Abstrakt
Bakgrunn AKI er en vanlig følge av infeksjon med SARS-CoV-2 og bidrar til alvorlighetsgraden og dødeligheten av COVID-19. Her testet vi hypotesen om atnyreforandringerindusert av COVID-19-assosiert AKI kunne påvises i celler samlet fra urin. Metoder Vi utførte encellet RNA-sekvensering (scRNAseq) på celler gjenvunnet fra urinen til åtte sykehusinnlagte pasienter med COVID-19 med (n55) eller uten AKI (n53) samt fire pasienter med ikke-COVID–19 AKI (n54) for å vurdere forskjeller i cellulær sammensetning og genuttrykk under AKI. Resultater Analyse av 30 076 celler avslørte et mangfoldig utvalg av celletyper, hvorav de fleste varnyre, urotelceller og immunceller. Baneanalyse av tubulære celler fra pasienter med AKI viste berikelse av transkripsjoner assosiert med skaderelaterte veier sammenlignet med de uten AKI. ACE2- og TMPRSS2-ekspresjonen var høyest i urotelceller blant celletyper som ble gjenvunnet. Spesielt hos en pasient oppdaget vi SARS-CoV-2 viralt RNA i urotelceller. Disse samme cellene ble beriket for transkripsjoner assosiert med antivirale og antiinflammatoriske veier. Konklusjoner Vi utførte med suksess scRNAseq på urinsediment fra sykehusinnlagte pasienter med COVID-19 for ikke-invasivt å studere cellulære endringer assosiert med AKI og etablerte et datasett som inkluderer både skadde og uskadde nyreceller. I tillegg gir vi foreløpige bevis på direkte infeksjon av urinblæreceller med SARS-CoV-2. Urinsedimentet inneholder et vell av informasjon og er en nyttig ressurs for å studere patofysiologien og celleendringene som skjer inyresykdommer.
ØKOLOGISK HELSEMAT FOR NYREHELSE
Introduksjon
Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)-infeksjon utløser patologi på tvers av flere systemer, inkludert nyrene, og AKI er assosiert med betydelig sykelighet og dødelighet i koronavirussykdom 2019 (COVID-19) (1 –5). Flere studier har vist høye forekomster av AKI blant sykehuspasienter med COVID-19 (6), med noen rapporterte at opptil 50 % av infiserte individer utvikler AKI (7–9). Den primære SARS-CoV-2-reseptoren ACE2 uttrykkes på epitelceller i hele urinsystemet, inkludert proksimale tubuliceller og urotelceller (10–13), selv om det er uklart om AKI hos pasienter med COVID-19 skyldes direkte virusinfeksjon i de proksimale tubuli eller er et resultat av systemisk respons på SARS-CoV-2 (14–22). Tilsvarende er det uklart om SARS-CoV-2 kan forårsake viral cystitt via direkte infeksjon av urotelceller, selv om denne muligheten har blitt foreslått (23–26). Til tross for den høye forekomsten av COVID-19-assosiert AKI, forblir de underliggende cellulære endringene som skjer i innstillingen av AKI dårlig forstått.
COVID-19-assosiert AKI har forblitt stort sett understudert ettersom tilgang til nyrevev krever biopsi eller postmortem-analyse (27). Nyere studier har oppdaget et mangfold av nyre-, blære- og immunceller i urinen (28–30). Dermed kan urinen gi verdifull innsikt i den ikke-invasive studien av nyreforandringer under COVID-19-assosiert AKI. Her utførte vi encellet RNA-sekvensering (RNA-Seq) for å karakterisere det cellulære mangfoldet i urinen til sykehuspasienter med COVID-19 med og uten AKI. Vi testet hypotesen om at nyreforandringer i COVID-19-assosiert AKI kunne oppdages i celler samlet fra urin. Vi har også samlet inn prøver fra pasienter uten COVID-19 og med AKI (ikke-COVID-19 AKI). Vi fant flere inflammatoriske immuncellepopulasjoner og differensielt aktiverte veier i COVID-19-assosiert AKI samt foreløpige bevisfor direkte infeksjon av urotelceller med SARS-CoV-2.
Materialer og metoder
Deltakere og variabler Voksne i alderen 18 år og eldre ble screenet under innleggelse eller overføring til University of Alabama at Birmingham (UAB) sykehus mellom mars og mai 2021. Tilfeller av AKI ble identifisert ved hjelp avNyresykdomForbedring av Global Outcomes-definisjonen som en økning i serumkreatinin (sCr) .0.3 mg/dl innen 48 timer eller .1.53 baseline kreatinin. Kontroller uten endring i kreatinin ble valgt basert på alders- og kjønnsmatching der det var mulig og behandlet med hver respektive AKI-prøve. Baseline sCr ble bestemt ved å bruke den nyeste sCr-verdien 7–365 dager før sykehusinnleggelse. Ytterligere kliniske data angående demografi, medisinsk historie, kliniske egenskaper og laboratorieverdier ble hentet ut fra pasientdiagrammer gjennom UAB Center for Clinical and Translational Sciences i2b2-teamet. Åtte sykehuspasienter med COVID-19, fem med AKI og tre uten AKI, ble inkludert. Denne studien og prøvesamlingen ble godkjent av UAB Institutional Review Board. UAB Acute Nephrology Consult Team samlet også inn prøver fra pasienter med ikke-COVID-19 AKI (n54) for å sammenligne cellulære endringer med COVID-19-assosiert AKI. Disse ble samlet inn under en annen protokoll for institusjonell vurderingsstyre som tillater innsamling av gjenværende urinprøver og dermed er anonyme.
Prøveinnsamling og -behandling
Alle trinn ble utført på is. Urin ble tatt enten som en tømt prøve eller fra et urinkateter. Prøver ble umiddelbart overført til et biosikkerhetsnivå 21-laboratorium for behandling. Urinprøver ble overført til et 50-ml konisk rør og sentrifugert ved 10003g i 10 minutter ved 4 C. Cellepelleter ble vasket med iskald PBS, filtrert gjennom et 40-mm filter og sentrifugert igjen. Levende celler ble renset ved å bruke MACS Debris Removal Kit (Miltenyi Biotec) etterfulgt av EasySep Annexin V Dead Cell Removal Kit (StemCell). Kort fortalt ble cellene resuspendert i iskald PBS og blandet med en løsning for fjerning av rusk. Kald PBS ble lagt på blandingen og sentrifugert ved 3003 g i 10 minutter ved 4 C. De to øverste fasene ble aspirert, og deretter ble de gjenværende cellene vasket med PBS. Cellene ble resuspendert og blandet med Dead Cell Removal Cocktail, Biotin Selection Cocktail og deretter RapidSpheres før separasjon i en EasySep-magnet. Celler ble vasket og resuspendert i 52 ml PBS (ingen kalsium eller magnesium) 10,04 % BSA (Fisher Scientific) for scRNAseq-behandling
scRNAseq
Rensede celler ble overført til UAB Flow Cytometry og Single Cell Core og umiddelbart behandlet ved bruk av Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit (103)Genomics) ifølge produsenten's instruksjoner.Cellesuspensjonen ble talt, kombinert med de 103 Kromreagensblanding, og lastet inn i en mikrofluidiskenkeltcelle partisjonering enhet der lysis og reverseringtranskripsjon forekommer i mikrodråper. Det resulterende cDNAvar amplified ved PCR og deretter behandlet for å gi
strekkodede sekvenseringsbiblioteker. Paret-ende-sekvensering ble utført på Illumina NovaSeq6000 eller NextSeq500 sekvenseringsplattform (Illumina). Lesninger ble behandletbruker 103 Genomics Cell Ranger encellet programvareSuite versjon 6.0 på UAB Cheaha High-PerformanceDataklynge. BCLfiles ble konvertert til FASTQfiles ved hjelp av CellRanger rask funksjon. CellRangerfast ble brukt til å justere FASTQfiles til et tilpasset genombestående av hg38 humant genom (GRCh38.p13) med
SARS-CoV-2-genomet (NC_045512.2) satt inn som et ekson (31). Gentabellen, strekkodetabellen og transkripsjonelle uttrykksmatriser ble opprettet for analysenangitt nedenfor.
Dataanalyser
Analyser ble utført ved bruk av pakker laget for R statistisk analysemiljø (versjon 4.06). Data ble primært analysert i Seurat versjon 3.2.3 (32,33) og denstilhørende avhengigheter. Data fra hver pasientble importert ved hjelp av Read103 funksjon og deretter strukturomgjort til et Seurat-objekt ved hjelp av CreateSeuratObject. Tilkvalitetskontroll, celler med unike funksjoner teller over 2500eller under 200 og celler med mitokondrielle proporsjoner på.15 % varfilterte ut. Data ble normalisert ved hjelp av LogNormaliser og skalert for å forberede lineær dimensjonalreduksjon. Objekter fra individuelle pasienter ble merketmed unik gruppeidentitetfikationer og deretter slått sammen til enenkelt objekt ved hjelp av Seurat-flettingsfunksjonen. Pasient samples ble integrert med RunHarmony-funksjonen ved hjelp avHarmony R-pakken (34). Hovedkomponentanalyseble utført, og deretter ble celler gruppert basert pådifferensielt genuttrykk som bestemt av SeuratFindAllMarkers-funksjonen er satt til en oppløsning på én. Dimensjonell reduksjon ble utført ved bruk av uniform manifoldtilnærming og projeksjon. Celletyper var identiskefiutgved å sammenligne de differensielt uttrykte transkripsjonene forhver klynge med kjente transkripsjoner assosiert med specific celletyper (29,35,36). Escape R-pakken ble brukt til å kjøreGene Set Enrichment Analysis (GSEA) (37). WebGestaltRble brukt til genontologianalyse for å identifisere veierved å bruke den biologiske prosessen og Kyoto Encyclopedia ofGen- og genomdatabaser (38).
