Studie om salt- og alkalitoleransen til en endofytisk bakterie fra Cistanche Deserticola (Pseudalkalibacillus Sp. A8)

 

Abstrakt

Objektiv:For å isolere endofytiske bakterier fraCistanche deserticolaog undersøke de potensielle mekanismene som ligger til grunn for salt-alkali-toleransen tilPseudalkalibacillussp. A8.
Metoder:Endofytiske bakterier ble isolert ved bruk av fortynningspletteringsmetoden. Klassifiseringen av stamme A8 ble bestemt av morfologiske egenskaper og 16S rRNA-gensekvensering. Helgenomsekvensering og metabolomiske analyser ble deretter utført.
Resultater:Femti endofytiske bakteriestammer ble isolert fra ferskeCistanche deserticolaprøver, som dekker 4 phyla, 8 klasser og 35 slekter. Blant dem er stamme A8 den førstePseudalkalibacillusarter isolert fra planter, som viser eksepsjonell salt-alkali-toleranse. Den var i stand til å vokse i pH-områder fra 6,0 til 13,0 og NaCl-konsentrasjoner på opptil 17%. Genomannotering avslørte 10 gener assosiert med salt-alkali-resistens. Metabolomisk analyse under forhold med høy saltholdighet og høy pH identifiserte 186 differensielle metabolitter beriket i syv funksjonelle veier relatert til salt-alkali-stresstilpasning.
Konklusjon:Denne studien gir verdifulle mikrobielle ressurser for å øke avlingssalt-alkali-toleransen og tilbyr teoretisk støtte for saltvann-alkali-jordforbedring gjennom mikrobielle midler. Det legger også grunnlaget for å forstå de molekylære mekanismene til salt-alkali-tolerante bakterier.

Nøkkelord: Cistanche deserticola; endofytiske bakterier; salt-alkali-toleranse; sekvensering av hele genomet; UPLC–MS/MS

 

 

 

Cistanche deserticol blomst

Introduksjon

Jordsalting og alkalisering er store globale utfordringer, og bidrar betydelig til landforringelse og ørkenspredning. Det er anslått at omtrent 20 % av verdens dyrkbare land er påvirket av saltholdighet i varierende grad, og Kina alene besitter 9,9×10⁷ hektar saltvann-alkali-land – det største i verden. Slike jordarter viser vanligvis dårlig permeabilitet, lav fruktbarhet og hard tekstur, noe som svekker avlingsvekst og utbytte alvorlig. Derfor er det fortsatt et kritisk problem å utvikle effektive strategier for å utnytte og forbedre salt-alkalijord.

Nyere studier tyder på at mikrobielle inokulanter, spesielt salt-alkali-tolerante stammer, kan øke avlingstoleransen og forbedre jordegenskaper på en kostnadseffektiv og miljøvennlig måte. Endofytiske bakterier - de som bor i plantevev uten å forårsake sykdom, deler økologiske og fysiologiske egenskaper med vertsplantene.Cistanche deserticola, en ørkenlevende parasittisk plante kjent for sin ekstreme salt-alkali-resistens, er en lovende kilde for å isolere stresstolerante endofytter.

Denne studien har som mål å:

Isoler endofytiske bakterier fraCistanche deserticola;

Skjerm for salt-alkali-tolerante stammer;

Utforsk stressmotstandsmekanismene til den valgte stammenPseudalkalibacillussp. A8 gjennom helgenom og metabolomiske analyser.

Cistanche deserticol blomst

Materialer og metoder

1.1 Materialer

Planteprøve: Cistanche deserticolasamlet i mars 2023 fra Xiquan Town, Jingtaixian, Baiyin, Gansu-provinsen, Kina. Identifisert av prof. Guo Yehong, Gansu Agricultural University.

Media:TSB flytende medium; størknet ved bruk av 20 g/l agar.

Reagenser og instrumenter:Analytisk kvalitet NaClO, KH2PO4, K2HPO4, TAE buffer; Agilent QTOF 1290–6542 massespektrometer, R-1001V rotasjonsfordamper, Neofuge 15R sentrifuge, SureCycler 8800 gradient PCR.

1.2 Isolering av endofytiske bakterier

FerskCistanchevev ble overflatesterilisert og homogenisert. Seriefortynninger ble belagt på R2A-, TSB-, ISP-2- og 2216E-medier. Kolonier ble isolert og renset gjennom tre subkulturer, deretter lagret i 20% glyserol ved -80 grader.

1.3 16S rRNA-genidentifikasjon

Genomisk DNA ble ekstrahert og amplifisert ved bruk av universelle primere 27F/1492R. PCR-produkter ble sekvensert og analysert ved hjelp av EzBioCloud-databasen.

 

Cistanche base

Supportive Service Of Wecistanche-For mer informasjon om samarbeid
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fenotypisk og fysiologisk karakterisering

SEM:Cellemorfologi observert etter gullbelegg.

NaCl-toleranse:Vekst vurdert til 0–20 % NaCl.

pH-toleranse:Vekst målt ved pH 4–13.

Temperaturområde:Veksttestet ved 4–50 grader.

1.5 Helgenomsekvensering

Stamme A8 ble sekvensert ved bruk av PacBio-teknologi. Genomsamling og merknad ble utført mot seks hoveddatabaser (NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG). Gener relatert til salt-alkali-toleranse ble screenet.

1.6 UPLC-MS/MS-analyse

Prøver ble dyrket under tre forhold:

A: pH 7,2, NaCl 0,5 %

B: pH 7,2, NaCl 14 %

C: pH 13,0, NaCl 0,5 %

Supernatanter ble tørket, oppløst i metanol og analysert ved bruk av UPLC-MS/MS (ZORBAX Eclipse Plus C18, positiv ion-modus).

Resultater og analyse

2.1 Endofyttisolasjon

Femti stammer ble isolert fraCistanche deserticola, som tilhører 4 phyla og 35 slekter.

2.2 Identifikasjon av stamme A8

16S rRNA-sekvens viste 99,30 % likhet medPseudalkalibacillus salsuginis. Fylogenetisk analyse bekreftet det som medlem avPseudalkalibacillus. Morfologisk var koloniene glatte, gulbrune, stavformede (1–6 µm) med lett uskarp under SEM.

Vekstområde:20–45 grader (optimalt: 30 grader)

pH-område:6–13 (optimalt: 9,0)

Saltområde:0–17 % NaCl (optimalt: 0–5 %)

2.3 Genomanalyse

Genom lengde: 6,022,064 bp

GC-innhold: 40.99%

Proteinkodende gener: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA, 24 rRNA

ANI-verdier:Alle<95%, indicating a potential novel species.

COG-kommentar:4683 gener (80,39 %)

Aminosyretransport/metabolisme (556), karbohydratmetabolisme (501), transkripsjon (464), lipidmetabolisme (440), koenzymmetabolisme (298), forsvarsmekanismer (100)

Salt-alkali-toleransegener identifisert:

Glycin/betain transporter

Natriumsymportør

Antiportører

F0F1 ATP-syntase

2.4 Metabolomisk analyse

Metabolittidentifikasjon:Totalt 986 metabolitter påvist

OPLS-DA-analyse:Tydelig skille mellom grupper; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Differensielle metabolitter:

186 totalt:

Gruppe B: 96 (13 oppregulerte, 83 nedregulerte)

Gruppe C: 132 (41 oppregulerte, 91 nedregulerte)

49 oppregulert i både B & C

196 unikt uttrykte metabolitter i B & C

Totalt 246 oppregulerte eller unike metabolitter

Pathway Enrichment (KEGG):

Sesquiterpenoid og triterpenoid biosyntese

Purin metabolisme

Lysinbiosyntese og nedbrytning

Pantotenat og CoA biosyntese

Arginin og prolin metabolisme

Steroid biosyntese

Disse resultatene tyder på at stamme A8 tilpasser seg salt-alkali-stress gjennom både genetisk og metabolsk regulering.

---

Konklusjon

Denne studien ble vellykket isolert og identifisertPseudalkalibacillussp. A8 fraCistanche deserticola, en potensiell ny art som viser sterk salt-alkali-resistens. Gjennom hele genom- og metabolomiske analyser har flere gener og metabolske veier blitt identifisert som bidragsytere til stresstilpasningen. Disse funnene gir et teoretisk grunnlag for å utvikle mikrobielle midler for å forbedre avlingstoleransen og gjenvinne saltvann-alkalijord.

 

Referanser

Wang Y., Wang Y., Zhang Q., et al.Salt-alkalisk jordegenskaper forbedret av synergistiske effekter avPriestia aryabhattaiJL-5,Staphylococcus pseudoxylosusXW-4,Leymus chinensisog jordmikrobiota. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin, et al.Effekter av jordforandringer på vekst av havre og jordsmonns fysiske egenskaper i saltvann-alkaliland. Journal of Gansu Agricultural University, 2024, 59(5): 136–144. (på kinesisk)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani, et al.Isolasjons- og salt-alkali-toleransemekanisme avRhizobiumSil BFL-3. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 31(7): 1501–1512. (på kinesisk)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun, et al.Påføring av en salt-alkali-tolerantCitrobacterPåkjenning for å fremme plantevekst og utvinning av dens salt-alkali-toleransegener. Mikrobiologi Kina, 2024, 51(3): 864–879. (på kinesisk)

Wani ZA, Ashraf N., Mohiuddin T., et al.Plante-endofytt-symbiose: et økologisk perspektiv. Anvendt mikrobiologi og bioteknologi, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Endofytiske sopp som bor i medisinplanter har evnen til å produsere de samme eller lignende farmakologisk aktive sekundære metabolitter som deres verter. Hellenic Plant Protection Journal, 2017, 10: 51–66.

Kinesisk farmakopékommisjon.Farmakopéen til Folkerepublikken Kina, bind I. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(på kinesisk)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua, et al.Screening, identifisering og antagonistisk mekanisme for biokontrollbakterier mot tobakkspatogen. Journal of Southern Agriculture, 2023, 54(8): 2245–2256. (på kinesisk)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan, et al.Fremstillingsmetoder for flere typiske biologiske prøver for skanningselektronmikroskopi. Hubei landbruksvitenskap, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (på kinesisk)