Studie av antialdringseffekter av kalsitriol på menneskelige naturlige drepeceller in vitro Ⅱ

3. Resultater

Denne studien fokuserte på antialdringseffektene av kalsitriol på NK-celler. Resultatene viste at Calcitriolreduserte uttrykket av aldringsrelaterte biomarkører inkludert CD16, TIM3, PD-1, KIR ogøkte uttrykket av NKG2A av NK-celler. det ogsåhemmet NK-celleproliferasjonogarrestere dem i G1-fasen. Kalsitriolredusert frigjøring av inflammatoriske faktorerslik som IL-5, IL-13, IFN- og TNF- og hadde visseantioksidasjonseffekter, som kan bidra til detanti-aldringseffekter.

Klikk her for å vite Cistanche-antioksidasjonseffekter og få en prøve

3.1 Calcitriol reverserte uttrykket av overflatealdringsmarkørene, bremset NK-celleamplifikasjonen og opprettholdt NK-celler i G1-fasen.

Aldrende NK-celler viste høy ekspresjon av aldringsrelaterte biomarkører, som CD16, PD-1, TIM3 og KIR, og lavt uttrykk for NKG2A. Vi fant at ekspresjonsnivåene til de aldringsrelaterte biomarkørene NKG2A (Figur 1a) (*P < 0.05) økte, mens uttrykket av CD16 (Figur 1b), TIM3 (Figur 1c) ), PD-1 (Figur 1d) og KIR (Figur 1e) (*P < 0,05) ble redusert etter behandling med kalsitriol i 72 timer. Reverseringseffektene var positivt korrelert med konsentrasjonen av kalsitriol (tilleggsfigur 1).

Vi utvidet celler fra menneskelige perifere blodprøver in vitro. Deretter isolerte vi NK-cellene (CD{{0}}CD56 pluss ) ved magnetisk perlesortering (figur 1f). De sorterte NK-cellene ble deretter dyrket med forskjellige konsentrasjoner av kalsitriol eller rapamycin i 72 timer. CCK8-fargingsresultater viste at veksthastigheten til de kalsitriolbehandlede NK-cellene med høy konsentrasjon (10- [7] M) var langsommere enn for den negative kontrollgruppen (NC) (*P < {{17 }}.05) (Figur 1g). I tillegg regulerte kalsitriol NK-cellesyklusen. Etter behandling med kalsitriol i 48 timer, viste NK-celler et høyt kalsitriolkonsentrasjonsavhengig skifte mot G1-fasen (*P < 0,05), mens andelen celler i G2-fasen (#P < 0,05) sank. Andelen kalsitriolbehandlede NK-celler i S-fasen viste ingen endring, uavhengig av konsentrasjonen av kalsitriol (Figur 1h, Supplerende Figur 2). Vi testet deretter om denne kalsitriol-avledede G1-fasestoppet induserte NK-celle-apoptose og fant at den NK-celle-apoptotiske biomarkøren, T-celle-immunoglobulin og immunoreseptor-tyrosin-baserte hemmende motiv (ITIM) domene (TIGIT), viste ingen signifikant endring (P > 0,05) NS) (Figur 1i). Disse resultatene antydet at tilsetning av kalsitriol reduserte veksthastigheten til NK-celler, reduserte deres spredning og induserte G1-fasestopp av NK-cellene i stedet for å forårsake apoptose.

3.2 Kalsitriol reduserte frigjøringen av inflammatoriske cytokiner i NK-celler og hemmet cytotoksisiteten til NK-celler

Betennelse er en kronisk lavgradig betennelse. Det akselererer aldring av NK-celler, ettersom NK-celler deltar i denne kroniske betennelsen. Figur 2a viser at nivåene av IL-5, IL-13, IFN- og TNF- reduserte signifikant i alle grupper enn i den negative kontrollen (*P < 0.05). IFN- og TNF- er velkjente pro-inflammatoriske cytokiner, men noen studier har også vist de pro-inflammatoriske egenskapene til IL-5. IL-13 har blitt rapportert å bidra til ulike typer slimhinnebetennelser, som allergisk astma, ulcerøs kolitt, eosinofil øsofagitt og flere sykdommer relatert til fibrose.

Imidlertid involverer cytotoksisiteten til NK-celler hovedsakelig frigjøring av inflammatoriske cytokiner og degranulering av celler. Vi merket K562-celler med DIO og co-dyrket DIO-K562-cellene med kalsitriol-behandlede NK-celler i 4 timer. Prosentandelen av DIO pluss PI pluss celler var lavere i alle effektor (E)/mål (T) forholdsgruppene enn i den negative kontrollen (*P < 0.05) (Figur 2b, c). Det utledede uttrykket av differensieringskluster 107 (CD107) indikerte lavere degranulering (*P < 0,05) (Figur 2d). Disse resultatene viser inhibering av NK-drepende funksjon av kalsitriol.

3.3 Kalsitriol aktiverte uttrykket av SIRT1- ∆Exon8 og antialdringsrelatert SIRT1/pERK-vei

For å undersøke antialdringseffektene av kalsitriol på NK-celler, oppdaget vi de aldringsrelaterte signalveiene ved immunblotting. Western blotting-analyse ble utført for å vurdere ekspresjonsnivåene til VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 og PERK i de kalsitriolbehandlede NK-cellene. Statistisk analyse viste at kalsitriol aktiverte VDR/SIRT1/pERK-aksen ved høye konsentrasjoner. I mellomtiden aktiverte kalsitriol uttrykket av SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Figur 3a).

Figur 1. Aldringsrelatert fenotype, celleekspansjon og cellesyklusanalyse av NK-celler. (ae) De humane NK-cellene behandlet med kalsitriol eller rapamycin i 72 timer viste følgende cellebiomarkører: naturlig mordergruppe 2 medlem A (NKG2A), differensieringsklynge 16 (CD16), T-celle-immunoglobulin og mucindomene-inneholdende protein 3 ( TIM3) programmert celledød-1 (PD-1), og drepende immunoglobulinlignende reseptor (KIR), som var relatert til aldring. 50 nM rapamycin (RAPA) ble brukt som positiv kontroll. n=3 for hver gruppe. *P < 0.05 og **P < 0.01 ble sammenlignet med den negative kontrollgruppen (NC). (f) NK-celler (til høyre) isolert fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC, venstre) ved magnetisk perlesortering. (g) Celleproliferasjonsanalyse målt ved celletellesett 8 (CCK8). (h) Effekt av kalsitriol eller rapamycin på cellesyklusen i sorterte nk-celler etter behandling i 72 timer, wp 0.0, 0.05 og fp < 0.05 indikerte den signifikante forskjeller i henholdsvis G1-, S- og G2-fasene. Alle gruppene ble sammenlignet med henholdsvis NC. n=3. ) Prosentandelen av T-cellimmunoa-globulin og immunreseptor-tyrosin-baserte hemmende motiv(M)-domene (TGI)-positive NK-celler etter behandling med kalsitriol eller rapamycin i 72 timer.*p < 0,05 og **p < 0,01 ble sammenlignet med NC. n=3.

3.4 Calcitriol motsto aldring av NK-celler indusert av oksidativt stress in vitro

Det er allment akseptert at aldring er forårsaket av akkumulering av oksidativ skade på grunn av den store mengden bevis funnet gjennom årene [31]. Vi dyrket NK-cellene med forskjellige konsentrasjoner av H2O2 i 24 timer og fant at 1{{1{{20}}}}0 μM var den nærmeste konsentrasjonen til median dødelig dose (LD50) (Figur 3b) . Ekspresjonen av TIM3 i NK-cellepopulasjonen økte ved tilsetning av H2O2, mens ekspresjonen avtok etter behandling med kalsitriol (*P < 0,05) (Figur 3c). I tillegg ble aldrende NK-celler farget blått i nærvær av -galaktosidase. Denne blå fargen på cellene er et spesifikt kjennetegn på senescent celler. Statistisk analyse viste at ubehandlede NK-celler har mindre cellulær galaktosidaseaktivitet, mens NK-cellene eksponert for H2O2 viste forhøyet galaktosidaseaktivitet. Kalsitriol reduserte den - galaktosidase-positive populasjonen, noe som indikerer tilstedeværelsen av færre aldrende celler (*P < 0,05) (Figur 3d). Redusert mitokondriemembranpotensial har også blitt observert i en rekke aldrende celler fra flere pattedyrarter. Vi evaluerte mitokondriemembranpotensialet til NK-cellene i denne studien. De statistiske resultatene viste at H2O2 reduserte den cellulære aktiviteten til NK-celler signifikant sammenlignet med den til de ubehandlede cellene, mens kalsitriol økte skaden forårsaket av H2O2 (*P < 0,05) (Figur 3e).

Figur 2. Effekter av kalsitriol på funksjonene til NK-celler. (a) Analyse av cytokinet frigjort av de kalsitriolbehandlede NK-cellene i løpet av 48 timer. b) Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-resultater viste døde K562-celler merket med 3,3 -oktadecyl-oksakarbocyaninDlO) og propidiumjodid (P). K562-celler ble samdyrket med forskjellige forhold mellom kalsitriolbehandlede Nk-celler i 4 timer. (C) FACSinalyse av døde K562-celler i drepeanalyser. (d) Degranuleringseffektene av behandlede Nk-celler i drepeanalyser. n=3 for eaciyroup. *p < 0.05 og **p < 0,01 ble sammenlignet med NC

3.5 Calcitriol motsto apoptose av NK-celler indusert av oksidativt stress in vitro

Deretter målte vi antall apoptotiske celler. Flowcytometriresultatene viste at behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer førte til signifikant apoptose av NK-cellene. Imidlertid reduserte behandling med kalsitriol det apoptotiske forholdet (*P < 0,05) (Figur 4a). Alle resultatene ovenfor viste motstanden til kalsitriol mot oksidativt stress forårsaket av H2O2. Imidlertid oppdaget vi apoptotiske proteiner i NK-celler under oksidativt stress. Før behandling med H2O2 ble 10- [7] M kalsitriol tilsatt til NK-cellene i 24 timer. Nivåene av apoptose-relaterte proteiner, caspase-3 p17 og caspase-3 p20, økte betydelig etter behandling med H2O2. Kalsitriol reduserte H2O2-avledet apoptose og nedregulerte uttrykket av caspase-3, p17 og caspase-3 p20 (*P < 0,05) (Figur 4b). Disse resultatene indikerte at kalsitriol motsto apoptose indusert av H2O2.

Figur 3. Denanti-aldringseffekterav kalsitriol på NK-celler. (a) Ekspresjonen av vitamin D-reseptoren (VDR), sirtuin 1 (SIRT1), SIRT1- ∆Exon8 og proteinkinase R-lignende endoplasmatisk retikulumkinase (pERK) i NK-celler ble påvist ved western blotting-analyse etter behandling med kalsitriol i 48 timer. Glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble brukt som belastningskontroll. Søylediagram som illustrerer resultatene for Western blotting (n=3). *P < 0.{{10}}5 og **P < 0.01 ble sammenlignet med NC (n=3). (b) Doseringsdødelighetskurve for NK-celler etter behandling med hydrogenperoksid (H2O2) i 24 timer. (c) Prosentandel av TIM3-celler som viser høy ekspresjon etter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (d) Senescensassosierte -galaktosidasefarging og analyseresultater. De senescent cellene ble farget i blått og indikert med røde piler. Målestokk, 50 μm. (e) NK-celler ble farget med Hoechst og Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos) for å bestemme celleplasseringen og mitokondriell membranpotensial. De aldrende og apoptotiske cellene var Hoechst pluss CMXRos- og indikert med hvite piler. Målestokk, 50 μm. Statistisk analyse viste relativ fluorescensintensitet. *P < 0,05 og **P < 0,01 ble sammenlignet med H2O2-gruppen i figurene C, D og E (n=3).

Figur 4. De anti-apoptotiske effektene av kalsitriol på NK-celler. (a) Anti-apoptotiske effekter av kalsitriol i H2O2-indusert skade. FACS-analyse viste prosentandelen av apoptotiske NK-celler etter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (b) Ekspresjonsnivåene av caspase-3 p20 og caspase-3 p17 i NK-celler ble påvist ved western blotting-analyse etter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. GAPDH ble brukt som lastekontroll. Søylediagram som illustrerer resultatene for Western blotting (n=3). *P < 0,05 ble sammenlignet med H2O2-gruppen.

4. Diskusjon

Den langsiktige interaksjonen mellom betennelse og oksidativt stress er en viktig faktor i aldring. I tillegg er betennelse og oksidativt stress synergistiske [32]. Overflødig ROS generert av oksidativt stress angriper kroppscellene. Under denne prosessen frigjøres inflammatoriske faktorer av det aktiverte immunsystemet for å drepe de unormale cellene, noe som fører til ytterligere ROS-generering. Mangel på kalsitriol kan forårsake autoimmune sykdommer, kroniske metabolske sykdommer og svulster. Imidlertid er lite kjent om antialdringseffektene av kalsitriol på immunsystemet, spesielt på NK-celler.

I denne studien undersøkte vi antialdringseffektene av kalsitriol på NK-celler. Vi fant at kalsitriol økte uttrykket av NKG2A, mens det reduserte uttrykket av KIR in vitro. CD56−CD16 pluss subpopulasjonen av NK-celler, som er kjent for å være relatert til kronisk betennelse, er betydelig økt hos eldre [33]. Derfor kan reduksjonen i CD16-ekspresjon indusert av kalsitriol tilskrives dens anti-inflammatoriske effekt. TIM-3 og PD-1 har blitt rapportert å være de hemmende og utarmende reseptorene til NK-celler. Studien vår viste at cal citriol nedregulerte ekspresjonsnivåene av TIM-3 og PD-1 og forhindret apoptose av NK-celler.

I tillegg hemmet kalsitriol utvidelsen av NK-celler og opprettholdt NK-cellepopulasjonen i G1-fasen in vitro. Imidlertid ble ikke cellene i S-fasen påvirket. TIGIT, som er kjent som en sjekkpunktfaktor for NK-celler, forble uendret. Disse resultatene indikerte at Figur 4. De anti-apoptotiske effektene av kalsitriol på NK-celler. (a) Anti-apoptotiske effekter av kalsitriol i H2O2-indusert skade. FACS-analyse viste prosentandelen av apoptotiske NK-celler etter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. (b) Ekspresjonsnivåene av caspase-3 p20 og caspase-3 p17 i NK-celler ble påvist ved western blotting-analyse etter behandling med 100 μM H2O2 i 24 timer. GAPDH ble brukt som lastekontroll. Søylediagram som illustrerer resultatene for Western blotting (n=3). *P < 0,05 ble sammenlignet med H2O2-gruppen. BIOENGINEERD 6851calcitriol førte ikke til død av NK-celler, men det bremset bare hastigheten på NK-celleekspansjon.

Det er velkjent at betennelse fører til immunosenescens [34,35]. Videre fant vi at kalsitriol reduserte nivåene av IL-5, IL-13, IFN- og TNF- i NK-celler. Cytotoksisiteten til NK-celler er delvis mediert av frigjøring av inflammatoriske faktorer [36]. Dessuten var det en nedgang i dødeligheten til K562-tumorceller og degranulering av NK-celler. Disse resultatene var i tråd med våre forventninger. Rapamycin er et velkjent medikament som reduserer stoffskiftet for å forhindre aldring[37] som brukes som positiv kontroll i denne studien. Det resulterer i immunsuppresjon og øker den potensielle risikoen for svulst og svulstbelastning. Denne byrden har blitt bekreftet i musemodeller av brystkreft [38]. Hvorvidt kalsitriol har lignende effekter som rapamycin er fortsatt ukjent. Flere dyre- og kliniske studier bør utføres for å verifisere effektene deres i menneskekroppen.

Til slutt studerte vi effekten av kalsitriol på antioksidantalderdom. Resveratrol, et velkjent antialdringsmiddel, kan nedregulere NF-KB-banen ved å aktivere SIRT1/PERK-aksen. Denne nedreguleringen har også vist seg å være gunstig ved nevrodegenerative lidelser og kardiovaskulære sykdommer [39]. SIRT1-deacetylering er assosiert med metabolsk kontroll og mitokondriell biogenese. I denne typen regulering kan forhøyede SIRT1-nivåer fremme akkumulering av peroksisomproliferatoraktivert reseptor gamma-koaktivator-1 alfa (PGC-1) i kjernen, noe som resulterer i transkripsjon av gener som er nødvendige for mitokondriell funksjon [40]. Dessuten undertrykker SIRT1 pattedyrmålet til rapamycin (mTOR) signalveien, som kan beskytte nervene og motstå hjernealdring hos mus [41]. I denne studien identifiserte vi en lignende regulatorisk vei for kalsitriol. Calcitriol aktiverte SIRT1 via VDR og hevet SIRT1/pERK-aksen.

I tillegg fant vi at kalsitriol oppregulerte uttrykket av SIRT1-∆Exon8. Spenninger er kjent som en oppregulerende faktor for SIRT1-∆Exon8. Selv om SIRT1-∆Exon8 selv viser redusert p53-deacetyleringsaktivitet, utøver den en additiv deacetyleringseffekt på p53 når den uttrykkes sammen med full-lengde SIRT1 [42]. Denne effekten indikerte den anti-apoptotiske funksjonen til kalsitriol på NK-celler. Rollen til SIRT1-∆Exon8 i aldersrelaterte veier gjenstår imidlertid å bli bedre forstått. Siden nedgangen av SIRT1 kan skyldes oksidativ skade [43], etablerte vi en akutt aldrende NK-cellemodell in vitro ved bruk av H2O2. Den oksidative aldring indusert av H2O2 økte ekspresjonen av TIM3 så vel som aktiviteten til -galaktosidase i NK-celler. Vi fant at kalsitriol motsto oksidativ skade og opprettholdt mitokondriell aktivitet og cellelevedyktighet til NK-celler samtidig som det forhindret celleapoptose. Imidlertid har kalsitriol ennå ikke blitt identifisert som et antialdringsmiddel i klinisk medisin, da det er behov for mer bevis angående antialdringseffektene av dette legemidlet in vivo. Oppsummert ga vi foreløpige bevis for å implisere antialdringseffektene av kalsitriol på NK-celler in vitro. Vi mener at effekten av dette stoffet bør utforskes videre i fremtidige dyre- og kliniske studier.

5. Konklusjon

I denne studien demonstrerte vianti-aldringseffekterav kalsitriol på NK-celler. Calcitriol snudde uttrykket avaldrende biomarkørerpå NK-celler. Det bremset NK-forsterkning og holdt dem i G1-fase. I tillegg hemmet kalsitriol frigjøringen av inflammatoriske cytokiner og nedregulerte degranulering av NK-celler. Aktivering av SIRT1-∆Exon8 og VDR/SIRT1/pERK-aksen med kalsitriol kan være hovedmekanismen for antialdringseffekten av kalsitriol basert på alt ovenfor. Til slutt motsto kalsitriol den oksidative senescensen til NK-celler in vitro. Videre studier bør fokusere på dyre- og klinisk forskning.

Høydepunkter

(1) Kalsitriol reduserte uttrykket av aldersrelaterte biomarkører inkludert CD16, TIM3, PD-1, KIR, og økte uttrykket av NKG2A av NK-celler. (2) Calcitriol var i stand til å hemme NK-celleproliferasjon og stoppe dem i G1-fasen. (3) Kalsitriol reduserte frigjøringen av store inflammatoriske faktorer som IL-5, IL-13, IFN- og TNF- av NK-celler.(4) Kalsitriols antialdringseffekt på NK-celler kan oppnås gjennom Sirt1- pERK-signalveien.

Takk Vi vil gjerne takke alle ansatte i gruppen vår for deres støtte og Shenzhen Science and Technology Innovation Committee for deres finansieringsstøtte til denne studien.

Finansiering Dette arbeidet ble støttet økonomisk av Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (JCYJ20170412155231633), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (nr. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech og Sanming Project of Medicine i Shenzhen (nr. SZSM202011010); Shenzhen Science and Technology Innovation Committee [JCYJ20170412155231633]; Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [nr. SZXK062]; Sanming Project of Medicine i Shenzhen [nr. SZSM202011010].

Etikkgodkjenning Alle prosedyrer ble godkjent av etikkkomiteen ved Shenzhen Luohu People's Hospital (ZLNK 12/2019, Shenzhen, Kina). Informert samtykke ble innhentet for eksperimentering med prøver fra mennesker.

Avsløringserklæring Alle forfattere godkjente innsendingen av dette manuskriptet. Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha påvirket arbeidet som er rapportert i denne artikkelen.

Referanser

[1] Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, et al. Nedsatt immunovervåking akselererer akkumulering av senescent celler og aldring. Nat Commun. 2018;9 (1):5435.

[2] López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, et al. Kjennetegnene på aldring. Celle. 2013;153:1194–1217.

[3] Hodgins JJ, Khan ST, Park MM, et al. Killers 2.0: NK-celleterapier i forkant av kreftkontroll. J Clin Invest. 2019;129(9):3499–3510.

[4] Zhu H, Blum RH, Bjordahl R, et al. Pluripotente stamcelleavledede NK-celler med ikke-spaltbar CD16a med høy affinitet medierer forbedret antitumoraktivitet. Blod. 2020;135(6):399–410.

[5] Mandal A, Viswanathan C. Naturlige drepeceller: i helse og sykdom. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2015;8(2):47–55.

[6] Le Garff-Tavernier M, et al. Menneskelige NK-celler viser store fenotypiske og funksjonelle endringer over levetiden. Aldrende celle. 2010;9(4):527–535.

[7] Le Garff-Tavernier M, Béziat V, Decocq J, et al. Ekspresjonsmønstre for NKG2A, KIR og CD57 definerer en prosess med CD56dim NK-celledifferensiering koblet fra NK-celleutdanning. Blod. 2010;116 (19):3853–3864.

[8] Manser AR, Uhrberg M. Aldersrelaterte endringer i naturlige drepercelle-repertoarer: innvirkning på NK-cellefunksjon og immunovervåking. Cancer Immunol Immunother. 2016;65(4):417–426. [9] Bi J, Tian Z. NK Cell Exhaustion. Front Immunol. 2017;8:760.

[10] Furman D, Campisi J, Verdin E, et al. Kronisk betennelse i sykdommens etiologi over hele levetiden. Nat Med. 2019;25(12):1822–1832.

[11] Liu Y, et al. Et cytomegalovirus peptidspesifikt antistoff endrer naturlig drepercellehomeostase og deles i flere autoimmune sykdommer. Cell Host Microbe. 2016;19(3):400–408.

[12] Campus X, Pera A, Solana R, et al. NK-celler i sunn aldring og aldersassosierte sykdommer. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:195956.

[13] Liu Y, Mu R, Gao YP, et al. Effekt av aldring på nk-cellepopulasjon og deres spredning ved ex vivo kulturtilstand. Analcellepatol (Amst). 2018;2018:7871814.

[14] Sintov AC, Yarmolinsky L, Dahan A, et al. Farmakologiske effekter av vitamin D og dets analoger: nyere utvikling. Drug Discov i dag. 2014;19 (11):1769–1774. [15] Halicka HD, Zhao H, Li J, et al. Dempning av konstitutiv DNA-skadesignalering ved

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950