Studie om effekten av actteoside (en aktiv ingrediens i Cistanche Deserticola) på NAFLD ved å indusere autofagi

2 resultater

2.1 Sammenligning av LC 3- ⅱ proteinuttrykknivåer i Hepg2 -celler behandlet medACT og ECH det relative uttrykket av LC 3- ⅱ proteinI Hepg2 -celler behandlet med Bafa1 (0. 67 ± 0. 0 4) var betydelig høyere enn den i den blanke kontrollgruppen ({{{18}. 41 ± 0. Det relative uttrykket av lc {{1 {{2 {0}}}} ⅱ protein i Hepg2 -celler i rapamycin+bafa1 -gruppen (1.24 ± {{3 0}}. {{36} {34}}}. (0. 28 ± {{4 0}}. 02). Ekspresjonen av LC 3- ⅱ protein i HepG2 -celler i ECH+Bafa1 -gruppen og ACT+BAFA1 -gruppen [0,43 ± 0,02 og 1,36 ± 0,11, og var signifikant høyere enn i ECH -gruppen og ACT -gruppen [(0,10)<0.05).

TCM Herb Cistanche for leverbeskyttelse

2.2 Sammenligning av LC 3- ⅱ proteinuttrykknivåer i HepG2 -celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT

The LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the CON group (0.79±0.07) were compared with those in the STA group (0.50±0.04), with no significant difference (P>{{{{1 0}}}}. 0 5); LC 3- ⅱ proteinekspresjonsnivåer av Hepg2 -celler i BAFA1 kombinert med 25, 5 0 og 1 0}, {25}} μmol/l Act -grupper (1.17} {{{27} μmol/l Act -grupper (1.17}}}}}}}}}. 1,83 ± 0. 53, og 0. 97 ± 0,25) var betydelig høyere enn i 25, 50 og 100 μmol/L ACT -grupper (0,38 ± 0,09, 0,35 ± 0,18 og 0,30 ±<0.05). The LC3-Ⅱ protein expression level of HepG2 cells in the 50 μmol/L ACT group was the highest. See Figure 1.

Merk: A. proteinimmunblotting; B. semi-kvantitative analyseresultater; Sammenlignet med ACT -gruppen uten BAFA1, AP<0.05.
Figur 1 Sammenligning av LC 3- ⅱ proteinuttrykknivåer i HepG2 -celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT

2.3 Sammenligning av levedyktighet av HepG2 -celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT i 24 og 48 timer

OD -verdiene for Hepg2 -celler etter intervensjon med 0, 2 0, 4 {{1 0}}, 6 0, 8 0 og 1 {{{ 0. 98 ± 0. 17, 0. 99 ± {{3 0}}. 15,}}} {{{} {} {} {}} {}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}. 0. 94 ± 0. 15, og 0. 94 ± 0. 20, henholdsvis; og OD -verdiene for HepG2 -celler etter intervensjon i 48 timer var henholdsvis 3,06 ± 0,27, 0,96 ± 0,27, 2,88 ± 0,27, 3,08 ± 0,15, 3,01 ± 0,13 og 0,09 ± 0,22. Det var ingen signifikant forskjell i OD -verdiene for HepG2 -celler etter 24 og 48 timer med intervensjon med forskjellige konsentrasjoner av ACT (F =0. 213, 0.213, p =0. 96, 0.36). Se figur 2.

Merk: A. HepG2 -celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT i 24 timer; B. HepG2 -celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT i 48 timer.

Figur 2 OD -verdier ved 570 nm etter 24 og 48 timers behandling med forskjellige konsentrasjoner av ACT

2.4 Sammenligning av TG -nivåer og oljerød O -farging i in vitro -cellemodellen til NAFLD etter ACT -intervensjon

TG -nivået av HepG2 -celler i modellgruppen (34,15 ± 1,90) var betydelig høyere enn i den blanke kontrollgruppen (14,17 ± 2,74) og ACT -intervensjonsgruppen (19,11 ± 1,68), og forskjellene var statistisk signifikante (p<0.05). The number of stained lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group was significantly reduced (see Figure 3).

Merk: A. TG -nivå; B. Olje rød O -farging (20 ×); sammenlignet med modellgruppen, AP<0.05.
Figur 3 Sammenligning av TG -nivå og oljerød O -farging i NAFLD in vitro cellemodell etter ACT -behandling

2.5 Sammenligning av autofagosomer og lipiddråper etter ACT-behandling sammenlignet med den blanke kontrollgruppen, lipiddråpene til HepG2-celler i rapamycinbehandlingsgruppen og ACT-intervensjonsgruppen økte betydelig, og LC3-autofagosomer av HepG2-celler i ACT-intervensjonen økte betydelig, og samlokaliserte lipid-lipid-lipid-lipid. Se figur 4.

3 Diskusjon

NAFLD er den vanligste kroniske leversykdommen i verden, og utgjør omtrent 1/4 av verdens totale befolkning, og har blitt et globalt folkehelseproblem. Overnutrisjon er hovedfaktoren som driver NAFLD. Overdreven inntak av næringsstoffer av leverceller forårsaker overdreven fettavsetning i cellene, noe De siste årene har studier vist at autofagi spiller en viktig rolle i å forhindre utvikling av menneskelig NAFLD. Resultatene av autofagi-relatert indeksdeteksjon i leverene til pasienter med NAFLD og ikke-alkoholisk fet leversykdom og lever av overvektige og fettfattig diettmus viste at autofagi-prosessen i hepatocytter ble blokkert, noe som førte til den massive akkumuleringen av intracellulære TG og andre lipiddråper [16]. Andre studier har vist at etter nøkkelgenet 7 av hepatocyttautofagi ble spesifikt slått ut i mus matet et fettfattig kosthold, økte nivået av TG i mushepatocytter betydelig [17]. Etter overekspresjon av ATG7 -genet eller intervensjonen med autofagi -indusere som rapamycin og karbamazepin, ble fet degenerasjon i muselever betydelig redusert [18-20].
Dette antyder at leverfettdegenerasjon kan reduseres betydelig ved å forbedre lever autofagi -aktivitet, og gi en effektiv strategi for behandling av NAFLD. Naturlige produkter, som en viktig kilde til ny medikamentutvikling, er mye brukt i forebygging og behandling av forskjellige leversykdommer. Som et utmerket produkt som ofte brukes i tradisjonell kinesisk medisin, har Cistanche Deserticola vekket bred oppmerksomhet for sine farmakologiske effekter som nevrobeskyttelse, immunmodulering, antioksidant, kreft og leverbeskyttelse. Så langt er mer enn 120 forbindelser blitt isolert fra Cistanche Deserticola, inkludert fenyletanoide glykosider, terpenoider og deres glykosider, lignaner og deres glykosider, oligosakkarider, polyoler og polysakkarider [21]. Blant dem er fenyletanoide glykosider den mest studerte klassen av forbindelser i de aktive ingrediensene i Cistanche Deserticola. ECH og ACT er representative forbindelser av Cistanche Deserticola fenyletanoid glykosider, som har positive effekter hos antioksidanter, og beskytter leveren, myokard, nerveceller og forbedrer hukommelsen [22-23]. Imidlertid er det ingen relevant litteraturrapport om Cistanche Deserticola fenyletanoide glykosider er involvert i autofagi -prosessen for å beskytte leveren.

Autofagi er en selvdegraderingsprosess som er allestedsnærværende i kroppen. Det er en katabolsk prosess der autofagosomer nedbryter cellulært metabolsk avfall. Autofagi -prosessen inkluderer vanligvis tre prosesser: initiering av autofagi, autofagisk membranforlengelse og autofagisk lysosomdannelse, som hovedsakelig er regulert av rapamycin målprotein og fosfatidylinositol -3 kinase signalveier. Autofagosomer er markører for cellulær autofagi. I prosessen med autofagosomdannelse spiller en serie autofagi-relaterte proteiner inkludert Atg5 ~ 12 og LC3 en viktig rolle. Derfor konstruerte denne studien et autofagievalueringssystem, oppdaget ekspresjonsnivået av autofagi markørprotein LC3 på molekylært nivå, og evaluerte autofagiinduksjonsevnen til to fenyletanoide glykosider av cistanche ørkenicola i HepG2 -celler. Resultatene viste at etter tilsetning av BAFA1 -behandling på grunnlag av intervensjonen av autofagi -indusatoren rapamycin, økte den intracellulære LC 3- ⅱ av Hepg2 -celler betydelig, noe som indikerer at medisinen for autofagi nøyaktig kan evaluere autofagi -induksjonsaktiviteten til medikamenter; Etter at ECH og ACT ble behandlet med Bafa1, var uttrykket av LC 3- ⅱ protein i Hepg2 -celler i ECH+BAFA1 -gruppen og ACT+BAFA1 -gruppen betydelig høyere enn den i ECH -gruppen og ACT -gruppen, og forskjellene var statistisk signifikant (P<0.05). However, since the autophagy process is very complex, it is easily changed by external environmental stimuli. Therefore, this study used BafA1 to block the autophagic flow, thereby more accurately evaluating the autophagy inducing ability of ECH and ACT. The results showed that after using BafA1 to block the autophagic flow, the intracellular autophagosomes could not be degraded in the autophagolysosomes, resulting in a significant increase in the overall autophagy level of the cells. After the intervention of rapamycin, Ech, and ACT in HepG2 cells, the LC3-Ⅱ protein expression levels of HepG2 cells in the rapamycin+BafA1 group and the ACT+BafA1 group were higher than those in the BafA1 group alone. Although the expression levels of HepG2 cells in the ECH+BafA1 group were significantly higher than those in the ECH group alone, the differences were statistically significant (P<0.05), the expression levels of LC3-Ⅱ protein in HepG2 cells were lower than those in the BafA1 group alone, indicating that ACT has a significant ability to induce autophagy in HepG2 cells. Therefore, this study took ACT as the research object and further studied its pharmacological activity in inducing autophagy and utøve leverbeskyttelseog andre biologiske funksjoner. For det andre er sikkerhet en primær vurdering i medikamentutvikling. For å evaluere sikkerheten til ACT, testet denne studien ytterligere effekten av ACT på levedyktigheten til HepG2 -celler. Resultatene viste at levedyktigheten til HepG2 -celler nesten ikke ble påvirket av intervensjon med forskjellige konsentrasjoner av ACT, noe som indikerer at ACT kan brukes som et kandidatmedisin for ytterligere å studere dets farmakologiske effekter og molekylære mekanismer.

Autofagi er en sterkt konservert biologisk prosess i celler, og små endringer i medikamentkonsentrasjoner vil påvirke nivået av cellulære autofagosomer. For ytterligere å bestemme den optimale konsentrasjonen av ACT for å indusere dannelsen av autofagosomer i HepG2 -celler, brukte denne studien forskjellige konsentrasjoner av ACT kombinert med BAFA1 for å behandle HepG2 -celler og oppdaget ekspresjonsnivået til LC 3- ⅱ protein i celler. Resultatene viste at 50 μmol/L ACT kunne øke nivået av autofagosomer betydelig i HepG2 -celler. Derfor brukte denne studien 50 μmol/L ACT for å gripe inn i NAFLD -cellemodellen konstruert in vitro, og undersøkte foreløpig forholdet mellom densleverbeskyttelsefunksjon og autofagi.
Relaterte studier på NAFLD -cellemodeller har vist at etter in vitro -intervensjon med frie fettsyrer, økte TG -nivået av HepG2 -celler betydelig, og aggregeringen av fete lipiddråper kunne tydelig observeres i cellene [24-25]. I denne studien ble 100 μmol/L PA brukt til å gripe inn i HepG2 -celler in vitro i 24 timer. TG -nivået av HepG2 -celler i modellgruppen var betydelig høyere enn i den blanke kontrollgruppen. Samtidig kan aggregeringen av lipiddråper tydelig observeres i cellene, noe som indikerer at NAFLD -cellemodellen ble vellykket konstruert. For ytterligere å observere effekten av ACT på NAFLD -cellemodellen, ble 50 μmol/L ACT brukt til å gripe inn i NAFLD in vitro cellemodell, og effekten av ACT på NAFLD ble evaluert ved TG -nivådeteksjon og oljerød O -farging. Resultatene viste at etter ACT-intervensjon var TG-nivået og antall fete lipiddråper i HepG2-celler betydelig lavere enn de i modellgruppen, noe som indikerer at ACT har aktiviteten for å redusere TG i den PA-induserte NAFLD-cellemodellen. For ytterligere å studere forholdet mellom ACTs lipidsenkende aktivitet og cellulær autofagi, brukte denne studien LC 3- ⅱ Spesifikke proteinantistoffer og bodipy fluorescerende sonder til co-flain autofagosomer og lipiddråper. Det ble observert at antallet autofagosomer i HepG2-celler etter ACT-intervensjon ble betydelig økt sammenlignet med kontrollgruppen, noe som var i samsvar med resultatene av proteinimmunoblotting i denne studien, noe som ytterligere bekreftet at ACT har autofagi-induserende aktivitet i HepG2-celler. I tillegg, etter medikamentintervensjon, kan intracellulære autofagosomer og lipiddråper samlokalisert, noe som indikerer at ACTs effekt på å forbedre PA-indusert NAFLD-fettdegenerasjon innebære involvering av cellulær autofagi. Imidlertid, i NAFLD -cellemodellen, om ACT utøver sin farmakologiske aktivitet for å redusere intracellulære TG -nivåer gjennom den lipofagiske banen, må det fortsatt forklares ytterligere ved å blokkere den intracellulære autofagi -prosessen.
Oppsummert, blant de to fenyletanolglykosidforbindelsene av Cistanche Deserticola, har ACT en betydelig evne til å indusere autofagi i HepG2 -celler. Samtidig, i PA-indusert leverstatosecellemodell, reduserte CT betydelig TG-nivået i HepG2-celler betydelig. Etter ACT-intervensjon hadde autofagosomer og lipiddråper i HepG2-celler et visst samlokaliseringsforhold, noe som indikerer at autofagi kan være en ny vei involvert i den farmakologiske ACT-prosessen når det gjelder leverbeskyttelse. Se figur 5. I påfølgende studier vil virkningsmekanismen for å senke lipider bli studert ytterligere i detalj ved bruk av autofagiblokkere for å legge grunnlaget for fremtidig ny medisinutvikling.