[18F]-natriumfluorid autoradiografi avbildning av nefrokalsinose i donor nyrer og eksplanterte nyre allograft

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrokalsinoseer tilstede i opptil 43 prosent avnyreallograftbiopsier ett år etter transplantasjon og er assosiert med dårligere graftfunksjon og dårlig graftoverlevelse. Vi studerte [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) avbildning av mikrokalsifikasjoner i donor nyrer (n= 7) og eksplantertenyreallografts (n= 13). Tre µm parafininnstøpte seriesnitt ble brukt for histologisk evaluering av forkalkning (Alizarin Red; Von Kossa-farging) og ex-vivo [18F]-NaF autoradiografi. Bildene ble smeltet sammen for å evaluere om mikrokalsifikasjonsområder samsvarte med [18F]-NaF-opptaksområder. Basert på histologiske analyser var tubulointerstitielle og glomerulære mikrokalsifikasjoner til stede i henholdsvis 19/20 og 7/20 prøver. Ved bruk av autoradiografi ble [18F]-NaF-opptak funnet i 19/20 prøver, med betydelig mer sporstoffaktivitet inyreallograft sammenlignet med nyreprøver fra avdøde donor (p {{0}}.019). Alizarin Red-farging av aktive mikrokalsifikasjoner viste god korrelasjon (Spearman's rho på 0.81, p < 0.001),="" og="" von="" kossa-farging="" av="" konsoliderte="" forkalkninger="" viste="" signifikant,="" men="" svak="" korrelasjon="" (0.62,="" p="0.003)" med="" [18f]-naf-aktivitet.="" denne="" korrelasjonen="" mellom="" ex-vivo="" [18f]-naf-opptak="" og="" histologisk="" beviste="" mikrokalsifikasjoner,="" er="" det="" første="" trinnet="" mot="" en="" avbildningsmetode="" for="" å="" identifisere="" mikrokalsifikasjoner="" i="">nefrokalsinose. Dette kan føre til en bedre forståelse av etiologien til mikrokalsifikasjoner og deres innvirkning på nyretransplantasjonsfunksjonen.

Klikk for å cistanche uttrekk fordeler for nyresykdom

Nefrokalsinose, definert som parenkymal og tubulær avsetning av kalsiumoksalat (CaOx) eller kalsiumfosfat (CaPhos), er en viktig faktor i nedgangen i graftfunksjonen etternyretransplantasjon 1–3. Avsetning av CaOx og CaPhos tilskrives høye nivåer av serumoksalat, serumkalsium og serumfosfat hos pasienter med kroniskenyresykdom og/eller hyperparatyreoidisme4,5. Forekomsten avnefrokalsinose, basert på nyre-allograft-biopsier, er 6 prosent ved 6 måneder, 25–43 prosent etter ett år og opptil 79 prosent ved 10-år etternyretransplantasjon5–7. Studier med fokus på nyreallograftbiopsier innen ett år etter transplantasjon viste en sammenheng mellom tidlig tilstedeværelse av kalsiumavsetninger og både dårligere graffunksjon og dårlig grafoverlevelse4,8,9. Hvorvidt disse mikrokalsifikasjonene spiller en aktiv rolle i allograft-dysfunksjon eller bare er indikatorer på deregulert mineralmetabolisme er fortsatt uklart.

Til dags dato,nyreallograftbiopsier er den eneste diagnostiske metoden for å evaluere mikrokalsifikasjoner etter transplantasjon. En ikke-invasiv og pålitelig diagnostisk tilnærming vil tillate gjentatte målinger, lette sporing av forkalkninger over tid og intervensjonsstudier med potensiell forbedring av resultatene for graftfunksjon og graftoverlevelse etter nyretransplantasjon10.

Positronemisjonstomografi/computertomografi (PET/CT) avbildning med [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) brukes i klinisk praksis og eksperimentelle studier som skjelett- og vaskulær avbildningsmodalitet11–15. Mens pålitelig visualisering av vaskulære mikrokalsifikasjoner er hemmet med CT-avbildning, korrelerte resultatene av ex-vivo [18F]-NaF mikroPET-avbildning godt med histologisk beviste mikrokalsifikasjoner i blodkarprøver fra mennesker og dyr16,17. Dessuten viste resultatene fra flere prospektive kliniske studier at tidlig vaskulær [18F]-NaF-aktivitet relaterer seg godt til både mikrokalsifikasjoner, oppdaget ved CT-avbildning, og mer interessant, økningen i størrelsen på disse forkalkningene18–20.

Her presenterer vi resultatene av en proof of concept autoradiografistudie for ex-vivo bruk av [18F]-NaF avbildning avnefrokalsinosehos giverenyrerog transplanterte nyre-allografter som en diagnostisk tilnærming for visualisering av mikrokalsifikasjoner.

Tabell 1.Nyretransplantasjonsmottakers egenskaper. Ingen tilfeller av hyperkalsemi i denne kohorten; *klassifisering av Banf-klassifisering av allograftpatologi—201828; FSGS=Fokal segmentell glomerulosklerose; IFTA=Interstitiell fbrose og tubulær atrofi; tilsvarende autoradiografi og histologi resultater er presentert i tillegg S1.

Tabell 2. Omkomnenyregiveregenskaper. *Kardiovaskulær sykdom definert som en cerebrovaskulær hendelse, hjerteinfarkt, vaskulær sykdom som krever invasiv intervensjon; **som bemerket av innkjøpsteamet; Tilsvarende autoradiografi- og histologiresultater er presentert i tilleggs S2; ingen donorer med diabetes mellitus.

Resultater

Eksempel på kohort.

Trettennyreprøver ble tatt etter transplantektomi, med en median på 33 [IQR 9–66] måneder etter transplantasjon, fra transplantasjonsmottakere med en medianalder på 51 [IQR 30–64] år. Transplantektomi ble utført for allograftavstøtning (Banf IIA og IIB) hos syv pasienter, kronisk allograft-arteriopati hos to pasienter, allograftinfeksjon hos to pasienter, primær ikke-funksjon én pasient, og interstitiell fbrose og tubulær atrofi Grad III hos én pasient. Åtte av 13 (61,5 prosent) pasienter hadde hyperparatyreose, syv (53,8 prosent) hadde hyperfosfatemi, fem (38,5 prosent) hadde diabetes mellitus og ingen av disse pasientene hadde tegn pånefrokalsinosepå klinisk ultralyd eller en historie med nyrestein (tabell 1). Syv avdøde donornyreprøver ble tatt fra donorer med en medianalder på 65 [IQR 64–71] år. Fire av syv (57,1 prosent) givere hadde en historie med kardiovaskulær sykdom, ingen hadde diabetes mellitus og seks av syv (85,7 prosent) hadde aterosklerose i nyrevaskulaturen ved visuell inspeksjon, som er potensielle faktorer for å avslå denne donoren.nyrer(Tabell 2).

Figur 1. Autoradiografibilde av [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF)-opptak (A), med overleggsbilde av [18F]-NaF-opptak med Alizarin-rødfarging av mikrokalsifikasjoner (B) og von Kossa-farging av forkalkninger (C).

Autoradiografi og histologi.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 prosent av 5 (25 prosent) av 20 prøver (Fig. 1 og Fig. 2A) (Supplerende S1 og Supplerende S2, som viser autoradiografi og overleggsbilder for alle prøver). Antall [18F]-NaF-områder var betydelig høyere inyreallograftprøver sammenlignet med avdød donornyreprøver, med en median på 7.0 [IQR 4.0–15.5] og 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], henholdsvis (p=0.019) (Supplerende S3).

Tubulointerstitielle mikrokalsifikasjoner, visualisert med rød Alizarin-farging, var til stede i 19 av 20 prøver, med en median på 5,5 [IQR 2–10.3] per prøve, og glomerulære mikrokalsifikasjoner ble sett i syv ut 20 prøver, med en median på 1 [IQR 1–3] per prøve (fig. 2B). Et signifikant høyere antall mikrokalsifikasjoner ble observert i nyre-allograftprøver sammenlignet med nyreprøver fra avdøde donorer, med en median på 9.0 [IQR 5.0–20.5] og 4.0 [IQR 1.0–4.0], henholdsvis (p=0.046) (Supplerende S3). Med Von Kossa-farging ble tubulointerstitielle forkalkninger sett i 18 av 20 prøver, med en median på 2,5 [IQR 1–5] per prøve, og glomerulære forkalkninger ble sett i syv av 20 prøver, med en median på 1 [IQR 0–3 prøve (fig. 2C). Antall forkalkninger var ikke signifikant forskjellig mellomnyreallograftprøver og nyreprøver fra avdøde donorer, med en median på 4.0 [IQR 2.0–6.0] og 2.0 [IQR 2.{ {9}}–7.0], henholdsvis (p=0.311) (Supplerende S3). Interobservatørreproduserbarheten ble identifisert mellom visuell og halvautomatisk deteksjon av forkalkninger, med en ICC på 0.94 (95 prosent CI 0.85–0.98) for rødfarging av Alizarin og på 0.77 (95 prosent CI 0.42–0.91) for Von Kossa-farging.

Overleggsbilder av autoradiografi og histologiresultater viste samlokalisering av [18F]-NaF-opptak med Alizarin rødfarging for mikrokalsifisering (fig. 1B). Til sammenligning viste overleggsbilder av [18F]-NaF-opptak og Von Kossa-farging av forkalkninger opptak i områder uten histologi-påviste forkalkninger (fig. 1C). Det falske negative [18F]-NaF-opptaket, som prosentandelen av histologisk påviste (mikro)forkalkningsområder utenfor overlegget, var median 0 prosent [IQR 0–25 prosent ] for røde Alizarin-områder og median 100 prosent [65–100 prosent ] for Von Kossa-områder. Alizarin Red-farging av mikrokalsifikasjoner viste god korrelasjon med [18F]-NaF-opptak (Spearmans rho på 0,81 (95 prosent CI 0,57–0,92), p.< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 prosent [18F]-NaF-opptak (fig. 4).

Figur 2. Overleggsbilde av [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) opptak og (Alizarin rød) mikroforkalkninger (A), med Alizarin rød farging for mikrokalsifikasjoner (B) og von Kossa farging for forkalkninger (C).

Resipientkarakteristikker på tidspunktet for transplantektomi.

Ingen forskjeller ble observert mellomnyreallografprøver fra pasienter med (n{0}}) eller uten hyperfosfatemi (n=6), for antall [18F]-NaF-områder (median 5.0 [IQR 2.0–11.8] versus 7.0 [7.0–23.0], s=0.170) , Alizarin rød (median 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390), og Von Kossa (median 5.0 [IQR 3.5–6.3] versus 3.0 [2.{ {59}}–5.0], s=0.247). Sammenligning av nyreallografprøver fra pasienter med (n=8) eller uten (n=5) hyperparatyreoidisme viste ingen forskjeller for antall [18F]-NaF-områder (median 7.0 [IQR 4.0–7.5] versus 7.5 [4.0–23.0], p=0.459), Alizarin red (median 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{103}}.0 [3.5–32.8], s{{76 }}.769), og Von Kossa (median 4.0 [IQR 1.5–5.0] versus 4.5 [2.0–6.8], p{{9{{ 131}}}}.505). Det ble ikke identifisert signifikante forskjeller mellom nyre-allografprøver fra pasienter med (n=5) eller uten (n=8) diabetes mellitus, for antall [18F]-NaF-områder (median 5,5 [IQR 2,5– 19.3] versus 7.0 [6.5–15.5], p=0.524), Alizarin red (median 10.0 [IQR 5.5–24.8] versus 9.0 [4.0–8.5], p=0.833), og Von Kossa (median 3.0 [IQR 2.0–5.8] versus 4.0 [3.5–8.5], p=0.284). For tiden mellom transplantasjon og transplantektomi (måneder) ble det ikke observert noen signifikante korrelasjoner med antall [18F]-NaF-områder (p=0.586), Alizarin red (p=0.667) og Von Kossa (s=0.459). For alderen på transplantasjonstidspunktet ble det ikke observert noen signifikante korrelasjoner med antall [18F]-NaF-områder (p=0.902), Alizarin red (p=0.798) og Von Kossa (p. =0.334). Tilsvarende ble det ikke observert noen signifikante korrelasjoner mellom varigheten av urskiven (måneder) etternyreallograffeil og antall [18F]-NaF-områder (p=0.481), Alizarin red (p=0.565) og Von Kossa (p=0.174).

Figur 3. Korrelasjon av antall [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) områder med Alizarin rødfargede mikrokalsifikasjoner (A) og von Kossa fargede forkalkninger (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 prosent [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF) sporstoffoverflateareal, for antall rødfargede Alizarin-mikrokalsifikasjoner (A) og von Kossa, fargede forkalkninger (B) (median, interkvartilt område).

Diskusjon

I denne proof of concept-studien, ex-vivo [18F]-NaF-opptak hos menneskernyreparenkymprøver viste god korrelasjon med histologisk påviste mikrokalsifikasjoner. Opptak av [18F]-NaF korrelerte sterkere med Alizarin-rødfarging for aktive mikrokalsifikasjoner sammenlignet med Von Kossa-farging av konsoliderte forkalkninger, noe som antyder en rolle for [18F]-NaF-avbildning i identifiseringen av områder i tidlig stadium av nefrokalsinose.

De presenterte prøvene representerer en case-blanding av donor-nyrer og eksplanterte nyre-allografter. Disse to prøvetypene skilte seg med hensyn til sporbinding, med mer [18F]-NaF-opptak observert i eksplanterte nyre-allograftprøver. Dette er i tråd med tidligere publikasjoner som rapporterer en økning i mikroforkalkninger etter nyretransplantasjon5–7. Foreningen avnefrokalsinosemed dårligere graftfunksjon på tidspunktet for biopsi og ett år etter transplantasjon er rapportert i to nyre allograft biopsistudier, med 258 og 149nyretransplanterte henholdsvis8,9. Dessuten, i en longitudinell kohort med 97 nyretransplanterte, er det vist en signifikant dårligere 1-år og 12-års graftoverlevelse hos pasienter med kalsiumoksalatavsetninger (dvs. en graftoverlevelse på 98,6 prosent mot 72,5 prosent og henholdsvis 79,3 prosent mot 49,7 prosent). I multivariat logistisk regresjonsanalyse var tilstedeværelsen av kalsium-oksalatavsetninger uavhengig assosiert med graftap, i en modell inkludert blant annet kreatinin på tidspunktet for biopsi og donor type4. Den spesifikke rollen til mikrokalsifikasjoner i denne kaskaden avnyreNedgang i allograftfunksjonen er fortsatt uklar. I kliniske omgivelser før transplantasjon tilskrives CaOx-avsetninger høye nivåer av serumoksalat, et molekyl som ikke effektivt fjernes under dialyse4. Mens CaPhos-avsetninger oftest sees hos pasienter med hyperparatyreoidisme og høye nivåer av serumkalsium, på grunn av en forstyrret mineralmetabolisme før og etter transplantasjon5. Vi fant ingen forskjeller i histologi- og autoradiografiresultater for hyperfosfatemi, hyperparatyreoidisme, diabetes mellitus, tiden mellom transplantasjon og transplantektomi og dialysevarigheten etter nyreallograftsvikt.

For utvikling av nye behandlingsstrategier for aktive mikrokalsifikasjoner inefrokalsinose, bør dens kliniske relevans med hensyn til (kronisk) transplantasjonssvikt forstås mer omfattende. Med identifisering av en målpopulasjon med høy risikonyretransplanterte, kan kliniske studier utformes for å utforske behandlingsstrategier21. Et mulig fokus kan finnes i oppregulering av endogene forkalkningshemmere, med spesiell vekt på osteopontin3.

Gitt den høye forekomsten avnefrokalsinoseog dets assosiasjon med nyre-allograftfunksjon, er en bedre forståelse av etiologien til mikrokalsifikasjoner nødvendig. En ikke-invasiv og pålitelig diagnostisk tilnærming for å identifisere og kvantifisere mikrokalsifikasjoner i tidlig nefrokalsinose kan muliggjøre studier av virkningen av nefrokalsinose på nyretransplantasjonsfunksjonen. [18F]-NaF-avbildning er av interesse, siden [18F]-NaF-opptak i blodkarprøver fra mennesker og dyr økes i biologisk aktive forkalkningsområder før disse områdene kan visualiseres ved mikrocomputertomografi16,17,22. I nyere kliniske PET/CT-studier ble [18F]-NaF-opptak vist å være relatert til progresjonen av vaskulær forkalkning, noe som gir klinisk bevis for bruk av [18F]-NaF for å oppdage områder med biologisk aktiv forkalkning18–20. Observasjonene i denne studien er i tråd med disse tidligere funnene innen vaskulær avbildning. Det ble påvist en god korrelasjon mellom [18F]-NaF-opptak og de histologisk påviste mikrokalsifikasjonene, mens korrelasjonen med konsoliderte forkalkninger var klart svakere.

Som nevnt ble samlokalisering mellom [18F]-NaF-opptak og Alizarin rød-positive mikrokalsifikasjoner identifisert, mens [18F]-NaF-opptaksområder ikke samlokaliserte seg med Von Kossa-farging av konsoliderte forkalkninger. Disse forkalkede områder, med konsoliderte forkalkninger og ingen tilsvarende [18F]-NaF-opptak kan betraktes som områder med inaktiv forkalkning, der det ikke er noen pågående prosess med mineralisering, som tidligere beskrevet av Irkle et al. i en ex-vivo-studie av karotisforkalkning16. Selv om det kun er validert for vaskulære forkalkninger og ikke fornyreparenkymforkalkninger, støttes det av bindingsegenskapene til [18F]-NaF til den ytre overflaten av forkalkninger og begrenset penetrasjon i faste forkalkninger. Derfor vil [18F]-NaF-opptak være høyere ved mikroforkalkninger, med stort overflateareal, sammenlignet med mikroforkalkninger, med høyt volum, men relativt lite overflate13,16.

Denne proof of concept-studien har også noen begrensninger. For det første, iboende til studiedesignet, representerer resultatene et enkelt tidspunkt, og mangler klinisk oppfølging av forkalkningsprogresjon. For det andre består denne proof of concept-studien av et relativt lavt antall nyreprøver, ettersom transplantektomi etter sen transplantasjonssvikt kun utføres på klinisk indikasjon og tilgjengeligheten av avvist donornyrerfor forskningsbruk er begrenset23. Derfor bør en omfattende analyse av etiologien til kalsiumavsetninger vurderes utenfor rammen av dette prosjektet. For det tredje hindres klinisk oversettelse av resultatene av mangel på kunnskap om in vivo [18F]-NaF-distribusjon i nyrer og effekten av nyresporingsclearance, dvs. lav mål-til-bakgrunn-aktivitet kan begrense visualisering av forkalkninger. For å takle dette problemet bør det optimale øyeblikket for [18F]-NaF PET-avbildning vurderes, dvs. ved hvilket [18F]-NaF virkelig skilles ut og gjenværende aktivitet kommer fra binding til forkalkede områder. Muligens kan dette oppnås med forsinket bildediagnostikk som overstiger tre timer, som utført for vurdering av koronarforkalkninger24. Den reduserte glomerulære filtrasjonshastigheten funnet hos transplanterte kan resultere i en forlenget utskillelsesfase, som krever en lengre periode mellom sporinjeksjon og PET-avbildning, men gjeldende retningslinjer indikerer ikke potensiell nefrotoksisitet av [18F]-NaF-sporstoffet11,25. Et potensielt trinn mellom den her presenterte proof of concept-studien og in vivo-avbildning kan være ex-vivo [18F]-NaF PET-avbildning av normotermiske perfuserte nyrer eller in vivo [18F]-NaF mikroPET-dyrestudier26,27. For det fjerde kan klinisk anvendelse av denne teknikken bli hemmet av kostnadene for å utføre en [18F]-NaF PET/CT-prosedyre og den iboende strålingseksponeringen. Imidlertid kan de nye digitale PET-kamerasystemene med høyere følsomhet redusere begge, på grunn av kortere skannetid og lavere injisert aktivitetsdose.

Styrken til denne proof of concept-studien ligger i den detaljerte en-til-en sammenligningen av mikroforkalkninger identifisert ved [18F]-NaF autoradiografi og histologi. Te [18F]-NaF-opptak i forskjellige prøver kunne sammenlignes uten behov for ytterligere justeringer, da alle prøvene ble inkubert i samme [18F]-NaF-løsning. Dessuten gir denne studien de første dataene som viser en visuell og statistisk samsvar mellom [18F]-NaF-opptak og histologisk beviste mikrokalsifikasjoner i nyreprøver.

Cistanche-nyrefunksjon

For å konkludere gir vi de første dataene for bruk av [18F]-NaF i en autoradiografistudie for å identifisere mikrokalsifikasjoner i aktivenefrokalsinoseetternyretransplantasjon. Denne ex-vivo [18F]-NaF proof of concept-studien er det første skrittet mot potensiell anvendelse av klinisk [18F]-NaF PET/CT hos nyretransplanterte mottakere.

Metoder

Menneskelignyreprøver.

Nyrevev ble oppnådd etter transplantektomi (n=13) og fra kasserte nyrer fra avdøde donorer (n=7) i tilfelle reduksjon av giverens nyre av tilknyttede transplantasjonssentre. Kliniske data fra nyretransplanterte mottakere og donorer ble hentet fra pasientenes medisinske journaler, inkludert tilstedeværelse av hyperparathyroidisme, hyperfosfatemi og diabetes mellitus før transplantektomi, og klinisk patologivurdering av nyre-allograftprøver rapportert ved bruk av Banf Classification of Renal Allograft Pathology28. Forskningsaktiviteter ble utført i tråd med erklæringen om Helsingfors etiske prinsipper for medisinsk forskning som involverer mennesker, og den institusjonelle vurderingskomiteen ga godkjenning for denne studien (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Informert samtykke ble innhentet fra alle transplanterte mottakere og godkjenning før donasjon ble gitt for bruk av kasserte nyrer fra avdøde givere til forskningsformål. De kliniske aktivitetene og forskningsaktivitetene var i samsvar med prinsippene for Istanbul-erklæringen som skissert i 'Deklarasjonen fra Istanbul om organhandel og transplantasjonsturisme.

Standard operasjonsprosedyre (SOP) for vevsprøvetaking var som følger: Prøver ble tatt på det kirurgiske teatret, umiddelbart etter nyreekstraksjon (for transplantektomi), eller ved ankomsten av den kasserte donorennyrei vårt transplantasjonssenter. Prøvene som ble brukt til dette eksperimentet ble tatt i tverrplanet til den øvre polen, inkludert kortikalt og medullært nyrevev, med en størrelse mellom 25 mm × 15 mm og 20 mm × 40 mm. Disse prøvene var formalinfiksert og parafininnstøpt. Ved å bruke et mikrotom presisjonsskjæreinstrument ble det laget tre µm parafininnstøpte seksjoner. Disse seksjonene ble montert på adhesjonsmikroskopglass (TOMO, Matsunami Glass, USA). Serieseksjoner, dvs. tilstøtende seksjoner som avslører sekvensielle lag avnyrevevsprøver, ble brukt til autoradiografi og histologisk analyse. Før sporinkubering og histologisk farging ble seksjoner deparafnisert, rehydrert i demineralisert vann og midlertidig lagret i fosfatbufret saltvann (PBS).

[18F]-NaF inkubasjon og autoradiografi.

Ex-vivo-eksperimentet var basert på protokollen som ble brukt i de tidligere studiene av Hop et al. og Reijrink et al.22,29. Den første studien er en autoradiografisk studie på [18F]-NaF-opptak i carotisplakk fra slagpasienter som gjennomgår operasjon, med CT-basert indikasjon på forkalkning som sammenligning. Den andre studien er en autoradiografistudie på [18F]-FDG-opptak i fettvevsprøver, med immunhistokjemi av seriesnitt som sammenligning. En av hver tre serielle seksjoner ble badet i en løsning av [18F]-NaF, ved en konsentrasjon på 618 millibecquerel (MBq) i 300 ml PBS, ved romtemperatur, i 30 minutter. Vasking ble utført ved tre ganger å skylle med kaldt PBS og to ganger med kaldt vann. Prøver ble tørket i friluft og en blank fosforskjerm ble plassert over prøvene. Eksponering ble utført over natten, i en periode på 24 timer og 30 minutter. Bestemmelse av vevsaktivitetsfordeling og intensitet ble utført på en fosforskjerm ved bruk av Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA).

Alizarin rød og von Kossa-farging.

Alizarin rødfarging ble utført for å visualisere kalsiumakkumulering i tidlig forkalkning. Prøver ble inkubert i 2 % w/v Alizarin red (oppløst i demineralisert vann), pH 4,2 i 5 minutter30. Vasking ble utført ved 20 ganger skylling i 1:1 aceton/xylen og 20 ganger skylling i 100 prosent xylen. Von Kossa-farging ble utført for å visualisere tilstedeværelsen av uorganiske fosfatmolekyler i konsoliderte forkalkninger. Kort fortalt ble prøver inkubert i 1 prosent sølvnitrat (AgNO3) løsning i 1 time, mens de ble utsatt for sollys30. Vekslet med tre ganger skylling i demineralisert vann, ble inkubering utført med natriumtiosulfat i 5 minutter, etterfulgt av inkubering i kjernefysisk rødt i 3 minutter.

Bildebehandling og analyser.

Fargede vevssnitt ble digitalisert med Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), og bildene ble inspisert ved hjelp av Aperio ImageScope programvareversjon 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Tyskland). Autoradiografi og kvantitative datastyrte bildeanalyser ble utført med ImageJ-programvare, versjon 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Bakgrunnssubtraksjon ble brukt for alle histologibilder, og satt inn en kontur ved grensen til histologiprøven. Halvautomatisk påvisning av forkalkninger i Alizarin red og Von Kossa-farging ble utført med ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Terskler ble brukt for alle prøver og detekterte forkalkningsområder ble utvidet med 6 iterasjoner for å optimalisere visualisering. For autoradiografibildene ble rotasjon og re-størrelse utført basert på de originale histologiprøvene. Terskler ble brukt for alle prøver, noe som resulterte i områder med sporopptak, etter tilnærmingen beskrevet av Irkle et al.: bilder ble terskel ved bruk av Otsu-metoden, etterfulgt av Gaussisk uskarphet og terskel med Li-metoden16. Overleggsbilder ble oppnådd ved å matche konturene fra de tilstøtende histologibildene, med den påfølgende matchingen av histologi- og autoradiografiresultatene (fig. 1). Pikselbasert kvantifisering av forkalkning og sporstoffareal (som en prosentandel av prøvearealet) ble utført med ImageJ—Analyze Particles-verktøyet.

Cistanche-nyresykdom symptomer

Statistiske analyser.

Statistikk ble utført med Statistical Package for the Social Sciences versjon 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), grafer ble laget med GraphPad Prism 7.02 for Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, USA) og figurer ble produsert med Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, USA). Resultatene ble presentert som median og interkvartilområde (IQR) for skjeve data, og som frekvens og prosentandel når data var kategoriske. Vi sammenlignet grupper ved å bruke Mann–Whitney U-tester (to-tailed pvalue<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Datatilgjengelighet

Avdøde donor nyre ognyretransplantasjonsmottaker autoradiografibilder av [18F]-natriumfluorid ([18F]-NaF)-opptak, med overleggsbilder av [18F]-NaF-opptak med Alizarin-rødfarging av mikroforkalkninger og Von Kossa-farging av forkalkninger er tilgjengelig online som tilleggsinformasjon. Alle tilleggsdata vil bli gjort tilgjengelig på forespørsel, i tråd med IRB-regelverket til University Medical Center Groningen.

Referanser

1. Gwinner, W. et al. Tidlig forkalkning av nyre-allograft oppdaget ved protokollbiopsier: årsaker og kliniske implikasjoner. Er. J. Transplant. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Hva ernefrokalsinose?. Nyre Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin beskytter mot høy fosfatindusertnefrokalsinoseog vaskulær forkalkning. Nyre Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Den tidlige tilstedeværelsen av kalsiumoksalatavsetning inyregraftebiopsier er assosiert med dårlig langsiktig graftoverlevelse. Er. J. Transplant. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Lokalisering, etiologi og påvirkning av kalsiumfosfatavleiringer i nyre-allotransplantater. Er. J. Transplant. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankvell, BJ et al. Den naturlige historien om kronisk allograft nefropati. N. Engl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Risikofaktorer for kronisk allograft nefropati etter nyretransplantasjon: en protokollbiopsistudie. Nyre Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Oksalatavleiringer i biopsier fra innfødte og transplanterte nyrer, og innvirkning på graftfunksjonen. Nephrol. Slå. Transplantasjon. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Oksalatavsetning i nyreallotransplantatbiopsier innen 3 måneder etter transplantasjon er assosiert med allograftdysfunksjon. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Har vi glemt bildebehandling før og etter nyretransplantasjon?. Eur. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: EANM prosedyreretningslinjer for beinavbildning. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Koronar arteriell 18F-natriumfluoridopptak. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. Opptak av 18F-natriumfluorid er en markør for aktiv forkalkning og sykdomsprogresjon hos pasienter med aortastenose. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Gjennomførbarhet av 18F-natriumfluorid PET/CT for avbildning av aterosklerotisk plakk. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Målidentifikasjon for diagnose og intervensjon av sårbare aterosklerotiske plakk utover 18F-fluorodeoksyglukose positronemisjonstomografi: lovende sporstoffer i horisonten. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identifisering av aktiv vaskulær mikrokalsifisering ved 18F-natriumfluorid positronemisjonstomografi. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 F-fluorid-signalforsterkning identifiserer mikrokalsifikasjoner assosiert med aterosklerotisk plakk-ustabilitet i positronemisjonstomografi/computertomografibilder. Circ. Cardiovasc. Bildebehandling 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vaskulært opptak på 18F-natriumfluorid positron emisjonstomografi: forløper for vaskulær forkalkning? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. Korrelasjon av betennelse vurdert av18F-FDG PET, aktiv mineralavsetning vurdert av18F-fluorid PET, og vaskulær forkalkning i aterosklerotisk plakk: en dual-tracer PET/CT-studie. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Prediktiv verdi av18F-natriumfluorid positron emisjonstomografi ved påvisning av høyrisiko koronararteriesykdom i kombinasjon med computertomografi. J. Am. Heart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogene forkalkningshemmere i forebygging av vaskulær forkalkning: en konsensuserklæring fra COST-aksjonen EuroSofCalcNet. Front. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. 18F-natriumfluorid positron emisjonstomografi vurderte mikrokalsifikasjoner i skyldige og ikke-skyldige humane carotis plakk. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektomi etter transplantasjonssvikt: nåværende praksis og resultater. Er. J. Transplant. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Tre timers forsinket bildebehandling forbedrer vurderingen av koronar 18F-natriumfluorid PET. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Posisjonspapir fra Cardiovascular Committee i European Association of Nuclear Medicine (EANM) om PET-avbildning av aterosklerose. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. DCD-grisens nyrer analysert ved MR for å vurdere deres levedyktighet ex vivo. Transplantation 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Infusjon av mesenkymale stromale celler i svinnyrerunder normotermisk maskinperfusjon: intakte MSC-er kan spores og lokaliseres til glomeruli. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. En referanseguide fra 2018 til Banf-klassifiseringen av nyre-allograftpatologi. Transplantasjon 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F]FDG-opptak i fettvev er ikke relatert til betennelse ved type 2 diabetes mellitus. Mol. Imaging Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. Vaskulær forkalkning og aorta-fbrose en bifunksjonell rolle for osteopontin i diabetisk arteriosklerose. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitativ og kvantitativ evaluering av to nye histogrambegrensende binariseringsalgoritmer. Int. J. Bildeprosess. 8, 30–48 (2014).

Anerkjennelser

Dette forskningsprosjektet er støttet av et stipend fra De Cock-Hadders Foundation (prosjektkode 2018-03).

Forfatterbidrag

SB bidro til design, anskaffelse og analyse, og utarbeidet manuskriptet. IFA, MR og MLCB bidro til utformingen, anskaffelsen og analysen, og reviderte manuskriptet vesentlig. SPB, CM og MHdB bidro til unnfangelsen og reviderte manuskriptet vesentlig. JLH, RHJAS og RAP bidro til unnfangelsen, designen og analysen, og reviderte manuskriptet vesentlig.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.