Studie om effekten av actteoside (en aktiv ingrediens i Cistanche Deserticola) på NAFLD ved å indusere autofagi

Abstrakt:

 

Objektiv:For å utforske den autofagiske induserende funksjonen til aktiv ingrediens actheoside (ACT) i Cistanche Deserticola og dens effekt på alkoholfri fettsykdom (NAFLD).

MetoderFor å ta echinacoside og fungere som forskningsobjekter, ble 1 0 0 μmol/L ACT og Echinacoside (ECH) kombinert med autofagi-lysosominhibitor bleomycin A1 for intervensjonsbehandling. Proteinimmunoblotting ble brukt for å påvise det relative ekspresjonsnivået av autofagi markørproteinmikrotubulus assosiert protein 1 lettkjede 3 (LC 3- ii). HepG2 -celler ble grepet inn med forskjellige konsentrasjoner av ACT in vitro, og cellelevedyktighet ble påvist ved bruk av tetrazoliumsaltmetoden. In vitro -intervensjon av HepG2 -celler med forskjellige konsentrasjoner av ACT kombinert med balofloxacin A1, og deteksjon av lc 3- ii proteinuttrykk ved bruk av proteinmmunlobloting. En NAFLD -modell konstruert in vitro med medikamentintervensjon ble brukt til å farge lipiddråper ved bruk av oljerød O -fargemetode og oppdage intracellulære triglyseridnivåer. Observer lokaliseringen av LC3 -protein- og lipiddråper gjennom immunofluorescence -teknologi. Resultatloven kan indusere autofagi i Hepg2 -celler betydelig, og ekspresjonsnivået til LC 3- II -protein er betydelig økt sammenlignet med kontrollgruppen (behandlet med ACT alene) (1.36 ± {{{{{3 {3 {3 {3 {3 {{3 {{3 {{3 {3 {{ henholdsvis), med statistisk betydning (P0.05). 50 μmol/L virker signifikant indusert autofagi i HepG2 -celler, og ekspresjonsnivået til LC 3- II -protein ble betydelig økt (henholdsvis 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). TG -nivået av HepG2 -celler i ACT -intervensjonsgruppen (19,11 ± 1,68) var betydelig lavere enn i NAFLD in vitro -cellemodellgruppen (34,15 ± 1,90), og forskjellene var statistisk signifikante (p<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Nøkkelord:Ikke -alkoholholdig fet leversykdom;Cistanche Deserticola;Activeoside; Autofagi

 

TCM Herb Cistanche for behandling av alkoholfritt fettsykdom (NAFLD)

Klikk på bildet for å få flere detaljer

 

I løpet av de siste tiårene er ikke-alkoholisk fettleversykdom(NAFLD) har blitt den vanligsteKronisk leversykdom, med en global forekomst på omtrent 25% av den voksne befolkningen, og anses å være nært beslektet med metabolsk syndrom [1]. Selv om sannsynligheten for leverrelaterte komplikasjoner hos NAFLD-pasienter er mindre enn 10%, er NAFLD en risikofaktor for leverrelaterte sykdommer som skrumplever og primær leverkreft, noe som pålegger pasienter en enorm økonomisk belastning [2-5]. Til tross for den økende oppmerksomheten til NAFLD, har NAFLD som en viktig kronisk sykdom ikke fått tilstrekkelig oppmerksomhet. Derfor har ytterligere dyptgående forståelse av patogenesen av NAFLD og søket etter effektive behandlingsstrategier blitt presserende problemer som skal løses [6-7].

Nyere studier har vist at cellulær autofagi spiller en viktig rolle i leverfysiologi og patologi [8]. Autofagi dysfunksjon eller dysregulering er assosiert med en rekke leversykdommer som for eksempelAlkoholrelatert leversykdom[9], NAFLD [10], ikke-alkoholisk steatohepatitt [11], og hepatocellulært karsinom [12]. De patologiske egenskapene til NAFLD er overdreven avsetning av triglyserider (TG) og andre nøytrale lipiddråper (LD) i hepatocytter under ikke-alkoholisk stimulering. For leveren er de to hovedveiene som regulerer katabolismen til disse LD -ene lipolyse og autofagi.
Lipolyseveien er regulert av cytoplasmatiske nøytrale lipaser, så som hormonfølsom lipase og fett-TG-lipase. I den tilsvarende lipoautofagi-banen kan LDS selektivt tas opp ved direkte å rekruttere autofagi-relaterte proteiner for å danne autofagosomer, og deretter blir LDS innkapslet av autofagosomer videre levert til lysosomer og dekomponert av syre lipase i lysosomer. Derfor har aktivering av lipoautofagi i hepatocytter blitt en effektiv strategi for forebygging og behandling av NAFLD.
Cistanche Deserticola er en dyrebar kinesisk urtemedisin som har blitt mye brukt i klinisk praksis i tradisjonelle kinesiske medisinformler. Samtidig har det lenge blitt brukt som helsekosttilskudd. Cistanche Deserticola inneholder en rekke bioaktive ingredienser, hvorav den viktigste er Cistanche Deserticola fenyletanolglykosider. Som representanter for fenyletanoidglykosider, er det rapportert at echinacoside (ECH) og verbascoside (ACT) har mange viktige biologiske aktiviteter, som antioksidant, nevrobeskyttende, immunmodulerende og leverbeskyttelse [13]. Når det gjelder leverbeskyttelse, har studier funnet at ECH kan beskytte leveren ved å redusere inflammatoriske mediatorer, hemme transformerende vekstfaktor- og redusere ekspresjonsnivået til leverfibrose-relaterte gener. ACT har en betydelig beskyttende effekt på kjemisk og medikamentindusert leverskade, som alkohol, karbontetraklorid og lipopolysakkarid. ACT reduserer oksidativt stress forårsaket av giftige kjemikalier, fjerner reaktiv oksygen akkumulert i leveren og reduserer malondialdehydkonsentrasjonen. Samtidig øker det levering av lever superoksyd -dismutaseaktivitet og redusert glutathione -innhold, og forbedrer leverhistopatologisk skade og apoptose betydelig. Det er imidlertid ingen relevant litteraturrapport om fenyletanoidglykosider av Cistanche Deserticola er involvert i prosessen med autofagi for å utøve leverbeskyttelse. Basert på dette brukte denne studien konvensjonelle cellebiologiske metoder og en in vitro-cellemodell for å utforske den autofagi-induserende effekten av Cistanche Deserticola fenyletanoid glykosider og utforsket dens mulige farmakologiske funksjoner, og hadde som mål å gi et vitenskapelig grunnlag for fremtidig medikamentutvikling.

 

1 materialer og metoder

1.1 Materialer

1.1.1 Forskningsfag ECH og ACT ble brukt som forskningsfag.

1.1.2 Materialer HepG2 -celler ble kjøpt fra Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (batchnummer: B21209) og ACT (batchnummer: B20715, HPLC Purity større enn 98%) ble kjøpt fra Shanghai Yuanye -biologisk selskap, DMEM High Glucose medium (Shanghai Yuanye Biological) og Trypsin ble kjøpt fra Hyclone Company, USA, Fetal Bovine Serum (batchnummer: 04-002-1 a) ble kjøpt fra BI Company, Israel, Penicillin/Streptomycin (Batch Number SV30010.01) ble kjøpt fra Hyclone Company, USA, MTT (Batch Nummer: BaOn: Batch Number Sole Selskaper: Batch Number Sor Company, MT (Batch Number, MT ( Beijing, Kina, TG (Batch Number: BC0625) Deteksjonssett ble kjøpt fra Solebao Company, Beijing, Kina, Oil Red O (Lot Number: O 0625-100 G), Dimethyl Sulfoxide (Lot Number: BCBZ1685) ble kjøpt fra Sigma-kaldrich, USA; Autofagi-lysosominhibitoren Bafilomycin A1 (BAFA1, Lot Number: TLRL-BAF1) ble kjøpt fra Invitrogen, USA; Autophagy -aktivatoren rapamycin (Lot Number: S17098) ble kjøpt fra Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kina; Mikrotubule-assosiert protein 1 lettkjede 3 (LC3, Lot Number: L7543, Arter: Rabbit, fortynningsforhold: 1: 1 000) og -aktin (Lot Number: Zrb1312; Arter: Rabbit, fortynning: 1: {{33})) Antibbedato: 1: {{33; Pepperrotisk peroxidase-merket sekundært antistoff (Lot Number: 4010-05, art: geit anti-kanin, fortynningsforhold: 1: 1 000) ble kjøpt fra Southern Biotch, USA Company, 1: 1000) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Company, USA og Bodipy 493/501 (Lot Number: D3922) ble kjøpt fra Invitrogen Company, USA.

 

1.2 Metoder

1.2.1 Cellekultur

HepG2 -celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte ørnehøyt glukosemedium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin i en 37 grader, 5% karbondioksid inkubator. Da cellen samløp nådde 85%, ble subkultur, platting, intervensjon og andre operasjoner utført.

 

1.2.2 Proteinimmunoblottingdeteksjon

1.2.2.1 ACT og ECH -behandling

LC 3- ⅱ proteinekspresjonsnivå i HepG2 -celler Bafa1, som en protonpumpeinhibitor, kan føre til at LC 3- ⅱ protein skal aggregere i store mengder i celler, og dermed forsterke autofagi -induksjonsevnen. Derfor kan den kombinerte bruken av BAFA1 brukes som et autofagiovervåkingssystem for å evaluere autofagi -induksjonsevnen. HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble overført til 3,5 cm cellekulturretter for overnattingskultur. 100 μmol/L ACT, ECH og BAFA1 ble brukt til intervensjon i 12 timer. Cellene ble vasket med forhåndkjølt fosfatbufferløsning (PBS) og lysert umiddelbart i RIPA-protein lysisbuffer i 10 minutter. Supernatanten ble sentrifugert og den totale proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av et bicinchoninic acid proteinkonsentrasjonsanalysesett. Etter kvantifisering med natriumdodecylsulfatbuffer, ble prøven oppvarmet ved 95 grader i 10 minutter for å denaturere proteinet. Deretter ble 30 ul av prøven tatt med en mikropipette og elektroforesert på en polyakrylamidgel.
Etter elektroforesen ble proteinet overført fra gelen til en nitrocellulosemembran, blokkert med 1 0% melk over natten, inkubert med et spesifikt primært antistoff ved romtemperatur i 1 time, vasket med fosfatbuffer som inneholder 0.5%. ECL -metoden ble brukt for fargeutvikling. De ble satt som Blank Control Group, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+Bafa1 Group, ECH+Bafa1 Group og ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Ulike konsentrasjoner av ACT grep inn uttrykksnivået til LC 3- ⅱ protein i HepG2 -celler

Den logaritmiske vekstfasen HepG2 -celler ble overført til 3,5 cm cellekulturretter for overnattingskultur, og 25, 50 og 100 μmol/L ACT kombinert med BAFA1 ble brukt til intervensjonsbehandling i 12 timer, og ekspresjonsnivået til LC 3- ⅱ protein ble påvist ved protein -immunoobloting. Kontrollgruppen (Con Group, Blank Control), Sult Ration Group (STA Group, Sultuation Treatment HepG2 Celler), 25, 50 og 100 μmol/L ACT Group og BAFA1 kombinert med 25, 50 og 100 μmol/L ACT -gruppe ble satt opp.

1.2.3 MTT -metode for å oppdage overlevelsesraten for HepG2 -celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ACT i 24 og 48 timer
HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble inokulert i en 96- brønnplate med en moderat inokulasjonstetthet og dyrket i en inkubator i 12 timer. 2 0, 40, 60, 80 og 100 μmol/L ACT ble tilsatt i 24 og 48 timer. 0,5 mg/ml MTT -løsning ble tilsatt i et mørkt miljø og inkubert i en inkubator. Etter 4 timer ble supernatanten kastet, 100 ul dimetylsulfoksyd ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble ristet i en konstant temperaturshaker ved 37 grader i 10 minutter. Den optiske tetthetsverdien (OD) med en bølgelengde på 490 nm ble påvist med en enzymmarkør, og celleoverlevelsesraten ble beregnet.

 

1.2.4 In vitro konstruksjon av NAFLD -cellemodell

En viss vekt av palmitinsyre (PA) ble veid og fullstendig oppløst i et visst volum isopropanol for å fremstille en 100 mmol/l PA -stamoppløsning, som deretter ble delt og lagret i en -20 graders kjøleskap for senere bruk. PA-stamoppløsningen ble fortynnet til 100 μmol/L ved bruk av komplett kulturmedium, og 1% fettsyrefritt bovint serumalbumin ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 grader i 3 timer for å fremstille induksjonsløsningen. HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble overført til en 3,5 cm cellekulturrett ved en passende tetthet for overnattingskultur, og deretter ble den tilberedte induksjonsløsningen brukt til intervensjon.

 

1.2.5 ACT Intervention NAFLD In vitro Cell Model Tg Deteksjon og oljerød O -farging

 

1.2.5.1 TG -deteksjon

HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble overført til en 3,5 cm cellekulturrett for kultur i henhold til den blanke kontrollgruppen, modellgruppen og ACT -intervensjonsgruppen. Modellgruppen ble indusert med 100 μmol/L PA -induksjonsløsning, og ACT -intervensjonsgruppen ble indusert med 100 μmol/L PA -induksjonsløsning og 50 μmol/L ACT ble tilsatt samtidig. Intervensjonstiden var 24 timer. Fjern det gamle kulturmediet forsiktig, vaske celleoverflaten forsiktig med forkjølt PBS en gang, tilsett 100 ul/taller til TG -settinstruksjonene, og til slutt korrigere TG -nivået per mg protein.

1.2.5.2 Olje rød O -farging

HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble overført til en 3,5 cm kulturrett dekket med en sterilt dekkglass for overnattingskultur. 100 μmol/L PA induserte cellene til å danne lipiddråper. Samtidig ble 50 μmol/L ACT tilsatt for intervensjon i 24 timer.
Cellglassene ble samlet, vasket 3 ganger med forkjølt PBS, fikset med 4% formaldehyd ved romtemperatur i 10 minutter, vasket celleoverflaten med PBS, tilsatt den tilberedte oljerød O-farging av arbeidsoppløsningen, farget ved romtemperatur i mørket i 15 minutter, Aspirert olje-rød O-farget med vasket med den mørke, vasket du. Destillert vann, og forseglet, og fotografert under et mikroskop.

 

1.2.6 Immunofluorescensobservasjon av autofagosomer og lipiddråper etter ACT -behandling

HepG2 -celler i den logaritmiske vekstfasen ble overført til en 3,5 cm kulturrett dekket med en sterilt dekkglass for overnattingskultur. 1 0 0 μmol/l PA ble brukt til å indusere dannelsen av lipiddråper i cellene. Samtidig ble ACT lagt til for intervensjonsbehandling i 24 timer. Cellglassene ble samlet, vasket 3 ganger med forkjølt PBS, fikset ved romtemperatur i 10 minutter med 4% formaldehyd, permeabilisert ved romtemperatur i 15 minutter med en permeabiliseringsbuffer som inneholder 0,1% saponin, blokkert med romtemperatur i 1 time med geit serum, inkubert i rommet for 1 HE-TIPE med LC med 1 time med goit-serum, inkubert yrt ° saponet, vaske med 1 time med 1 time med goit-serum, inkubert 3 timer med en permeabiliseringsbuffer som inneholder 0,1% sapon. PBS, og tilsatt et spesifikt fluorescerende merket sekundært antistoff, inkubert ved romtemperatur og vekk fra lys i 1 time. Etter antistoffinkubasjonen ble lysbildene vasket 3 ganger med PBS, forsynt med lipiddråpespesifikk sonde Bodypy 493/503 ved romtemperatur i 10 minutter, vasket med PBS og forseglet med anti-fading tetningsmedium, lufttørket i mørket, observert med en laserkonfokalmikroskop, og registrert. Den blanke kontrollgruppen, rapamycin -behandlingsgruppen og ACT -intervensjonsgruppen ble satt.

 

1.3 Statistisk analyse

SPSS25. 0 Statistisk programvare ble brukt til dataanalyse. De kvantitative dataene ble uttrykt som x ± s. Enveis analyse av varians og LSD-T-test ble brukt. P<0.05 was considered statistically significant.