Samtidig stabilisering av aktincytoskjelett i flere nefronspesifikke celler beskytter nyrene mot forskjellige skader

Kroniske nyresykdommerogakutt nyreskadeer mekanistisktydelige nyresykdommer. Mens kroniske nyresykdommer er forbundet medpodocyttskade, akutt nyreskadepåvirker renale tubulære epitelceller. Til tross for disse forskjellene,et kardinaltrekkav beggeakutte og kroniske nyresykdommerer det dysregulerte aktincytoskjelettet. Det har vi vistfarmakologisk aktivering av GTPase dynaminlindrer podocyttskade imurine modeller av kroniske nyresykdommeravfremme aktinpolymerisasjon. Her etablerer vi dynamins rolle i å modulere stivheten og polariteten tilrenale tubulære epitelcellerved å tverrbinde aktinfilamenter til forgrenede nettverk. Aktivering av dynamins tverrbindingsevne av en liten molekyl agonist stabiliserer actomyosin cortex i den apikale membranen mot skade, som igjenbevarer nyrefunksjoneni ulike murine modeller av akutt nyreskade. Spesielt demper en dynaminagonist podocytter ogtubulær skadei den genetiske murine modellen av Alport syndrom. Vår studie gir bevis for gjennomførbarheten og fremheverfordelene med nye holistiske nefronbeskyttende terapier.

KLIKK HER FOR Å KJENE EN URTEFORMULERING AV CISTANCHE GOD VED AKUTT NYRESKADE

Deledende årsaker til akutt nyreskade(AKI) eriskemi, hypoksi, ellernefrotoksisitet 1. Selv om det kan reverseres, representerer AKI et betydelig helseproblem med høy dødelighet og ingen definitiv behandling. Uavhengig av etiologi, skader AKI primært polariserte epitelceller i nyretubuli, hvis apikale mikrovilli danner den rørformede børstekanten som deltar i koordineringen av essensiell elektrolytt- og vanntransport2. Et tidlig morfologisk trekk ved AKI er tapet av børstekanten og cellepolariteten på grunn av nedbrytningen av actomyosin cortex ved den apikale membranen1.

Etablering og vedlikehold av cellepolaritet involverer signalkaskader, membrantrafikk og cytoskjelettdynamikk, som alle er svært koordinerte3. Organiseringen av den apikale membranen bestemmes i stor grad av arkitekturen til actomyosin-nettverkene4, som etablerer cortex-stivhet, og dermed letter grupperingen av polaritetsproteiner. Mens myosin II-motorer regnes som den primære generatoren av kortikal stivhet5,6, er arkitekturen til actomyosin cortex etablert av et mylder av aktinbindende proteiner (ABPs)7.

I tillegg til kjente ABP, er børstekanten til nyretubuli sterkt beriket i dynamin8, en GTPase som er mest kjent for sin rolle i endocytose9. Dynamin har en iboende tilbøyelighet til å settes sammen til flere oligomeriseringstilstander som dimerer, tetramerer, ringer og spiraler9. Vi identifiserte for første gang direkte dynamin-aktin-interaksjoner10 og viste at dynamins oligomerisering regulerer aktinpolymerisering i podocytter11,12, spesialiserte celler som er essensielle for selektiviteten til nyrefilteret. Ved å bruke murine modeller av CKD har vi vist at aktivering av dynaminavhengig aktinpolymerisering reverserer podocyttskade ved å gjenopprette deres unike struktur og funksjon12.

Her viser vi det irenale tubulære epitelceller, dynamin kryssbinder filamentøst aktin (F-aktin) til forgrenede nettverk. Dynamins tverrbindingsevne er definert av dens oligomeriseringstilstand og lengden av F-aktin. Farmakologisk aktivering av dynaminoligomerisering motvirker AKI ved å stabilisere aktinnettverkene og dermed celleintegriteten, som delvis beskytter nyreepitelceller fra skader forårsaket av oksidativt stress. Studien vår identifiserer actomyosin cortex i den apikale membranen til den renale tubulære cellen som et medisinerbart mål i AKI via dynamin som en proxy

Resultater Dynaminoligomerisering etablerer stivheten og morfologien til den apikale membranen.

For å undersøke rollen til dynamin-aktin-interaksjoner i polariserte renale tubulære epitelceller, brukte vi Bis-T-23, en allosterisk aktivator for aktinavhengig dynamin-oligomerisering i et rekonstituert system13, i cellene11,13 og i hele organismen 12. Cellulære fenotyper ble vurdert i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-celler ved å følge statusen til F-aktinet og fargemønsteret til et tight junction-protein zonula occludens-1 (ZO-1), som er betraktet som en biomarkør for cellepolaritet. Cytochalasin D (CytoD) og latrunculin A (LatA), kjente hemmere av aktinpolymerisering, reduserte F-aktinnivåer og induserte diskontinuerlig ZO-1-farging (tilleggsfigur 1a). Derimot induserte Bis-T-23 en liten økning i F-aktin-nivåer uten noen effekt på ZO-1-farging. Tilsetning av Bis-T-23 før men ikke etter LatA, delvis bevart F-aktinnivåer og cellepolaritet. Verken DMSO-vehikel eller dynamininhibitor dynole14 viste noen effekt (tilleggsfigur la).

Skanneelektronmikroskopi (SEM) tillot oss å visualisere medikamentinduserte endringer av cellemorfologi med fokus på den apikale membranen (fig. 1a). Gjennomsnittlig MDCK-cellehøyde var 11 ± 2 µm, og gjennomsnittlig lengde på mikrovilli var 0.63 ± 0.2 µm (tabell 1), som er innenfor området observert i nyrene15. LatA reduserte cellehøyden og mikrovilli-lengden og flyttet de jevnt fordelte mikrovilliene inn i klynger, mens Bis-T-23 induserte de motsatte effektene (tabell 1, fig. 1a). Når den ble lagt til før LatA, bevarte Bis-T-23 delvis cellehøyde og mikrovilli-lengde. Siden mikrovilli viser utsøkt lengdekontroll definert av det kortikale aktinet ved base16, gir disse dataene bevis på at Bis-T-23 modifiserte actomyosin-cortex ved den apikale membranen.

For å bestemme den nøyaktige effekten som Bis-T-23 hadde på det kortikale aktinet, visualiserte vi aktomyosin-cortex i lamellipodia ved bruk av platina-replika elektronmikroskopi (PR-EM). LatA reduserte tettheten til aktinnettverkene, og denne effekten ble delvis opphevet ved tilsetning av Bis-T-23 før LatA (fig. 1b). Ettersom LatA akselererer aktinfilamentdepolymerisering ved å sekvestrere aktinmonomerer, undersøkte vi deretter om den observerte bevaringen av actomyosin cortex av Bis-T-23 skyldtes dens positive effekt på aktinpolymerisasjon. I motsetning til den potente stimuleringen av aktinpolymerisasjon observert i podocyttcelleekstrakter10,11, økte Bis-T-23 bare marginalt aktinpolymerisering i MDCK-celleekstrakt (tilleggsfigur 1b). Tilsvarende resulterte immundeplesjon av endogent dynamin-2 (Dyn2) fra ekstraktet eller hemming av dets GTPase-aktivitet ved hjelp av dynode i marginal svekkelse av aktinpolymerisering (tilleggsfigur 1c). Mens LatA og CytoD svekket aktinpolymerisasjonen betydelig, var tilsetningen av Bis-T-23 før LatA eller CytoD ikke i stand til å overvinne deres hemmende effekter (tilleggsfigur 1d, e). Jasplakinolid, et medikament som induserer aktinpolymerisasjon ved å stimulere aktinfilamentkjernedannelse17, økte ikke det totale polymerisasjonsnivået signifikant (tilleggsfigur 1d), noe som tyder på at MDCK-cellelysat viser et nesten maksimalt nivå av polymerisert aktin. Sammen indikerte disse dataene at effekten av Bis-T-23 på morfologien til den apikale membranen i MDCK-celler ble drevet av en annen mekanisme enn aktinpolymerisering.

Gitt den vanlige kunnskapen om beriket lokalisering av Dyn2 og F-aktin ved børstegrensen til nyreepitelceller8, og dynamins rolle i endocytose, undersøkte vi deretter om Bis-T-23 påvirket aktin indirekte via endringer i endocytose. Som forventet samlokaliserte både Dyn2 og F-aktin seg ved actomyosin cortex under den apikale membranen, i mikrovilli, og ved clathrin-belagte groper (CCPs), definert av deres distinkte form og størrelse (tillegg Fig. 1f). Vi undersøkte dynamikken til CCP-er ved å bruke total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi18,19. Bis-T-23, selv ved sin høyeste konsentrasjon, hadde ingen effekt på fordelingen av CCP-enes levetid, mens dynol reduserte antallet produktive CCP-er (tilleggsfig. 1g). Denne mangelen på korrelasjon mellom nivået av endocytose og endringer i cellemorfologi hevder at Bis-T- 23 målretter mot det kortikale aktinet uten å påvirke dynamins rolle i endocytose.

Siden nyrecellepolariteten opprettholdes av arkitekturen og vedvarende sammentrekning av actomyosin-nettverkene, som etablerer cellestivhet ved den apikale membranen20, målte vi deretter cellestivhet ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM). Nanowizard IV-system og JPK-analyseprogramvare ble brukt til å bestemme endringer i Youngs Modulus21 under forskjellige eksperimentelle innstillinger (Supplerende Fig. 2a). Behandling med LatA resulterte i en signifikant reduksjon i celle-celle-kontaktstivhet og apikal cellestivhet i MDCK-celler (fig. 1c-e). Derimot økte Bis-T-23 cellestivheten betydelig sammenlignet med DMSO-bæreren (fig. 1c–e), i samsvar med dens positive effekter på cellehøyde, antall mikrovilli og tettheten til aktinnettverk (tabell 1 og Fig. lb)22. Tilsetningen av Bis-T-23 før LatA reduserte sterkt den negative effekten av LatA på cellestivhet (fig. 1c–e), i samsvar med Bis-T-23s positive effekt på aktinnettverk og apikal cellemorfologi (tabell 1, fig. 1b).

Fig. 1 Dynaminoligomerisering definerer cellestivhet ved å påvirke aktinarkitekturen i nyreepitelceller. et representativt SEM-bilde av MDCK-celler behandlet med DMSO (0.1%) eller Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) i 1 0 min før tilsetning av DMSO (0.1%) eller LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) for 2{{23} } min. Forstørrede bilder av innfellingene (regioner med oransje bokser) viser arrangementet, distribusjonen og tettheten til mikrovilli ved den apikale membranen. b Representative PR-EM-bilder av MDCK-celler behandlet som forklart i (a). Bildene viser endringer i organiseringen av actomyosin cortex i MDCK-celler under de angitte forholdene. c Representative bilder av Youngs Modulus-kart av MDCK-celler behandlet som forklart i (a). d, e Søylediagrammer som representerer Youngs modul som viser cellestivhet målt ved celle-celle-krysset (d) eller ved den apikale membranen (e). Hvert symbol representerer den gjennomsnittlige stivheten til en enkelt celle. Resultatene vist i d, e ble generert fra minst 10 celler fra minst tre kulturskåler. Feilstreker, gjennomsnitt ± SD (*P Mindre enn eller lik 0,05, **P Mindre enn eller lik 0,01, ***P Mindre enn eller lik 0,001, ****P Mindre enn eller lik 0,0001, uparet to-hale t-test). ns, ikke signifikant.

Vi har også bestemt cellestivhet ved å bruke BioScope II-systemet som en alternativ eksperimentell tilnærming for AFM. I dette tilfellet ble kraftinnrykkskurver oppnådd etter modellen til Discher og medarbeidere beregnet med Matlab-programvare23. Lignende trender med hensyn til cellestivhet ble registrert for samspillet mellom LatA og Bis-T-23 (Supplerende Fig. 2b, 2c). I tillegg viste ikke dynode noen effekt på cellestivhet, mens CytoD reduserte cellestivhet signifikant (Supplerende Fig. 2d, e), i samsvar med deres aktinfenotyper (Supplerende Fig. 1a). Sammen etablerer disse dataene korrelasjonen mellom statusen til actomyosin cortex, cellestivhet, morfologien til den apikale membranen og cellepolaritet. Disse funnene demonstrerer også overbevisende rollen til dynaminoligomerisering i å definere mekaniske parametere for epitelcellepolaritet via dens effekt på actomyosin cortex

Dynamin tverrbinder aktinfilamenter til forgrenede nettverk som ligger til grunn for cellepolaritet. For å belyse den molekylære mekanismen som dynaminoligomerisering påvirker arkitekturen til actomyosin cortex, undersøkte vi deretter effekten av dynamin på aktinfilamenter i et rekonstituert system. Basert på den nåværende hypotesen, definerer lengden av aktinfilamenter deres tverrbindingsmåte6. Siden den gjennomsnittlige lengden av kortikale aktinfilamenter i et nettverk i forkanten er mellom 100 og 150 nm24, undersøkte vi effekten av dynamin på organiseringen av kortere filamenter generert ved å dekke F-aktin med gelsolin (Gsn-aktin) (fig. 2a). Tilsetningen av Dyn2 resulterte i dannelsen av store, forgrenede nettverk (fig. 2b, c). Basert på størrelsene og formene til rekombinant Dyn2 (fig. 2d), ble nettverkene hovedsakelig dannet av Dyn2-dimerer (Dyn2DIMER) og tetramerer (Dyn2TETRA) som interagerte med flere aktinfilamenter (fig. 2e): Dyn2DIMER bundet opp til to filamenter, Dyn2TETRA bandt opp til fire filamenter, og Dyn2RING bandt opp til seks filamenter. Lav forstørrelse av bildene avslørte at dynaminavhengige nettverk danner et mønster av mindre og større ringlignende former (fig. 2c).

For å korrelere observasjoner fra det rekonstituerte systemet med dynamins rolle i celler, bestemte vi deretter lokaliseringen av endogen Dyn2 på kortikale aktinnettverk ved å bruke et monoklonalt anti-Dyn2-antistoff etterfulgt av et gullkonjugert sekundært antistoff (tilleggsfigur 3a–c). Som sett i det rekonstituerte systemet, er dynamin assosiert med et distinkt antall F-aktin i forgrenede nettverk (fig. 2f). Sammen identifiserer disse dataene en ny aktivitet av dynamin, som tverrbinder F-aktin til forgrenede nettverk.

For å korrelere dynamins tverrbindingsevne og den beskyttende effekten av Bis-T-23 på actomyosin cortex og morfologien til den apikale membranen, undersøkte vi deretter effekten av Bis-T-23 på dynaminmediert nettverk i rekonstituerte systemer (fig. 3a). Basert på konturplott, som gir topografiske representasjoner av varierende filamenttettheter, økte Bis T-23 samlet nettverkstetthet (fig. 3a), noe som kan forklares med økningen i antall F-aktin bundet til dynamin pga. økningen i oligomeriseringen. I tillegg tverrbundet dynamin kortere filamenter mer potent enn langt F-aktin (fig. 3a–c), noe som tyder på at dynamins evne til å danne forgrenede nettverk er definert av dens oligomeriseringsstatus og lengden på aktinfilamenter. Evnen til å tverrbinde aktinfilamenter til nettverk ble delt av to dynaminisoformer, allestedsnærværende uttrykt Dyn2 og nevronspesifikk dynamin-1 (Dyn1) (fig. 3b, c).

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Butikk:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop