Studie om de terapeutiske effektene og mekanismene til Cistanche Deserticola-ekstrakt på deksametasonindusert sarkopeni hos mus

Abstrakt:Denne studien utforsketterapeutisk effekt av Cistanche deserticola-ekstrakt (CdE)på deksametason (Dex)-indusert sarkopeni hos mus og mulig virkningsmekanisme. For det første ble de farmakodynamiske komponentene og viktige målene til Cistanche studert av nettverksfarmakologi, og veiene ble beriket for å forutsi virkningsmekanismen til CdE. I dyreforsøk ble 50 KM-mus tilfeldig delt inn i 5 grupper (kontrollgruppe, Dex-modellgruppe, CdE-høydosegruppe, CdE-middeldosegruppe og CdE-lavdosegruppe). Bortsett fra kontrollgruppen ble de andre gruppene injisert subkutant for å indusere sarkopeni etter 42 dager, og de tre behandlingsgruppene fikk forskjellige doser CdE oralt samtidig. Under forsøket ble dyrevekten, treningskapasiteten og kroppssammensetningen regelmessig testet. Etter at dyrene ble avlivet, ble muskelkoeffisienten til baklemmer beregnet, og histologi og relaterte genekspresjonstester ble utført. Nettverksfarmakologiske resultater viser at CdE kan behandle sarkopeni ved å oppregulere IGF-1-relaterte signalveier. Resultatene fra dyreforsøk viser at CdE reverserer signifikant reduksjonen av magert kjøttinnhold og muskelkoeffisient forårsaket av Dex, forbedrer treningskapasiteten, reduserer fettinnholdet, forbedrer den histologiske statusen til musklene, oppregulerte IGF-1, MyoD og MyoG, og nedregulerte uttrykket av Atrogin-1 og MuRF-1. CdE har en terapeutisk effekt på Dex-indusert muskelatrofi og kan forbedre muskelhistologisk morfologi, og dens virkningsmekanisme kan være aktivering av IGF-1 signalvei.

Nøkkelord: Cistanche deserticola ekstrakt; deksametason; sarkopeni; nettverk farmakologi; IGF-1 vei

 

 

echinacoside fordel

 

1. Materialer og metoder

1.1 Reagenser

Følgende reagenser ble brukt i denne studien:

Deksametasonnatriumfosfatinjeksjon(Batch No. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Vanlig saltvann(Batchnr. L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Vannfri etanol, xylen, paraformaldehyd, ogglutaraldehyd– China National Pharmaceutical Group

Saltsyre(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Hematoxylin-fargeløsning– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Eosin fargestoffløsning– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 epoksyharpiks-innstøpingssett, uranylacetat– SPI Company

Molpure® RNA-ekstraksjonssett, PrimeScript RT-sett, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology and Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 aktive ingredienser av cistanche

 

1.2 Instrumenter

Hovedutstyr som brukes:

NK-10 analog push-pull-måler– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H kroppssammensetningsanalysator– Niumag Corporation

BA 210 digitalt trinokulært mikroskop– Motic Group

JEM-1400 FLASH-transmisjonselektronmikroskop– JEOL, Japan

QuantStudio™ 3 sanntids PCR-system– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Nettverksfarmakologianalyse

For å undersøke de aktive forbindelsene og potensielle mekanismer tilCistanche tubulosai behandlingen avsarkopeni, a nettverksfarmakologitilnærmingen ble brukt:

Aktive forbindelseravCistanche tubulosable screenet ved hjelp avTradisjonell kinesisk medisinsystems farmakologidatabase (TCMSP), med terskler på:

Oral biotilgjengelighet (OB) større enn eller lik 30 %

Legemiddellikhet (DL) Større enn eller lik 0,18

Ekstra forbindelse ogmålinformasjonble hentet fra:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Sykdomsrelaterte gener for sarkopenible hentet fra:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Protein-protein interaksjonsanalyse (PPI).ble utført viaSTRING database(https://string-db.org).

A forbindelse-mål-gen interaksjonsnettverkble konstruert ved hjelp avCytoscape 3.2.1.

Funksjonell berikelseble utført ved hjelp av:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) forGenontologi (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) for veianalyse

Resultatene ble visualisert viaNettbasert bioinformatikkverktøy(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 Utarbeidelse avCistanche tubulosaUtdrag (CdE)

DeCistanche tubulosaekstraktet ble fremstilt som følger:

Rå urteskiver (batchnr. Y221217) ble kjøpt fraSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., og autentisert av prof. Yang Wenyu ved Xihua University.

1 kg tørketCistanche tubulosable pulverisert og ført gjennom en40 mesh sikt.

A 1:20 materiale-til-væske-forholdble brukt med50 % etanol-vann-løsning.

Blandingen varbløtlagt i 30 min, etterfulgt avultralyd ekstraksjonpå55 grader, 250 W, for40 min.

Ekstrakter varsentrifugert, filtrert og konsentrert under redusert trykkved 60 grader til en tykk pasta (densitet 1,2) ved hjelp av en rotasjonsfordamper.

Det konsentrerte ekstraktet varfrysetørket under vakuum, noe som gir en finaleutvinningseffektivitet på 40 %.

 

1.5 Dyreforsøksdesign

Totalt50 SPF-grade KM hannmus, 6 uker gammel og veier(22 ± 2) g, ble brukt i denne studien (Animal License No.SCXK [Chuan] 2023-030). Alle dyreprosedyrer fulgteForskrift om forvaltning av forsøksdyrutstedt av departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina og vargodkjent av Animal Ethics Committee ved Xihua University(Godkjenningsnr.: XH-2023-02-01).

Boligforhold:Temperatur (26 ± 1 grad), fuktighet (50 ± 10%), 12 timer lys/mørke syklus, fri tilgang til mat og vann.

Etter 7 dager med akklimatisering ble mustilfeldig fordelt i 5 grupperbasert på kroppsvekt.

Kroppsvekt ble registrert daglig, og generelle helsetilstander som oppførsel, pelstilstand og matinntak ble overvåket.

Behandlingsgrupper og doseringerer detaljert iTabell 1.

Pådager 40–42, motoriske funksjonstester(grepstyrke og svømming) ble gjennomført.

Pådag 43, etter 12 timers faste ble kroppsvekt og kroppssammensetning registrert. Mus ble deretter bedøvet med eter og avlivet. Bilaterale skjelettmuskler i bakbenet ble raskt dissekert og veid.

Devenstre gastrocnemiusble kuttet på langs og festet inn3% glutaraldehydog4% paraformaldehyd, henholdsvis.

Dehøyre gastrocnemiusble frosset ved -80 grader forqPCR-analyse.

SEO nøkkelord:dyremodell av sarkopeni, KM-mus, muskelatrofieksperiment, muskelfunksjonsvurdering, etisk dyreforskning

acteoside fordeler

1.6 Kroppssammensetning og muskelindeksmåling

Kroppsvektble registrert daglig gjennom hele forsøket.

Før ofring,kroppssammensetning(mager masse og fettmasse) ble måltto ganger, oggjennomsnittsverdible tatt opp.

Etter offer,skjelettmuskulatur i bakbenetble veid.

Demuskelmasseindeksble beregnet ved hjelp avCuadros formel [11]:

Muskelindeks (%)=Muskelmasse / Kroppsvekt × 100
(ligning 1)

SEO nøkkelord:mager kroppsmasse i mus, muskelindeksberegning, kroppssammensetningsanalysator, sarkopeni biomarkører

 

1.7 Motorfunksjonstester

Å vurderemuskelfunksjon, ble følgende tester utført mellom dag 40 og 42:

Svømmeprøve:

Hver mus varveid, og enbelastning (5 % kroppsvekt i blyfolie)ble festet til den distale tredjedelen av halen.

Mus ble plassert i enbeholder med 25 graders vann, på en dybde større enn eller lik 30 cm.

Svømmetidble registrert fra innreise til musen ikke lenger kunne flyte og begynte å synke.

Hver mus ble testet en gang daglig for3 dager på rad, oggjennomsnittligble tatt som sluttresultat.

Grepstyrketest:

Utført ved hjelp av enmanuell push-pull måler.

Hver mus ble testetfem ganger, med en150 sekunders hvilemellom prøvene.

Degrepsstyrkekoeffisientble beregnet for å normalisere for kroppsvekt:

Grip Strength Coefficient=Grip Force / Kroppsvekt (N/kg)
(ligning 2)

SEO nøkkelord:svømming utholdenhetstest, grepsstyrke hos gnagere, muskelytelsesmålinger, sarkopeni-musemodell

 

1.8 Histologisk analyse

For å vurderemorfologiske endringer i muskelvevetter behandling medCistanche tubulosaekstrakt (CdE):

Hematoxylin & Eosin (H&E) fargingble utført på vev festet i4% paraformaldehyd.

Snitt ble observert under alysmikroskop, ogmuskelfiberens tverrsnittsarealble analysert ved hjelp avImageJprogramvare.

Tilultrastrukturell analyse, muskler fiksert inn3% glutaraldehydble etterfikset1 % osmiumtetroksid, dehydrert i aceton og innebygd iEp812 harpiks.

Semitynne seksjonerble farget medtoluidinblåttfor posisjonering.

Ultratynne seksjonerble farget meduranylacetat og blycitrat, og observert med enJEM-1400FLASH transmisjonselektronmikroskop.

Muskelfiberbreddeble målt ved bruk av ImageJ.

SEO nøkkelord:skjelettmuskelhistologi, HE-fargeprotokoll, elektronmikroskopi i muskelforskning, muskelfibermorfologianalyse

cistanche fordelsliste

1.9 Genekspresjonsanalyse

For å undersøkemolekylære mekanismerav CdE i sarkopeni:

Frosset muskelvevble mekanisk forstyrret under flytende nitrogen.

Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk avTRIpure reagensi henhold til produsentens instruksjoner.

cDNA ble syntetisert med enomvendt transkripsjonssett, ogqPCRble utført ved hjelp av enThermo Scientific PikoRealsystem.

GAPDHble brukt som et internt referansegen.

Primersekvenser formuskelrelaterte generer oppført iTabell 2.

SEO nøkkelord:qPCR for muskelatrofigener, GAPDH-referansegen, RNA-ekstraksjon fra muskel, genuttrykk ved sarkopeni

 

1.10 Statistisk analyse

Eksperimentelle data ble analysert vhaenveis ANOVA, etterfulgt avDunnetts test for flere sammenligninger.

A P-verdi < 0,05ble ansett som statistisk signifikant.

Alle statistiske analyser ble utført vhaSPSS 23.0.

Histomorfometriske datable analysert ved hjelp avImageJprogramvare.

SEO nøkkelord:statistisk analyse i farmakologiske studier, SPSS i biomedisinsk forskning, ANOVA i dyrestudier, ImageJ muskelanalyse