville og mutante stammer på ulike dager etter infeksjon. DPI, dager etter infeksjon; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villtype; ns, ingen signifikant forskjell. Innenfor hvert organ og DPI betyr * forskjell med toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis sammenligningstest mellom verdier for ville og mutante stammer (*P Mindre enn eller lik 0.{{10}}5 ; **P Mindre enn eller lik 0.01; ***P Mindre enn eller lik 0.001; ****P Mindre enn eller lik 0.0001). Stammen presentert i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant innenfor organet og DPI som viser hovedinfiltrasjonsområdet til hver celle.

Diskusjon

Bakterier, når de utsettes for anaerobe forhold, kan bruke tetrationat og 1,{1}}propandiol metabolske substrater for energi- og respirasjonskilder10. Salmonella spp. har lenge vært gjenstand for undersøkelser av hvordan sletting av gener som er kjent for å være ansvarlige for disse banene ville påvirke deres overlevelse i verten. Så vidt vi vet, ble bare en studie som undersøkte samtidig tetrationat- og propandiol-kodende genroller publisert. Vår forskningsgruppe rapporterte effekten av disse slettingene ved å evaluere systemisk infeksjon og fekal utskillelse av Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium i kommersielle avstamninger av kyllinger11. For å øke diskusjonen om dette emnet, fremhevet de nåværende resultatene immuncellen infiltrert i forskjellige vev av kyllingavstamninger utfordret med både villtype- og mutantstammer som bærer slettinger i ttrA- og pduA-gener. I løpet av 2-ukeeksperimentet følger de positivt fargede områdene av CD4+- og CD8+-celler og makrofager stort sett et lignende mønster, der ved 1 og 14 dpi gir et høyere antall immunresponser celler. Dette kan forklares med den primære kontakten til vertsforsvarssystemet når patogenet invaderer. Den forrige rapporten har vist at hos kyllinger som er infisert, selv når Salmonella ikke skilles ut ved 12 dpi, kan infeksjonen bli positiv ved kloakalpinne fra 13 dpi12, noe som forklarer hvorfor immunsystemets celleområder ved 3 og 7 dpi var lavere, men tilbake til en økning . Ved første øyekast ville det forventes at den fremkalte responsen fra verten ville bli redusert når både pduA og ttrA ble slettet siden disse genene spiller en viktig rolle i overlevelsen under infeksjon med Salmonella2,4,13–15. Imidlertid viste resultatene våre som sammenlignet en dobbel mutant som mangler begge genene det motsatte, mutantstammene av Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium utløste høyere immunresponsceller enn de ville typene av stammer.

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Et kortest farget område kan føre til et høyt antall kolonier på tarmkanalen, noe som bekrefter en tidligere studie, der Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-stammer ble gjenvunnet i høyere antall fra kloakal-korrelerte vattpinner enn deres 11 . Salmonella kan oppføre seg som en ekstracellulær eller en intracellulær bakterie, avhengig av tilgjengelig næringsrepertoar, og skjer som en veksling mellom intestinal kolonisering og internalisering til vertsceller16. Når bakteriene inntas og drepes av makrofager, overføres noen peptidfragmenter til overflaten av den antigenpresenterende cellen, og kodes av det store histokompatibilitetskomplekset (MHC), klasse II. Denne bindingen mellom peptid og MHC II stimulerer T CD4+-lymfocyttene. Men hvis bakteriene bestemmer seg for å invadere vertscellen og gå inn i cytoplasmaet til makrofagen, stimulerer peptidforbindelsen med en annen type MHC, klasse I, T CD8+ lymfocyttproduksjon17. Interessant nok presenterer CD4+- og CD8+-celler det samme mønsteret av makrofagene gjennom hele eksperimentet, og representerer til og med forskjellige immunresponser. Siden CD4+- og CD8+-celler hovedsakelig representerer T-lymfocytter som er en del av den adaptive immunresponsen, er makrofagene en del av den medfødte immunresponsen9. I tillegg til dette observerte vi at slaktekyllinger presenterer mer uttrykksfulle positive markerte områder enn verpehøner, bekreftet av en tidligere studie der slaktekyllinger utfordret med mutante stammer viste for eksempel mer invasiv tarmkolonisering og systemisk infeksjon11. Våre funn tyder på at immunhistokjemi-tilnærmingen gir interessant informasjon om oppførselen til immunresponsceller på flere organer av forskjellige kommersielle avstamninger under infeksjon med Salmonella enterica serovars. Dessuten viser den nåværende studien at sletting av begge genene, selv i forskjellige stammer av Salmonella, resulterte i bakterier som fremkalte en høyere immunresponscelle i verten, noe som viser at patogenet ikke har blitt svekket. Vi kan vurdere at Salmonella kanskje var i stand til å finne en annen overlevelsesmekanisme som ble enda mer patogen. Bruken av ttr- og pdu-operoner i samsvar med cob- og PRP-operoner har i den forrige studien blitt vist som nødvendig for anaerob respirasjon16, noe som førte til at vi tror at det ikke bare kreves for å slette flere gener fra hver operon18, men vi har også å vurdere å slette hele dette settet, for å nå mindre patogene stammer av Salmonella enterica.

Materialer og metoder

Eksperimentene, utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter, ble godkjent av den etiske komiteen for bruk av dyr ved Sao Paulo State University (CEUA/Unesp Process—006621/18; 10. mai 2018), ble utført i Avian Pathology Laboratoriet ved Institutt for patologi, teriogenologi og én helse fra School of Agricultural and Veterinary Sciences, Sao Paulo State University (FCAV/ Unesp), Jaboticabal, Brasil.

Bakteriestammer og mutantkonstruksjon.

Bakteriestammene som ble brukt her ble lagret i et kryobeskyttende medium sammensatt av Lysogeny-buljong (LB; BD DifcoTM, USA) supplert med 30 % glyserol (Merck, BR—H30402394 228) og oppbevaring i en ultrafryser (- 80 grader) ved Avian Pathology Laboratory fra FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (tilgangsnummer: AM933172) og Salmonella Typhimurium str. 9819 ble indusert til nalidiksinsyre- og spektinomycin-resistens (Nalr Spcr ) og de ga den genetiske bakgrunnen for å konstruere mutante stammer ved Lambda-rød teknikk20 med mindre modifikasjoner, beskrevet i Saraiva et al.11. Mutante bakterier konstruert her er identifisert på teksten som SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) og STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

In vivo eksperiment.

Eksperiment 1—Salmonella Enteritidis. Trettiseks 1-daggamle kyllinger fra hver av tre forskjellige avstamninger (broiler, halvtunge verpehøner og lette verpehøner), totalt hundre og åtte dyr, ble hentet fra kommersielle klekkerier. Ved ankomst ble bunnen av transportkortboksene undersøkt for å bekrefte Salmonella-fri status for fuglene21, og dyrene ble holdt i metallbur inne i det akklimatiserte rommet og fikk antibiotikafritt fôr og vann ad libitum. Et 24-t lysprogram ble valgt den første dagen for å sikre optimalt vann- og matinntak, deretter ble et 12-t lysprogram tatt i bruk den første uken, og gikk ned til 8 timer på de resterende dagene. Inokulumet ble fremstilt i henhold til Berchieri Junior et al.22. For dette ble de frosne kulturene inokulert i LB og inkubert over natten ved 37 grader under 15 0 rpm. Dagen etter ble bakteriekulturene overført til ferske medier og inkubert i 18 timer under de samme forholdene som tidligere. Deretter ble 0,2 ml fra kulturene som inneholdt 108 kolonidannende enheter per ml (CFU/ml) oralt inokulert med metallisk sonde direkte inn i fuglenes avling. Ni grupper ble dannet (A til I) og tilfeldig delt i henhold til de forskjellige avstamningene og stammene (tabell 7). En-, tre-, syv- og 14-dager etter infeksjon (dpi) ble tre fugler per gruppe hver dag, om morgenen, avlivet ved cervikal dislokasjon for å høste den mediale delen av caecal-mandlene, caecum, og ileum, og den distale delen av venstre leverlapp for videre immunhistokjemi (IHC) analyse. For dette ble prøver nedsenket i n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brasil) tidligere nedkjølt i flytende nitrogen. Umiddelbart etter vevsfrysingen ble det overført til et 2 mL kryorør (Corning, USA) og kondisjonert i flytende nitrogen. Etter prøvetaking ble vevene lagret ved -80 grader frem til prosessen for IHC.

Eksperiment 2—Salmonella Typhimurium. Dette eksperimentet ble utført etter de samme karakteristikkene nevnt ovenfor i eksperiment 1. 36 kyllinger (1 dag gamle) ble tilfeldig delt inn i ni grupper (A til I) basert på deres avstamning og stammer (tabell 7).

Tabell 7. Etablerte grupper i henhold til de ulike slektene og stammene. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villtype; wt-STM, Salmonella Typhimurium villtype; NC, negativ kontroll.

Immunhistokjemi.

Vevsseksjon. De innsamlede prøvene ble overført fra -80 grader til kryostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Tyskland) ved -22 grader hvor de ble individuelt blokkert i OCT-forbindelse (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Nederland) per 30 minutter før til 6 µm seksjon ved bruk av engangsblader med lav profil (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Tyskland). Det er bemerkelsesverdig at seksjoner ble gjort ved -22 grader, bortsett fra leverseksjoner, som ble gjort ved -15 grader. Objektglass som inneholdt tre repetisjoner av seksjoneringen av hvert organ per immuncellerespons merket ble fremstilt, med tynning mellom hver repetisjon. Ved hjelp av en pensel ble vevssnittssnittene plassert på histologiske objektglass forhåndsbehandlet med poly-l-lysin (Sigma-Aldrich, Storbritannia, Kat.nr. P4832) og silan (Sigma-Aldrich, USA. Kat.nr. 440574). Objektglassene ble lagret ved -20 grader deretter inntil IHC-farging. Farging av immunceller. Først ble objektglassene nedsenket i 200 ml avkjølt aceton (Acetone PA-ACS, Synth, Brasil) og inkubert ved -20 grader i 10 minutter. Etter det ble objektglassene overført til et fuktighetskammer (EasyPath®, Brasil) ved romtemperatur i 5 minutter for å tørke prøvene. Objektglassene ble deretter vasket med PBS og en sølepytt ble stående i 5 minutter for å unngå vevsdehydrering. Ti ble vev nedsenket i 200 ml 4% H2O2 per 10 min på et mørkt sted og vasket igjen med PBS. Området rundt vevssnittene ble tørket med absorberende papir og prøven ble forbigått av en hydrofob penn (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danmark). Vasketrinnet som forlot en sølepytt ble gjentatt som tidligere. Det biotinfrie settet Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) ble brukt til å farge immuncellene, ved å velge Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC)-metoden. For dette ble kulpen fjernet, og ikke-spesifikke bakgrunnsfargeblokkeringsreagensdråper ble tilsatt til vevene. Objektglassene ble holdt inne i fuktighetskammeret på et mørkt sted i 30 minutter, vasketrinnet ble gjentatt, og 200 µL primært antistoff (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) fortynnet i en andel på 1:200 (v/v) i antistofffortynningsreagensen (Antibody diluent, Abcam©, USA) ble deretter tilsatt. Objektglassene ble inkubert ved 4 grader i 18 timer. Dagen etter ble objektglassene vasket som tidligere. Ti dråper av det sekundære antistoffet (Reveal Complement, Abcam©, USA) ble tilsatt etter fjerning av overskudd av PBS, og fuktighetskammeret ble plassert i en mørk omgivelse i 30 minutter. Deretter ble en dråpe 3,3′-diaminobenzidin (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) fortynnet i 1 mL substrat (DAB Substrate, Abcam©, USA), hvilket volum er nok til tre objektglass, og tilsatt til vevssnittene. Ett minutt senere ble objektglassene nedsenket i 200 ml dH2O i 5 minutter. Etter det ble de overført til en plastkube som inneholdt Harris hematoxylin (Êxodo Científca, Brasil) og ble stående i 1 min. Posteriort ble objektglassene vasket i 10 minutter under rennende vann ved lavt trykk. Objektglassene ble underkastet alkohol-xylen-serien (70 % alkohol, 90 % alkohol, 100 % alkohol, xylen I og xylen II). Til slutt ble dekkglassene plassert på objektglassene etter tilsetning av en dråpe vannfritt monteringsmedium (Entellan®, Merck, Brasil). Bilder fra vevssnittene ble tatt tilfeldig, ved å velge fem tilfeldige visningsfelt, ved bruk av et optisk mikroskop (linse 400×) (Coleman®, modell N-120) med en digitalkameraadapter, for ytterligere statistisk analyse (fig. 1) ).

Dataanalyse.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Prosentandelen av CD{0}}- og CD8+-celler og makrofager ble beregnet ved å bruke Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). De ble kvantifisert som prosentverdier av immuncellemarkøren positivt areal/totalt areal. Statistisk analyse og grafikk ble utført ved hjelp av programvaren GraphPad Prism v.8.0.1 for macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA) og data ble sendt til Variance Analysis (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni-sammenligninger, vurderer et signifikansnivå lavere enn 5 % (P Mindre enn eller lik 0,05).

Figur 1. Utsnitt av blindtarmen til slaktekylling infisert av Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA som viser immunreaksjoner i makrofager, 7 dager etter infeksjon (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase, motfarget med Hematoxylin).

Referanser

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Kilder til human ikke-tyfus salmonellose: En gjennomgang. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. Tarmbetennelse gir en respiratorisk elektronakseptor for Salmonella. Nature 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Spesifisitet av respirasjonsveier involvert i reduksjon av svovelforbindelser av Salmonella enterica. Microbiology (Reading) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Tarmbetennelse gjør at Salmonella kan bruke etanolamin for å konkurrere med mikrobiotaen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Regulering av fukose og 1,2-propandiolutnyttelse av Salmonella enterica serovar Typhimurium. Front. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Propionatkatabolisme i Salmonella Typhimurium LT2: To divergent transkriberte enheter omfatter prp-lokuset ved 8,5 centisomer, prpR koder for et medlem av sigma-54-familien av aktivatorer, og prpBCDE-genene utgjør en operon. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Sammenligning av 3 kulturmetoder og PCR-analyser for påvisning av Salmonella Gallinarum og Salmonella Pullorum i fjørfefôr. Poult. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Dynamikk av immuncelleinfiltrasjon i caecal lamina propria hos kyllinger etter neonatal infeksjon med en Salmonella Enteritidis-stamme. Dev. Comp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do sistema immune. I Doenças das Aves (red AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Det alternative elektronakseptortetrationatet støtter B12-avhengig anaerob vekst av Salmonella enterica serovar Typhimurium på etanolamin eller 1,{{4} }propandiol. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Dechiffrere rollen til ttrA- og pduA-gener for Salmonella enterica serovars i en kyllinginfeksjonsmodell. Avian Pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Kryssreaktive cellulære og humorale immunresponser på Salmonella enterica serovars Typhimurium og Enteritidis er assosiert med beskyttelse mot heterolog re-utfordring. Vet. Immunol. Immunopatol. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ En fantastisk bragd: For å konkurrere med tarmmikrobiotaen driver Salmonella verten til å gi en respiratorisk elektronakseptor. Tarmmikrober 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Salmonella bruker energitaxier for å dra nytte av tarmbetennelse. PLoS Pathog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Dynamiske interaksjoner mellom Salmonella og mikrobiota, innenfor den utfordrende nisjen i mage-tarmkanalen. Int. Sch. Res. Ikke. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzym IIANtr regulerer Salmonella-invasjon via 1,2-propandiol og propionatkatabolisme. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Vertsforsvar mot bakterielle patogener: Forsvar av vev og blod. I Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (red. Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg side-step gen tap av respiratoriske krav i en kyllinginfeksjonsmodell. Mikrob patog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Reduksjon i fekal utskillelse av Salmonella Typhimurium-stamme F98 hos kyllinger vaksinert med liv og drepte S. Typhimurium-organismer. Epidemiol. Infisere. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Ett-trinns inaktivering av kromosomale gener i Escherichia coli K-12 ved bruk av PCR-produkter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. undersøkelse i transportkasse av daggamle fugler. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Observasjoner på persistens og vertikal overføring av Salmonella enterica serovars Pullorum og Gallinarum hos kyllinger: Effekt av bakteriell og vertsgenetisk bakgrunn. Avian Pathol. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).