Kjønnsspesifikk medfødt immunitet og aldring hos langlivede ferskvannskilpadder (Kinosternon Favescens: Kinosternidae)

Abstrakt

Bakgrunn

Den progressive dereguleringen av immunsystemet med alderen, kalt immunosenescens, har blitt godt studert i pattedyrsystemer, men studier av immunfunksjon i langlivede, ville, ikke-pattedyrpopulasjoner er knappe. I denne studien utnytter vi en 38-årig mark-recapture-studie for å kvantifisere relasjonene mellom alder, kjønn, overlevelse, reproduksjonseffekt og det medfødte immunsystemet i et langlivt reptil, gule gjørmeskilpadder (Kinosternon favescens;testudiner; Kinosternidae).

cistanche supplement fordeler-øke immunitet

Metoder

Vi estimerte overlevelsesrater og aldersspesifikk dødelighet etter kjønn basert på mark-recapture data for 1530 voksne kvinner og 860 voksne menn over 38 år med fangst. Vi analyserte bakteriedrepende kompetanse (BC), og to immunresponser mot fremmede røde blodlegemer - naturlig antistoffmediert hemagglutinasjon (NAbs), og komplementmediert hemolyseevne (Lys) - hos 200 voksne (102 kvinner; 98 menn) som varierte fra 7 til 58 år fanget i mai 2018 under oppkomsten fra brumation, og for hvilke reproduksjonsproduksjon og langsiktige mark-recapture data var tilgjengelige.

Resultater

Vi fant at kvinner er mindre og lever lenger enn menn i denne populasjonen, men akselererende dødelighet i voksen alder er den samme for begge kjønn. I kontrast viste menn høyere medfødt immunitet enn kvinner for alle tre immunvariablene vi målte. Alle immunresponser varierte også omvendt med alderen, noe som indikerer immunosenescens. For hunner som reproduserte seg i forrige reproduksjonssesong, økte eggmassen (og dermed total clutchmasse) med alderen. I tillegg til immunosenescens av bakteriedrepende kompetanse, hadde hunner som produserte mindre clutch også lavere bakteriedrepende kompetanse.

Konklusjoner

I motsetning til det generelle virveldyrmønsteret med lavere immunrespons hos menn enn kvinner (muligens gjenspeiler de undertrykkende effektene av androgener), fant vi høyere nivåer av alle tre immunvariablene hos menn. I tillegg, i motsetning til tidligere arbeid som ikke fant bevis for immunosenescens hos malte skilpadder eller rødørede skyveskilpadder, fant vi en reduksjon i bakteriedrepende kompetanse, lyseringsevne og naturlige antistoffer med alderen hos gule gjørmeskilpadder.

Nøkkelord

Medfødt immunfunksjon, reptil, alderdom, kjønnsspesifikk, aldring

cistanche supplement fordeler-øke immunitet

Bakgrunn

Aldring i mange virveldyrsystemer er preget av organismal senescens – synkende effektivitet og ytelse av fysiologiske og cellulære prosesser [1] som fører til synkende aldersspesifikk overlevelse og fertilitet med økende alder [2]. Studier av aldring i ville populasjoner av virveldyr har ofte fokusert på å kvantifisere aldersrelaterte endringer i fruktbarhet og dødelighet [3], men sjeldnere på fysiologiske mekanismer som kan bidra til slik demografisk aldring (f.eks. [4–6]). En slik fysiologisk kandidatmekanisme er immunfunksjon, som spiller en kritisk rolle for overlevelse. Redusert immunfunksjon har vist seg å påvirke overlevelse og reproduksjon negativt [6–8]. Den progressive dereguleringen av immunsystemet med alderen, kalt immunosenescens, har blitt godt studert hos mennesker for både medfødt immunitet (hvis dysregulering med alderen kan føre til kronisk betennelse [9]), og ervervet immunitet, der de best studerte endringene er en økning i minne T-celler og reduksjon i naive T-celler med økende alder (men også her forblir immunosenescens gåtefull [10]). Aldersspesifikke endringer i immunsystemet til langlivede, ville, ikke-pattedyrpopulasjoner er imidlertid ikke godt beskrevet i litteraturen, og studier som fokuserer på reptilimmunosenescens er til og med sjeldne (gjennomgått i [8]). Organismisk senescens, som gir opphav til demografisk senescens i populasjoner, utviklet seg i naturen. Dermed er studier på naturlige populasjoner godt posisjonert for å avsløre evolusjonært bevarte senescentprosesser som er mulige begrensninger for hvordan aldring oppstår. Samtidig gir studier av organismer og demografisk alderdom i naturen realistiske økologiske kontekster og avslører i hvilken grad aldringsmekanismene er fleksible. Spesielt har krypdyr mange funksjoner som anbefaler dem for studier av mekanismene for senescens, inkludert immunosenescens. For det første er de søsterkladen til pattedyrene, som sammen danner den monofyletiske kladden av fostervann; immunfunksjon og cellesignalveier er sterkt bevart på tvers av fostervann (gjennomgått i [11]). For det andre viser reptiler flere fenotyper som tillater studiet av senescens på tvers av en rekke fysiologiske og morfologiske sammenhenger, noe som ikke er mulig i de fleste pattedyrarter (f.eks. hypoksi-resistens, frysetoleranse, gift, rustning, varmetoleranse, gjennomgått i [8 ]). Med unntak av fugler er krypdyr poikilotermiske, og mange fortsetter å vokse som voksne (f.eks. [12] men se [13]) og øker fruktbarheten med alderen ([14–17], gjennomgått i [8]). Videre har mange reptillinjer unike morfologiske trekk. Eksempler på sistnevnte inkluderer beskyttende fenotyper - som ytre ribben hos skilpadder og gift hos noen slanger. Nyere fylogenetiske analyser av aldringsrater for dødelighet viste sterk støtte for hypotesen om at reptillinjer med beskyttende fenotyper hadde lengre liv og langsommere aldring enn pattedyr av lignende størrelse, spesielt på tvers av skilpadder [18], (se også [19, 20]). Faktisk, på tvers av 300 arter av villprøvede tetrapoder [18], var skilpadder unike ved at hele avstamningen var preget av arter med nesten ubetydelig dødelighetsaldring og lang levetid – en følelse speilet i fangenskap [21]. Gitt at veksten (og derfor fruktbarheten) kan fortsette over den voksne levetiden, kan seleksjon mot skadelige mutasjoner med senaldrende fenotyper være sterkere i eldre aldre hos skilpadder og andre krypdyr med disse egenskapene i forhold til pattedyr (som i [22]). Disse egenskapene antyder at immunosenescens kanskje ikke manifesterer seg på samme måte hos reptiler sammenlignet med andre amniote vertebrater, som pattedyr eller fugler, og kan til og med være fraværende på grunn av selektivt press på å opprettholde immunfunksjonen med økt reproduksjon (f.eks. [5]) . Her fokuserer vi på å utvide det komparative landskapet for aldringsstudier hos skilpadder for å fremme bruken av dem som modeller for langsom aldring. Immunsystemet til skilpadder, som andre fostervann, inkluderer medfødte og ervervede komponenter (gjennomgått i [23]), men nyere analyser tyder på at reptiler kan stole sterkere på medfødt forsvar i forhold til pattedyr og fugler [24]. Spesifikt, selv om reptiler har B- og T-celler assosiert med adaptiv immunitet, kan den tradisjonelle adaptive raske responsen ved sekundær eksponering for patogener stole mer på medfødt immunitet [24]. Det er en voksende litteratur om aldersassosierte mønstre av medfødt immunitet hos ektotermiske reptiler [4, 25-27], som gir en første forsvarslinje mot fremmede patogener. Samtidig har studiet av kjønnsforskjeller i både organismal senescens og demografisk aldring utvidet seg til bedre fylogenetisk dekning, inkludert reptiler [28]. Viktigere er at disse studiene er mulige i ville populasjoner bare med evnen til nøyaktig å elde individer, noe som krever langtidsstudier for langlivede arter ([29, 30], gjennomgått i [31]). Vi legger også til denne litteraturen ved å undersøke aspekter av kjønns- og aldersspesifisitet av medfødt immunitet, overlevelse, kvinnelig reproduksjon og forhold mellom dem i et langlivet reptil. Vi utnytter en 38-års mark-gjenfangst studie av kjente alder gule gjørme skilpadder (Kinosternon favescens) for å kvantifisere sammenhengene mellom alder, kjønn, overlevelse og reproduksjon på det medfødte immunsystemet som en integrerende tilnærming til å forstå immunosenescens. I likhet med andre skilpadder ble denne arten funnet å ha langsom aldring når kjønnene betraktes sammen [18]. Spesifikt vurderte vi tre medfødte immunmål - sirkulerende naturlige antistoffer, komplementmediert lyseringsevne og bakteriedrepende kompetanse av plasma - i vår langsiktige studiepopulasjon i Nebraska (USA). Ved det eksisterende paradigmet med medfødt immunosenescens, spådde vi at mål på medfødt immunitet ville avta med økende alder, til tross for noe bevis på det motsatte [5, 32].

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Resultater

To hundre dyr ble tatt prøver i 2018 for immunvariabler (N=98 hanner, N=102 hunner), og disse observasjonene utgjør våre immundata. Av disse 102 kvinnene reproduserte 85 seg i 2017, og disse utgjør våre kvinnelige reproduksjonsdata. Til slutt, for analysen av dødelighetens alderdom i befolkningen som helhet, brukte vi vår langsiktige database med N=2380 unike individer med kjent alder (N=860 menn, N=1530 kvinner ). I vårt utvalg av immundata-individer (200 voksne), var alder sterkt korrelert med kroppsstørrelse; eldre dyr var større i både masse og lengde (f.eks. kroppsmasse, r=0.58, Pr.<0.0001; plastron length, r=0.60, Pr. <0.0001). Therefore body size was not included in models where age was an explanatory factor. In the immune data individuals, adult females were smaller than males and tended to be older (Table 1, Fig. S2), a result that is mirrored in the population as a whole (see Fig. 5 in [33]). Because adult females in our immune sample were significantly older than males, we z-transformed age for all analyses of innate immune function to dissociate the confound of age and sex. This allowed for a comparison of relatively old and young adult males and females.

Tabell 1 Størrelse, alder og dødelighet Aldring hos gule gjørmeskilpadder

I befolkningen som helhet hadde kvinner større median og maksimal voksenlevetid (aldre hvor 50 og 95 % av voksne hadde dødd). Både voksne mannlige og kvinnelige skilpadder viste aldersrelatert moraløkning, noe som indikerer aldring. Initial dødelighet hos voksne var høyere hos menn enn hos kvinner, men dødelighetsakselerasjonen var tilsvarende (tabell 1, fig. 1). I vår immununderprøve av individer var de tre målene for medfødt immunfunksjon signifikant (positivt) korrelert med hverandre (naturlig antistoffmediert hemagglutinasjon, komplementmediert hemolyse og bakteriedrepende kompetanse, tabell S1). Men fordi korrelasjonene var svake (alle |r|< 0.28), we analyzed each variable separately. For all three variables, batch represents the reagents used. For bactericidal competence, five individual lyophilized pellets of Escherichia coli were used to generate control plates across the experiment; as control plates decreased in their colony count, a fresh control solution was made. For natural antibodies and cell lysis capability, two separate bottles of rabbit red blood cells were used sequentially. Significant variation among E. coli pellets and individual rabbits (that generate the red blood cells) is expected, and we controlled for it here as a batch effect in our models. All three immune variables declined with advancing age (BC and Lysis, Pr< 0.05; Nabs, Pr=0.08, Table 2, Fig. 2) and were higher in males than females (Table 2, Fig. 3). For the 85 females in our data for which we had both most-recent reproductive output and immune measures, clutch size did not change with age, whereas egg mass increased with age (Tables 3, S2, Fig. 4). Because clutch size did not change with age, a third measure of reproductive effort, total clutch mass followed the identical trend as egg mass and was not considered further. Interestingly, the three females greater than 50 years old had lower age-corrected egg mass (age>50 år) enn kvinner i det nest laveste aldersintervallet (N=13 alder 40–50 år (t=2.45, Pr.=0.014)), noe som tyder på muligheten for alderdom i reproduksjon hos svært gamle kvinner (se fig. 4). For disse 85 reproduktive hunnene fulgte eldre kvinner den samme trenden som ble observert for alle voksne: redusert bakteriedrepende kompetanse og komplementmediert hemolyse med alderen (tabell 3, se fig. 1). I tillegg hadde kvinner med større clutcher - uavhengig av alder - høyere bakteriedrepende kompetanse enn de med mindre clutcher (fig. S1). I motsetning til clutchstørrelse fant vi ingen effekter av eggmasse på immunfunksjon (data ikke vist).

Diskusjon

cistanche supplement fordeler-hvordan styrke immunforsvaret

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Dødelighet og reproduktiv alderdom

Hunnlige gule gjørmeskilpadder lever lenger enn hanner i denne populasjonen; de eldes imidlertid med lignende hastigheter (fig. 1), og aldersspesifikk dødelighet øker med alderen hos begge kjønn (fig. 1), om enn sakte. Disse dataene demonstrerer langsom dødelighetsaldring hos denne arten, men vi fant ingen bevis for reproduktiv alderdom i våre kvinnelige prøver. Liten akselerasjon i voksen aldersspesifikk dødelighet hos skilpadder er rapportert i den store tetrapod fylogenetiske studien [18] så vel som i individuelle langtidsstudier for gigantiske skilpadder [34] og malte skilpadder ([35, 36] men se [34] 37, 38] og arter av hengslede skilpadder [39]); Men hos andre skilpaddearter forblir dødeligheten ofte konstant med voksende alder [40], eller avtar med alderen [3, 15, 41]. På tvers av fangepopulasjoner av skilpadder (f.eks. dyrehageregistreringer) da Silva et al. [21] fant at de fleste skilpaddearter viste langsom eller ubetydelig nedgang i dødelighet med alderen. Kvinnelig reproduktiv aldring (dvs. nedgang i aldersspesifikk reproduksjon) er ikke sett hos skilpaddearter så langt (malte skilpadder [30], Blandings skilpadder [15, 41], ørkenskilpadder [3] og boksskilpadder [42]) . Warner og kolleger [30] la merke til redusert overlevelse av malt skilpaddeklekking fra de eldste kvinnelige malte skilpaddene, til tross for ingen nedgang i reproduktiv produksjon. I tillegg har mange reproduktive studier av skilpadder vist positive korrelasjoner mellom clutchstørrelse, eggstørrelse og/eller clutchmasse med kroppsstørrelse hos skilpadder ([43]; gjennomgått [44]), der kroppsstørrelse ofte er positivt assosiert med alder i skilpadder (f.eks. denne studien, [17, 32], men se [41]). Disse dataene tyder på at reproduktiv alderdom sjelden forekommer hos skilpadder, om i det hele tatt.

Fig. 1 Overlevelse og aldersspesifikk dødelighet hos voksne mannlige og kvinnelige K. favescens. Median (50 % i live) og maksimal (5 % i live) levetid er større hos voksne hunner (svarte stiplede linjer) gule gjørmeskilpadder enn hos voksne hanner (grå, heltrukne linjer). Y-aksen er overlevelse Lx for voksne, fra 11 år. Linjer som faller til x-aksen viser kjønnsspesifikk median og maksimal levetid i kronologisk alder. Innlegget viser Gompertz-modellene for akselererende dødelighet over voksen alder; den initiale dødeligheten for voksne for menn er betydelig høyere enn for kvinner (heving av linjer), med tilsvarende økning (helling av linjer) (tabell 1). Y-aksen er den naturlige logaritmen for aldersspesifikk dødelighet fra den tilpassede Gompertz-akselerasjonsmodellen

Kjønnsspesifikk levetid og aldring

Studier av kjønnsforskjeller i organismal og demografisk alderdom er fortsatt sjeldne hos ikke-pattedyrarter. Det er sannsynligvis to årsaker til dette: innledende rapporter om demografi på ville populasjoner samler ofte data for tilstrekkelig kraft til å estimere dødelighetsakselerasjon; og hos mange arter er kjønnet til unge dyr ukjent på grunn av mangel på ytre kjønnsorganer og må stole på utviklingen av sekundære seksuelle fenotyper for å tildele kjønn hos nylig modne dyr. I en gjennomgang av data om livslengde i fangenskap rapporterte da Silva og kollegaer [21] at gjennomsnittlig forventet levealder for menn oversteg den for kvinner med omtrent 20 %, i motsetning til våre resultater for gule gjørmeskilpadder. Imidlertid ser større levetid hos hunner i ville populasjoner av skilpadder ut til å være mønsteret (malte skilpadder [28, 45]), flekkete skilpadder [46, 47], treskilpadder [48], kartskilpadder [49] cooters [50], boksskilpadder [51] og skyveknapper med røde øre [52]). Derimot er vi klar over bare to studier som har rapportert at mannlige skilpadder overlever hunner i naturen (gopher skilpadder [53] men se [54], og en populasjon av malte skilpadder [36]. Ytterligere data er nødvendig, men disse feltdata står i kontrast til de fangede postene oppsummert av [21], og antyder en mulig kjønn-for-miljø interaksjon relatert til lang levetid og aldring.

Tabell 2 Analyse av varians for immunvariabler for voksne hann- og hunn-gule gjørmeskilpadder

Kjønnsspesifikk immunfunksjon

Vi fant høyere nivåer av immunfunksjon hos menn enn hos kvinner, det motsatte av det generelle mønsteret hos virveldyr [55, 56], og antas i det minste delvis å være relatert til immunsystemets undertrykkelse av androgener [57, 58]. Mange skilpaddearter er passende modeller for dette spørsmålet fordi de mangler kjønnskromosomer, og derfor har kjønnene identisk genomarkitektur ved unnfangelsen. De har i stedet temperaturavhengig kjønnsbestemmelse (TSD) der kjønn bestemmes av det termiske miljøet som oppleves i den kritiske perioden med embryonal utvikling, og fjerner enhver forvirring mellom kjønnsspesifikke genomer og kjønnsspesifikk seksuell utvikling [59]. López-Pérez og kolleger [60] fant ingen forskjell i bakteriedrepende kompetanse mellom hanner og hunner hos en art av moskusskilpadder (en annen kinosternidskilpadde med TSD). På samme måte fant Zimmerman og kolleger [32, 61, 62] ingen kjønnsforskjell i mål på medfødt immunitet hos rødørede skyveskilpadder (også med TSD). I kontrast, hos malte skilpadder [5] – En annen art med TSD – ble høyere komplementmediert hemolyseevne rapportert hos hanner og høyere naturlige antistofftitere hos hunner, uten kjønnseffekt på bakteriedrepende kompetanse. I tillegg fant Freedberg og kolleger [63] at kjølige, hannproduserende inkubasjonstemperaturer i en annen TSD-skilpadde økte immunkompetansen hos menn mer enn hos kvinner, men fant ingen slike effekter hos en nær beslektet slekt. Selv om disse foreløpige dataene ser ut til å antyde at skilpadder kanskje ikke følger det generelle virveldyrmønsteret med lavere immunrespons hos menn, er det helt klart nødvendig med ytterligere forskning. Etter øko-immunologiteori som antyder assosiasjoner mellom immunforsvar og livshistoriestrategier [64, 65], ville vi forvente at kjønnet med lengre levetid ville investere mer i ervervet i forhold til medfødt immunitet [66]; begrensede data om kjønnsspesifikke levetider utelukker en omfattende test på tvers av arter.

cistanche planteøkende immunsystem

Atferdsforskjeller og aktivitetsmønstre kan utsette kvinnelige gule gjørmeskilpadder for større infeksjonspress enn hanner, noe som kan undertrykke kvinnelig immunfunksjon [55, 56]. Vår studieart har en uvanlig årlig aktivitetssyklus (se Metoder). På vårt undersøkelsessted kommer voksne hanner ut av brumasjon i gjennomsnitt 5 dager før hunnene om våren [Iverson og Greene, upubliserte data], forblir aktive i vannet i juni under utvidede hekkeforsøk av hunner, og går i gjennomsnitt til sommerestivering senere enn kvinner [67]. Derfor er den årlige aktivitetsperioden for denne arten uvanlig kort, med en typisk hann som er aktiv i vannet kanskje 25 % lenger enn en typisk hunn. Det er imidlertid ikke klart hvorfor den kortere aktivitetssesongen til hunner vil utsette dem for større press på immunsystemet. Også reproduksjonsaktiviteten er forskjellig mellom hanner og hunner, med parring og befruktning som skjer i vannsøylen, hvoretter hunnene må komme opp fra vannet til land for å deponere eggene sine (mens hannene ikke har noe slikt obligatorisk forsøk på land) [67]. sesongbestemt (f.eks. [Konsentrasjoner av reptiler sirkulerende steroider er høye 68, 69]), og derfor kan mønsteret vi observerte med høyere immunfunksjon hos menn tilskrives prøvetaking bare under vårens fremvekst – dvs. veldig tidlig i sesongen. Sesongvariasjon i skilpadde androgener har blitt rimelig godt studert, og sirkulerende testosteronnivåer for mannlige skilpadder er generelt svært lave tidlig på våren (gjennomgang i [69]), mens den topper seg om våren for hunner når de forbereder seg på eggløsning [69– 74]. Testosteron er kjent for å undertrykke immunfunksjonen ([57], men se [58]), og dette kan forklare de lavere immunresponsene hos kvinner sammenlignet med menn. Imidlertid er østradiol kjent for å forbedre immunfunksjonen [23], og det er generelt forhøyet hos kvinner tidlig på våren, etterfulgt av en topp like etterpå i forbindelse med eggløsning og eggløsning ([75], gjennomgått i [69]). Basert på vår prøvetaking tidlig på våren, er østradiol- og testosteronmønstre usannsynlige forklaringer på de lavere immunresponsene som er observert hos hunnene våre. Dessverre mangler vi data for sirkulerende hormonnivåer i vår studieart, men gitt de generelle mønstrene som nettopp er beskrevet, er virkningen av sirkulerende steroider på immunfunksjonen fortsatt ikke klar.

Fig. 2 Medfødt immunitet avtar med alderen hos voksne K. favescens. A bakteriedrepende kompetanse og B Komplementmediert lysis avtok med alderen på samme måte for voksne mannlige og hunnlige gule gjørmeskilpadder (se tabell 2 for statistisk utdata). C Natural Antibodies (NAbs) viste samme trend. I alle paneler representerer Y-aksen rester fra lineære modeller med alder fjernet fra modellen (tabell 2). X-aksen er en z-transformert alder med innfelte linjer for å indikere alder i år for voksne mannlige og kvinnelige skilpadder. Regresjoner: BC-rester=−{{10}}.138(zAlder), R2=0.06; Lyseringsrester=-0,01(zAlder), R2=0.02; NAbs-rester=-0,01(zAlder), R2=0.01

Kvinnelig reproduksjon og immunfunksjon

Vi fant ingen bevis for en immunkostnad for kvinnelig reproduksjon. Verken clutchstørrelse (tabell 3) eller eggmasse (data ikke vist) påvirket noen immunvariabel negativt. Hunnene som la større egg, hadde faktisk høyere bakteriedrepende evne (fig. S1). Livshistorieteori forutsier at individer må allokere ressurser til egenskaper som de som støtter selvvedlikehold og reproduksjon for å maksimere kondisjon [76]. Imidlertid representerer reproduksjon en betydelig energikostnad for kvinner, og dermed kan ressurser allokert til reproduksjon gå på bekostning av andre egenskaper [77]. Kvinner som investerer tungt i nåværende reproduksjon kan derfor forventes å oppleve en avveining med dagens immuneffektivitet [78]. Denne avveiningen mellom reproduksjon og immunfunksjon har blitt undersøkt hos andre krypdyr med blandede resultater. Gravide vestlige terrestriske strømpebåndslanger (Tamnophis elegans) viste lavere T-lymfocytt-proliferasjonsevne som respons på et mitogen i forhold til ikke-gravide slektninger, men viste ingen forskjell i BC mellom reproduktive tilstander [27]. Derimot viste gravide pygmé-klapperslanger (Sistrurus milarius) redusert BC-evne i forhold til ikke-gravide slanger [79]. Mål for medfødt immunitet mellom reproduktive tilstander hos malte skilpadder (Chrysemys picta) var aldersavhengige [5]. Spesifikt viste yngre kvinner som hadde store clutcher større lyseringsevne enn eldre kvinner med tilsvarende store clutchstørrelser. Imidlertid fant denne samme studien økt BC hos eldre kvinner, noe som er i motsetning til funnene i denne studien om redusert immunfunksjon med økende alder. I tillegg, uavhengig av alder, fant vi at større clutchstørrelser var korrelert med høyere BC og at det ikke var noen effekt av reproduksjon på naturlig antistoffproduksjon eller lyseringsevne. Disse resultatene tyder på at avveininger mellom immunfunksjon og reproduksjon sannsynligvis er immunkomponentspesifikke.

Fig. 3 Medfødt immunitet er signifikant høyere hos mannlige enn kvinnelige voksne K. favescens. Tilbaketransformert minste kvadrat betyr ±1 SE for A) bakteriedrepende kompetanse (y-aksen er andelen av drepte E. coli-kolonier) og B) naturlige antistoffer (y-aksen er maksimal fortynningstiter ved hvilken hemagglutinasjon av røde blodceller fra kanin oppstår ) og komplementmediert lysis (maksimal fortynningstiter ved hvilken lysering av røde blodceller fra kanin skjer). Stjerner representerer en signifikant kjønnsforskjell for et gitt immunmål. (Se tabell 2 for statistisk utdata). LS betyr: BC=0.37, 0.62; NAbs=4.0, 4.6; Lys=8.2, 9.0

Tabell 3 Analyse av immunvariabler og reproduksjonsinnsats for reproduktive, gule gjørmeskilpadder

Fig. 4 Eggmasse, ikke clutchstørrelse, øker med alderen ved reproduserende hunnkvinner av K. favescens. Y-aksen representerer rester fra den lineære modellen i tabell 3 med alder fjernet fra modellen. Eggmasserester=0.025(Alder) – 0,73, R2=0.40

Immunosenescens

Av de medfødte immunvariablene vi undersøkte hos gule gjørmeskilpadder, fant vi bevis på immunosenescens hos alle tre (fig. 2; tabell 2). Resultater fra andre studier er blandede. For eksempel viste større (antagelig eldre) rødørede glidere ingen endring i BC sammenlignet med mindre individer [32, 61], tilsvarende funn for bakteriedrepende kompetanse hos malte skilpadder der alderen var kjent [5]. Denne sistnevnte studien rapporterte også økning i hemagglutinasjon hos eldre dyr. Det er åpenbart ikke noe mønster av aldersrelaterte endringer i det medfødte immunsystemet hos skilpadder ennå. Blant andre ikke-fuglereptiler er resultatene også ganske varierende (gjennomgått i [8, 26]). For eksempel i populasjoner av strømpebåndsslanger, reduseres både hemagglutinasjons- og hemolyseevne hos eldre slanger [27, 80], og det samme gjør immunresponsen mot mitogenet fytohemagglutinin i Dickersons krageøgler [81]. Mens det er i vannpyton, øker hemagglutinasjonen med alderen [82]. Ytterligere forskning vil være nødvendig for å forstå denne variasjonen i retning av aldersrelaterte endringer i medfødt immunitet hos krypdyr generelt, og skilpadder spesifikt. Derimot viser data fra pattedyr og fugler stort sett nedgang i immunfunksjon med alderen. Videre, i disse taxaene, skjedde mesteparten av observert immunosenescens i det adaptive immunsystemet [83–85] med mindre uttalte endringer funnet i medfødt immunitet (gjennomgått i [6]), selv om mønstrene heller ikke her nødvendigvis er konsistente på tvers av medfødte immunitetsmål [ 86]. Hos reptiler reagerer imidlertid det adaptive immunsystemet saktere på utfordringer og viser ikke robuste responser under gjentatt patogeneksponering (gjennomgått i [24, 87]). Dermed kan medfødt immunfunksjon og aldersrelaterte endringer i slik funksjon være avgjørende for den generelle immunhelsen hos reptiler.

Konklusjoner

Her har vi forsøkt å utvide de komparative betraktningene av medfødt immunosenescens, og dens interaksjoner med dødelighet og reproduktiv aldring. Vi valgte en lenge studert vill populasjon av (gul gjørme) skilpadder for å teste for assosiasjoner mellom disse målene for aldring, fordi nyere brede sammenlignende studier har identifisert skilpaddekladen som har eksepsjonelt langsom aldring og lang levetid. Til tross for at mål på aldringsmekanismer krever kjente aldre, noe som kun er oppnåelig gjennom langtidsstudier for ville, langlivede arter. Vi fant at dødelighet og immunitet hadde kjønnsspesifikke egenskaper; kvinner levde lenger og hadde lavere medfødt immunfunksjon enn menn. Dette resultatet er slående basert på temperaturavhengigheten til kjønnsbestemmelse, og utelukker dermed bidrag fra kjønnskromosomer til kjønnsspesifikk aldring. Alle tre målene for medfødt immunitet avtok med økende alder. Hos kvinner økte clutchmassen med økende alder hos kvinner, og reproduksjonseffekten forutsa ikke medfødt immunfunksjon annet enn at kvinner med større clutch hadde høyere bakteriedrepende kompetanse, noe som tyder på at det ikke er noen åpenbare kostnader ved reproduksjonsanstrengelse for medfødt immunitet hos kvinner. Dette er den første studien som undersøker tre aldringsakser hos skilpadder, en gruppe preget av langsom til neglisjerbar aldring. Disse funnene om immunosenescens, dødelighet og reproduksjon antyder skilpadder som en ny modell for å forstå mekanismene for langsom aldring, eller, mer presist, studiet av universelle aldringsmekanismer (som immunosenescens) i en monofyletisk gruppe preget av langsom voksendødelighetsakselerasjon og ubetydelig reproduktiv alderdom.

Metoder

Feltprøvetaking

Vevsprøvetaking for de gule gjørmeskilpaddene (YMT) for denne studien fant sted 2. mai018 på Gimlet Lake på vårt langsiktige forskningssted på Crescent Lake National Wildlife Refuge (CLNWR), i Garden County, Nebraska , USA (41 grader 45,24′N, 102 grader 26,12′W). Gimlet Lake myrkomplekset er en grunn (gjennomsnittlig dybde 0,8m), sandbakkeinnsjø med myrhabitat [88]. YMT-er viser temperaturavhengig kjønnsbestemmelse (TSD) med hunner produsert under varme inkubasjonsforhold og både hanner og hunner produsert under kjøligere forhold [59]. Mark-gjenfangst og hekkeøkologistudier pågikk her fra 1981 til 2018. På dette stedet overvintrer YMT-er typisk terrestrisk begravet i sandbakker i høylandet ved siden av våtmarker, dukker opp i april og mai og vandrer til vannet, og deretter vender de fleste hunnene tilbake til samme sandbakker å hekke i juni, selv om noen ikke reproduserer hvert år [67, 87]. I juli begynner alle skilpadder å forlate våtmarkene for å estivere i sandbakkene resten av sommeren (se også [89]). I feltsesonger ble det bygget drivgjerder parallelt med land mellom tre overvintringsplasser og innsjøen, og overvåket kontinuerlig hver dag. I løpet av årene (inkludert 2017) da gjerdene var på plass i hekkesesongen, ble hver fanget hunn røntgenfotografert for å bestemme clutchstørrelsen, og bredden på hvert egg på hvert røntgenbilde ble målt. En regresjonsligning som relaterer gjennomsnittlig clutch-røntgenbredde med faktisk gjennomsnittlig eggmasse fra en undergruppe av reir som senere ble gravd ut, tillot oss å estimere eggmasse og clutchmasse (begge i g) for hver gravid kvinne i 2017 (n{{24} }). Ligningene for disse relasjonene og ft er som følger: Faktisk eggbredde=0.98(estimert eggbredde)+1.52, R2=0.89; Faktisk eggmasse=0.64(estimert eggmasse) – 6.07, R2=0.85; og i en prøve av N=1795 YMT-egg samlet over flere år kan eggbredden brukes pålitelig til å estimere eggmassen (og dermed total clutchmasse) Eggmassen=0.68(Eggbredden) – 6.77, R2=0.85 (Iverson, upubliserte data). Dette gjorde oss i stand til å undersøke effektene av disse målene for reproduktiv produksjon på immunitet våren 2018 da disse 85 hunnskilpaddene dukket opp fra brumasjon. Når de ble fanget, ble skilpaddene fraktet tilbake til feltlaboratoriet hvor morfometriske data ble registrert, inkludert maksimal ryggskjoldlengde (CL i mm), maksimal plastronlengde (PL i mm) og kroppsmasse (BM i g). Opptil 0,5 ml fullblod ble samlet fra cervical sinus via en 26 gauge heparinisert sprøyte, og sentrifugert (7000 rpm) i et kryorør i 5 minutter for å skille blodkomponenter. Blodplasma ble pipettert til et separat kryorør. Både plasma og pakkede røde blodlegemer ble øyeblikkelig hurtigfryst i flytende nitrogen til de ble transportert til Iowa State University for lagring ved -80 grader. Skilpadder som ble tatt prøver (98 hanner og 102 hunner) ble fraktet tilbake til deres opprinnelige fangststed og sluppet ut på motsatt side av gjerdet for å fortsette til innsjøen.

Aldersbestemmelse

Siden denne studien startet i 1981, ble alderen i år etter første fangst av hver skilpadde estimert som antall vintre etter klekking. Aldersestimering er den samme hvert år, og derfor gjelder våre metoder for aldersbestemmelse for alle data som vurderes her (populasjon og immununderprøve). Fordi det bare produseres en enkelt årring hvert år i denne populasjonen, er alderen på umodne skilpadder vanligvis lik det totale antallet årringer som er tilstede. Men i ekstremt tøffe år kan det hende at det ikke er noen vekst, og to årringer kan vises som en. Derfor er antall årringer minimumsalder og kan undervurderes hvis årringer ikke telles og evalueres i sammenheng med generelle skjellvekstmønstre i hele befolkningen. Ved å sammenligne mønsteret av økningene i skuddvekst hos en ualdret ung skilpadde med det generelle mønsteret av skogvekst i befolkningen, kunne alder ved første fangst bestemmes pålitelig opp til minst 12 år. Vi telte minimumsantallet av årringer på voksne skilpadder fanget i de første årene av studien, og alder ble beregnet for alle disse skilpaddene hvis antallet årringer var mindre enn 20. Imidlertid ble de fleste skilpadder først merket individuelt og aldret før deres sjette vinter, og aldret deretter basert på det faktiske gjenfangstintervallet. Voksne kvinner var signifikant eldre (og mindre) enn menn i våre prøver (tabell S3; uparet t-test, P=0.0003, se fig. S2 og fig. 5 i [33]). Derfor ble alder z-transformert innen hvert kjønn til et gjennomsnitt på 0 med enhetsvarians. Denne variabelen "alder" ble brukt i alle statistiske analyser. Vi ekskluderte data fra 26 ukjønnede ungdommer.

Reproduktiv analyse

Reproduksjonseffekt – clutchstørrelse, total clutchmasse – økte med økende størrelse og alder. Derfor, for analysene som inkluderte kvinnelig reproduksjon sammen med alder i modellen, brukte vi råverdier for reproduksjon uten å korrigere for kroppsstørrelse. Alle lineære modeller ble utført i SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

Overlevelsesanalyse

Overlevelse og aldersspesifikke dødelighetsrater for voksne Kinosternon-favescens fra vestlige Nebraska ble estimert basert på Gompertz-modellen (tabell 1) [18, 90, 91] som estimerer en initial dødelighetssannsynlighet ved startalder, og raten for akselererende dødelighet over hele levetid. Mer kompliserte modeller (f.eks. inkludert en konstant Makeham-term for aldersuavhengig dødelighet, inkludert en retardasjonsparameter) ble ikke støttet av disse dataene basert på endringen i AIC (beregnet i BaSTA R-pakken [90]). Gompertz-modellering ble brukt på det langsiktige datasettet vårt fra Gimlet Lake, inkludert data fra 1530 individuelle kvinner og 860 individuelle hanner. Alder ved modenhet var i gjennomsnitt 11 år for begge kjønn, noe som er kjent fra langtidsovervåking av alder og reproduksjon i denne populasjonen [88, 92, 93]. Fordi modning er størrelsesavhengig, er disse estimatene for modningsalder (dvs. 11 år.) maksimale estimater (for eksempel kan en og annen hannskilpadde identifiseres i yngre aldre). Vi testet sensitiviteten ved å bruke en gjennomsnittlig modningsalder på 10 år uten merkbar effekt på estimater av levetid og dødelighetsaldring (data ikke vist). Maksimal og median voksenlevetid ble beregnet som antall år etter alderen for første reproduksjon frem til 95 og 50 % av de voksne i den syntetiske kohorten ble estimert til å ha dødd. Datasett ble analysert ved å bruke 'basta'-funksjonen fra BaSTA-pakken for R [90].

Immune tiltak

Naturlig antistoffmediert hemagglutinasjon og komplementmediert hemolyse (NAbs, Lysis) evne er rapportert å være den første forsvarslinjen mot patogener hos vertebrater (gjennomgått i [94]), og disse målene for medfødt immunfunksjon har blitt studert hos mange reptiler arter (f.eks. [4, 5, 32, 80, 82, 95]). Vi fullførte analysene for NAbs og lyseringsevne i henhold til hemolyse-hemagglutinasjonsanalysen tilpasset fra [96] for bruk i malte skilpadder [5, 97]) ved bruk av røde blodceller fra kanin. Vi brukte to flasker med røde blodceller fra kanin (HemoStat HemoStat Laboratories, Dixon, CA, USA) for å fullføre alle analyser. Vi kjørte alle plater med positive og negative kontroller og prøver i duplikat. Høyere titere for hemagglutinasjon indikerer en større overflod av naturlige antistoffer i plasmaprøven, da høye titere er en indikasjon på at naturlige antistoffer er i høye konsentrasjoner selv i stadig mer fortynnet plasma [96]. På samme måte indikerer høyere titere for hemolyse at plasma er i stand til å lysere RBC selv ved mer fortynnede konsentrasjoner [96]. Således er økte naturlige antistoffnivåer og lyseringsevne assosiert med økt immunfunksjon. Vi vurderte den bakteriedrepende kompetansen (BC) til plasma ved å kvantifisere dens evne til å hemme veksten av Escherichia coli ved å bruke vår publiserte protokoll for malte skilpadder [5, 97], tilpasset fra [98]. Fem lyofiliserte pellets av E. coli (Microbiologics, ATCC#8739) ble brukt i det nåværende eksperimentet, med hver nye pellet brukt til å generere en ny kontrollløsning etter hvert som vi gikk gjennom prøvene. Økt bakteriedrepende kompetanse tilsvarer økt immunfunksjon. Alle immunanalyser ble utført våren 2019 på prøver samlet våren 2018.

Immunmål: statistiske analyser

Avhengige variabler ble analysert ved bruk av generelle lineære modeller med forklarende variabler for zAge (standardisert alder innen hvert kjønn); Kjønn (voksne menn og voksne kvinner); toveisinteraksjonen mellom zAlder og kjønn; og nuisance variabel analysebatch (BC: N=4; NAbs og Lysis: N=2) for å ta hensyn til kontrollpellets (BC) eller flaske med røde blodceller fra kanin (NAbs og Lysis). Baktericidal kompetanse ble Arcsine transformert for å ta hensyn til proporsjonale data og for å oppfylle normalitetsbetingelser. NAbs og Lysis ble logg-10 transformert for å oppfylle betingelser for normalitet. Alle lineære modeller ble utført i SAS v. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Grafer ble laget i ggplot2 [99].

Referanser

1. Harman D. Aldring: oversikt. Ann NY Acad Sci. 2001;928:1–21.

2. Ricklefs RE. Utviklingen av senescens fra et komparativt perspektiv. Funksjon Ecol. 2008;22:379–92.

3. Jones OR, Scheuerlein A, Salguero-Gómez R, Camarda CG, Schaible R, Casper BB, et al. Mangfold av aldring på tvers av Livets tre. Natur. 2014;505(7482):169–73.

4. Schwanz L, Warner DA, McGaugh S, Di Terlizzi R, Bronikowski AM. Tilstandsavhengig fysiologisk vedlikehold i en langvarig ektoterm, den malte skilpadden (Chrysemys picta). J Exp Biol. 2011;214:88–97.

5. Judson JM, Reding DM, Bronikowski AM. Immunosenescens og dens innflytelse på reproduksjon hos et langlivet virveldyr. J Exp Biol. 2020;223:jeb223057.

6. Peters A, Delhey K, Nakagawa S, Aulsebrook A, Verhulst S. Immunosenescence i ville dyr: meta-analyse og utsikter. Ecol Lett. 2019;22:1709–22.

7. Schmid-Hempel P. Variasjon i immunforsvar som et spørsmål om evolusjonær økologi. Proc R Soc B. 2003;270(1513):357–66.

8. Hoekstra LA, Schwartz TS, Sparkman AM, Miller DA, Bronikowski AM. Det uutnyttede potensialet til krypdyrets biologiske mangfold for å forstå hvordan og hvorfor dyr eldes. Funksjon Ecol. 2020;34:38–54.

9. Franceschi C, Capri M, Monti D, Giunta S, Olivieri F, Sevini F, et al. Infammaging og anti-infammaging: et systemisk perspektiv på aldring og lang levetid dukket opp fra studier på mennesker. Mek Age Utvikle. 2007;128:92–105.

10. Pawelec G, Bronikowski AM, Cunnane SC, Ferrucci L, Franceschi C, Fülöp T, Gaudreau P, Gladyshev VN, Gonos ES, Gorbunova V, Kennedy BK, Larbi A, Lemaître JF, Liu GH, Maier AB, Morais JA, Nóbrega OT, Moskalev A, Rikkert MO, Seluanov A, Senior AM, Ukraintseva S, Vanhaelen Q, Witkowski J, Cohen AA. Gåten til det menneskelige immunsystemet er "alderlighet". Mek Age Utvikle. 2020;192.

11. Schwartz TS, Bronikowski AM. Molekylære stressveier og utviklingen av reproduksjon og aldring hos reptiler. I (T. Flatt & A. Heyland, red.) Molecular mechanisms of life history evolution. Oxford: Oxford Univ Press; 2011. S. 193–209

12. Armstrong DP, Keevil MG, Rollinson NJ, Brooks RJ. Subtil individuell variasjon i ubestemt vekst fører til stor variasjon i overlevelse og livstids reproduksjon hos et langlivet reptil. Funksjon Ecol. 2007;32:752–61.

13. Omeyer LCM, Fuller WJ, Godley BJ, Snape RTE, Broderick AC. Bestemt eller ubestemt vekst? Revisjon av vekststrategien til havskilpadder. Mar Ecol Prog Ser. 2018;596:199–211.

14. Bronikowski AM, Arnold SJ. Den evolusjonære økologien til livshistorievariasjonen i strømpebåndsslangen Thamnophis elegans. Økologi. 1999;80:2314–25.

15. Congdon JD, Nagle RD, Kinney OM, van Loben Sels RC. Hypoteser om aldring hos et langlivet virveldyr, Blandings skilpadde (Emydoidea blandingii). Exp Gerontol. 2001;36:813–27.

16. Wilkinson PM, Rainwater TR, Woodward AR, Leone EH, Carter C. Bestem vekst og reproduktiv levetid i den amerikanske alligatoren (Alligator mississippiensis): bevis fra langsiktige gjenfangster. Copeia. 2016;104:843–52.

17. Hoekstra LA, Weber RC, Bronikowski AM, Janzen FJ. Kjønnsspesifikk vekst, form og deres innvirkning på livshistorien til et langlivet virveldyr. Evol Ecol Res. 2018;19(6):639–57.

18. Reinke BA, Cayuela H, Janzen FJ, Lemaître JF. Gaillard JM, pluss 110 andre. Ulike aldringshastigheter hos ektotermiske tetrapoder gir innsikt i utviklingen av aldring og lang levetid. Vitenskap. 2022;376:1459–66.

19. Berkel C, Cacan E. Analyse av lang levetid i Chordata identifiserer arter med eksepsjonell levetid blant taxa og peker på utviklingen av lengre levetid. Biogerontol. 2021;22:329–43.

20. Stark G, Tamar K, Itescu Y, Feldman A, Meiri S. Kalde og isolerte ektotermer: drivere for reptillivslengde. Biol J Linn Soc. 2018;125:730–40.

21. da Silva R, Conde DA, Baudisch A, Colchero F. Langsom og ubetydelig alderdom blant testudiner utfordrer evolusjonsteorier om alderdom. Vitenskap. 2022;376:1466–70.

22. Charlesworth B. Fisher, Medawar, Hamilton og utviklingen av aldring. Genetikk. 2000;156:927–31.

23. Zimmerman LM, Vogel LA, Bowden RM. Forstå virveldyrets immunsystem: innsikt fra reptilperspektivet. J Exp Biol. 2010;213:661–71.

24. Zimmerman LM. Reptilperspektivet på virveldyrs immunitet: 10 år med fremgang. J Exp Biol. 2020;223(Pt 21):jeb214171.

25. Palacios MG, Ganglof EJ, Reding DM, Bronikowski AM. Genetisk bakgrunn og termisk miljø påvirker forskjellig ontogenien til immunkomponenter i tidlig liv hos et ektotermisk virveldyr. J Animal Ecol. 2020;89:1883–94.

26. Field EK, Hartzheim A, Terry J, Dawson G, Haydt N, Neuman-Lee LA. Reptilian medfødt immunologi og økoimmunologi: hva vet vi og hvor skal vi? Integra Comp Biol. 2022;62:1557–71.

27. Palacios MG, Bronikowski AM. Immunvariasjon under graviditet antyder immunkomponentspesifikke kostnader ved reproduksjon i en viviparøs slange med forskjellige livshistoriestrategier. J Exp Zool del A. 2017;327:513–22.

28. Bronikowski AM, Meisel RP, Biga PR, Walters JR, Mank JE, Larschan E, et al. Kjønnsspesifikk aldring hos dyr: perspektiv og fremtidige retninger. Aldrende celle. 2022;21:e13542.

29. Reed TE, Kruuk LE, Wanless S, Frederiksen M, Cunningham EJ, Harris MP. Reproduktiv alderdom hos en langlevende sjøfugl: nedgang i ytelsen i slutten av livet er assosiert med varierende kostnader ved tidlig reproduksjon. Am Nat. 2008;171:E89–E101.

30. Warner DA, Miller DA, Bronikowski AM, Janzen FJ. Tiår med feltdata viser at skilpadder overlever i naturen. Proc Natl Acad Sci US A. 2016;113(23):6502–7.

31. Reinke BA, Miller DAW, Janzen FJ. Hva har langsiktige feltstudier lært oss om populasjonsdynamikk? Ann Rev Ecol Evol Sys. 2019;50(1):261–78.

32. Zimmerman LM, Bowden RM, Vogel LA. Rødørede skyveskilpadder reagerer ikke på immunisering med hemocyanin, men har høye nivåer av naturlige antistoffer. ISRN Zool. 2013a;2013:1–7.

33. Iverson JB. Klimamediert rekrutteringssvikt i en skilpaddepopulasjon og dens betydning for nordlige utbredelsesgrenser. Chelonian Cons Biol. 2022;21(2):181–6.

34. Gibson CWD, Hamilton J. Populasjonsprosesser i et stort planteetende krypdyr: den gigantiske skilpadden fra Aldabra-atollen. Økologi. 1984;61:230–40.

35. Miller DAW, Janzen FJ, Fellers GM, Kleeman PM, Bronikowski AM. Biodemografi av ektotermiske tetrapoder gir innsikt i utviklingen og plastisiteten til dødelighetsmønstre. I: Weinstein M, Lane MA, redaktører. Sosialitet, hierarki, helse: komparativ biodemografi. Washington DC: National Academies Press; 2014. s. 295–313.

36. Reinke BA, Hoekstra L, Bronikowski AM, Janzen FJ, Miller DAW. Felles estimering av vekst og overlevelse fra mark-gjenfangst data for å forbedre estimater av alderdom i ville populasjoner. Økologi. 2020;101(1):e02877. https://doi.org/10.1002/ecy.2877.

37. Keevil, MG 2020. Felles estimering av vekst og overlevelse fra mark-recapture data for å forbedre estimater av senescens i ville populasjoner: kommentar. Økologi e03232. https://doi.org/10.1002/ecy.3232.

38. Bronikowski AM, Reinke BA, Hoekstra L, Janzen FJ, Miller DAW. Felles estimering av vekst og overlevelse fra mark-gjenfangst data for å forbedre estimater av alderdom i ville populasjoner: svar. Økologi. 2022:103:e03571. https://doi.org/10.1002/ecy.3571.

39. Cayuela H, Akani GC, Hema EM, Eniang EE, Amadi N, Ajong SN, et al. Livshistorie og aldersavhengige dødelighetsprosesser hos tropiske krypdyr. Biol J Linn Soc. 2019;128:251–62. 40. Gibbons JW. Hvorfor lever skilpadder så lenge? Biovitenskap. 1987;37:262-9.

41. Congdon JD, van Loben Sels RC. Forhold mellom reproduktive egenskaper og kroppsstørrelse med oppnåelse av seksuell modenhet og alder hos Blandings skilpadder (Emydoidea blandingii). J Evol Biol. 1993;6:547-57.

42. Miller JK. Å unnslippe senescens: demografiske data fra den tretåede boksskilpadden (Terrapene Carolina Triunguis). Exp Gerontol. 2001;36(4–6):829–32.

43. Moll EO. Reproduktive sykluser og tilpasninger. I: Harless M, Morlock H, redaktører. Skilpadder: perspektiver og forskning. Malabar, Florida: John Wiley og sønner; 1979. s. 305–20.

44. Iverson JB, Lindeman PV, Lovich J. Forstå reproduktiv allometri hos skilpadder: en glatt skråning. Ecol Evol. 2019;9:11891–903.

45. Iverson JB. Chrysemys picta bellii (vestlig malt skilpadde). Lang levetid. Herpetol Rev. 2022;53:484.

46. ​​Litzgus JD. Kjønnsforskjeller i lang levetid hos den flekkete skilpadden (Clemmys guttata). Copeia. 2006;2006:281–8.

47. Ernst CH. Vekst av den flekkete skilpadden (Clemmys guttata). J Herp. 1975;9:313-8.

48. Brown DJ, Schrage M, Ryan D, Moen RA, Nelson MD, Buech RR. Glyptemys insculpta (treskilpadde) lang levetid i naturen. Herpetol Rev. 2015;46:243–4.

49. Iverson JB, Smith GR, Rettig JE. Kroppsstørrelse, vekst og lang levetid i den nordlige kartskilpadden (Graptemys geografiske) i Indiana. J Herp. 2019;53:297–301.

50. Munscher E, Campbell K, Hauge JB, Hootman T, Osborne W, Butterfeld BP, et al. Pseudemys foridana peninsularis (halvøya Cooter) og Pseudemys nelsoni (Florida rødbuget Cooter). Lang levetid. Herpetol Rev. 2020;51:111–3.

51. Lewis EL, Iverson JB. Terrapene ornata (utsmykket boksskilpadde). Lang levetid. Herpetol Rev. 2018;49:530.

52. Lewis EL, Iverson JB, Smith GR, Rettig JE. Kroppsstørrelse og vekst i den rødørede glideren (Trachemys scripta) i den nordlige kanten av utbredelsen: gjelder Bergmanns regel? Herp Conserv Biol. 2018;13:700–10.

53. Curtin AJ, Zug GR, Spotila JR. Levetid og vekststrategier for ørkenskilpadden (Gopherus agassizii) i to amerikanske ørkener. J Arid Environ. 2009;73:463–71.

54. Medica PA, Nussear KE, Esque TC, Saethre MB. Langsiktig vekst av ørkenskilpadder (Gopherus agassizii) i en sørlige Nevada-befolkning. J Herpetol. 2012;46:213–20.

55. Klein SL. Hormoner og parringssystemer påvirker kjønns- og artsforskjeller i immunfunksjon blant virveldyr. Behav Proc. 2000;51:149–66.

56. Klein SL. Hormonelle og immunologiske mekanismer som medierer kjønnsforskjeller ved parasittinfeksjon. Parasitt Immunol. 2004;26:247–64.

57. Foo YZ, Nakagawa S, Rhodes G, Simmons LW. Effektene av kjønnshormoner på immunfunksjonen: en metaanalyse. Biol Rev. 2007;92:551–71.

58. Kelly CD, Stoehr AM, Nunn C, Smyth KN, Prokop ZM. Seksuell dimorfisme i immunitet på tvers av dyr: en metaanalyse. Ecol Lett. 2018;21:1885–94.

59. Janzen FJ, Paukstis GL. Miljøbestemmelse av kjønn hos reptiler: økologi, evolusjon og eksperimentell design. Q Rev Biol. 1991;66(2):149–79.

60. López-Pérez JE, Meylan PA, Goessling JM. Kjønnsbasert handel med det medfødte og ervervede immunsystemet til Sternotherus minor. J Exp Zool. 2021;333:820–8.

61. Zimmerman LM, Paitz RT, Vogel LA, Bowden RM. Variasjon i de sesongmessige mønstrene for medfødt og adaptiv immunitet i skyvekontrollen med røde øre (Trachemys scripta). J Exp Biol. 2010;213:1477–148358.

62. Zimmerman LM, Clairardin SG, Paitz RT, Hicke JW, LaMagdeleine KA, Vogel LA, et al. Humoral immunrespons opprettholdes med alderen i en langvarig ektoterm, den rødørede skyveskilpadden. J Exp Biol. 2013b;216:633–40.

63. Freedberg S, Greives TJ, Ewert MA, Demas GE, Beecher N, Nelson CE. Inkubasjonsmiljøet påvirker immunsystemets utvikling hos en skilpadde med miljøbestemt kjønnsbestemmelse. J Herpetol. 2008;2008(42):536–41.

64. Lee KA. Koble sammen immunforsvar og livshistorie på nivået til individet og arten. Integr Comp Biol. 2006;46:1000–15.

65. Sheldon BC, Verhulst S. Økologisk immunologi: kostbare parasittforsvar og handel med evolusjonær økologi. Trender Ecol Evol. 1996;11:317–21.

66. Palacios MG, Cunnick JE, Bronikowski AM. Det komplekse samspillet mellom tilstand, livshistorie og rådende miljø former immunforsvaret til slanger i naturen. Physiol Biochem Zool. 2013;86:547–58.

67. Iverson JB. Hekking og foreldreomsorg i skilpadden, Kinosternon favescens. Kan J Zool. 1990;68:230–233.

68. Licht P. Endokrine mønstre i reproduksjonssyklusen til skilpadder. Herpetologica. 1982;38:51–61.

69. Graham SP, Ward CK, Walker JS, Sterrett S, Mendonça MT. Seksuell dimorfisme og seksuell variasjon av reproduktive hormoner i Pascagoula Map Turtle, Graptemys gibbons. Copeia. 2015;103:42–50.

70. Shelby JA, Mendonça MT, Horne BD, Seigel RA. Sesongvariasjon i reproduktive steroider av mannlige og hunnlige gulflekkede kartskilpadder, Graptemys favimaculata. Gen Comp Endocrinol. 2000;119:43–51.