Stx2 induserer differensielt genuttrykk og forstyrrer døgnrytmegener i den proksimale tubuli

Abstrakt: Shigatoksinproduserende Escherichia coli(STEC) forårsaker proksimale tubulære defekter i nyrene. Imidlertid er faktorer endret av Shiga-toksin (Stx) i de proksimale tubuli ennå ikke vist. Vi bestemte Stx-reseptor Gb3 i murine og humane nyrer og bekreftet reseptoruttrykket i de proksimale tubuli. Stx2-injisert mus nyrevev ogStx2-behandlede humane primære nyreproksimale tubulære epitelceller(RPTEC) ble samlet og mikroarray-analyse ble utført. Vi sammenlignet murine nyre- og RPTEC-matriser og valgte vanlige 58 gener som er differensielt uttrykt vs. kontroll (0 timer, ingen toksinbehandlet). Vi fant at det mest uttrykte genet var GDF15, som kan være involvert i Stx2-indusert vekttap. Gener assosiert med tidligere rapporterte Stx2-aktiviteter som src kinase Ja fosforyleringsvei aktivering utfoldet proteinrespons (UPR) og ribotoksisk stressrespons (RSR) viste differensielle uttrykk. Dessuten ble døgnklokkegener differensielt uttrykt, noe som tyder på Stx2-indusert nyre døgnrytmeforstyrrelse. Døgnrytmeregulert proksimal tubulær Na+ -glukosetransportør SGLT1 (SLC5A1) ble nedregulert, noe som indikerte proksimal tubulær funksjonsforverring, og mus utviklet glukosuri som bekreftet proksimal tubulær dysfunksjon. Stx2 endrer genuttrykk i murine og humane proksimale tubuli gjennom kjente aktiviteter og nylig undersøkte døgnrytmeforstyrrelser, noe som kan resultere i proksimale tubulære dysfunksjoner.

Nøkkelord:Shiga-toksin type 2 (Stx2);renal proksimal tubuli; mus; human renal proksimal tubulær epitelcelle (RPTEC); mikroarray; døgnrytme

Hovedbidrag:Differensielt uttrykte gener fra Stx2-behandlede musenyrer og humane primære proksimale tubulære celler ble analysert. I tillegg til tidligere kjente Stx2-påvirkede gener, ble det vist at gener knyttet til døgnrytme endrer uttrykket deres og hadde innflytelse på den proksimale tubulære funksjonen.

1. Introduksjon

Shigatoksinproduserende Escherichia coli(STEC)-infeksjon forårsaker alvorlige symptomer på hemolytisk uremisk syndrom (HUS), som er definert av triaden av akutt nyresvikt, trombocytopeni og hemolytisk anemi [1]. Shiga-toksiner (Stxs) antas å spille en viktig rolle i å skade celler i denne infeksjonssykdommen. Den karakteristiske nyrehistopatologien til HUS inkluderer glomerulære og tubulære skader som kapillær fibrinavsetning i henholdsvis glomeruli og tubulær nekrose [1,2]. Tidligere dysfunksjonsforekomst i proksimale tubuli hos STEC-infiserte pasienter er rapportert ved analyse av urin. De proksimale tubulære funksjonelle urinmarkøreneN-acetylglukosaminidase(NAG) og 2 mikroglobulin (2MG) fra akuttstadiumurin fra STEC O157- eller O111-assosierte HUS-pasienter ble målt til å være sterkt økt, noe som tyder på tidlig proksimal tubulær dysfunksjon [3].

Stxs, inkludert Stx2, består av en enkelt A-underenhet og fem B-underenheter (A1B5-toksin), der A-underenheten har enzymatisk aktivitet som depurinerer adenin 4324 fra 28S rRNA fra 60S-ribosom-underenheten, mens B-underenheter er nødvendige for å binde vertsceller gjennom globotriaosylceramid (Gb3). Det er flere kjente påvirkninger som Stxs utøver på cellene. (I) Ved å binde seg til sin reseptor Gb3, fremkaller toksinet signaltransduksjon gjennom Src-familiekinase Ja [4,5]. Etter binding til reseptoren internaliserer Stxs til cellen ved endocytose og blir retrogradt transportert til ER. Stxs går gjennom endosomet og Golgi-apparatet hvor A-subenheten spaltes mellom katalytiske A1- og C-terminale A2-fragmenter av furin [6], selv om A1- og A2-fragmenter fortsatt er forbundet med en disulfidbinding. Toksin når ER og disulfidbindingen kan reduseres; deretter frigjøres et A1-fragment fra holotoksin [7,8]. Dette er når påvirkning av (II) ER-stress skjer med utfoldede protein-etterlignende toksinfragmenter, som induserer utfoldet proteinrespons (UPR). Både A- og B-underenheter er i stand til å binde Bip, noe som tyder på å indusere ER-stress [9,10]. Det spaltede A1-fragmentet translokeres til cytoplasmaet og depurerer et adenin fra 28S rRNA til (III) hemmer proteinsyntesen. Modifikasjonen Stxs forårsaker til 28S rRNA induserer (IV) ribotoksisk stressrespons (RSR), som aktiverer nedstrøms signaleringskaskade [11]. Påvirkninger (II) og/eller (IV) er kjent for å indusere (V) spesiell gentranskripsjon som fører til cytokinsekresjon [12]. Dessuten er (II) og (IV) involvert i (VI) Stxs-indusert apoptose [13–15].

In vitro-eksperimenter med humane proksimale tubuli og in vivo musemodeller kobler sterkt proksimale tubulære skader til Stxs. Både primærkulturer og cellelinjer av humane proksimale tubuli er svært mottakelige for Stxs og viser cytokinfrigjøring og celledød, inkludert apoptose [16–20]. Humane primære renale proksimale tubulære epitelceller (RPTECs) uttrykker reseptoren Gb3, er svært mottakelige for Shiga-toksiner, og har blitt brukt i mange artikler for å analysere biologiske reaksjoner som proteinsyntesehemming, cytokinproduksjon og induksjon av apoptose [17,20] . Shigatoksin type 1 (Stx1)-injiserte mus viste glukosuri, noe som indikerer redusert reabsorpsjon av glukose av den proksimale tubulus [21]. Disse antyder Stxs toksisitet til de proksimale tubuli både in vitro og in vivo. I STEC-infiserte musemodeller er hyppige funn i histopatologi nekrose av tubulære epitelceller og utslettede celler i lumen av de proksimale tubuli [22–24]. Renset Stx (enten Stx1 eller Stx2) injiserte mus presenterer også sloughing av de proksimale tubuli med relativt intakte kjerner [25–27].

Selv om skader på de proksimale tubuli assosiert med Stx-injeksjon eller STEC-infeksjon er blitt beskrevet funksjonelt og histologisk, er genmål involvert i lesjon av proksimale tubuli ennå ikke vist.

Her analyserte vi genuttrykk i Stx2-injiserte musenyrer og Stx2-behandlet human primær nyreproksimal tubulær epitelcellekultur (RPTEC) for å vise proksimale tubuliassosierte genendringer indusert av Stx2.

2. Resultater

2.1. Stx2-Injisert musenyrepatologi

For å identifisere Stx{{0}}assosiert murin nyrepatologi, ble nyrevevssnitt fra Stx2-injiserte mus farget med Periodic Acid-Schiff (PAS). En klar sterk rosa flekk på den luminale siden av tubulære epitelceller indikerer glykokalyx av børstekanten, som er karakteristisk for de proksimale tubulære cellene. Vi bestemte celler/kjerner utenfor glycocalyx (innenfor det luminale rommet) som løsrevet fra naboceller og basalmembraner (dvs. utslettede celler). I figur 1B (8 timer etter Stx2), C og D (48 timer etter Stx2), er utslettede celler med relativt intakte kjerner vist med piler. Vi observerte også celleavfall i det proksimale rørformede lumen (pilspisser i figur 1). Etter Stx2-administrasjon så disse lesjonene ganske tydelig ut, mens de var ubetydelige ved 0 timer (Figur 1A, uten Stx2).

Figur 1. Stx2 induserer sloughing av proksimale tubulære celler i den murine nyren. Periodic acid Schiff (PAS)-farger av Stx2-injiserte murine nyreseksjoner er vist. (A) 0 timer (naiv), (B) 8 timer og (C) 48 timer etter Stx2-injeksjon. Piler indikerer sloughing proksimale tubulære celler. Pilspisser indikerer celleavfall. Et forstørret felt innenfor (C) er vist i (D) med sloughing celler pekt med piler. Søyler i (A–C) indikerer 50 µm. Skalalinjen i (D) indikerer 10 µ

2.2. Gb3-uttrykk i mus og menneskelige nyrer

2.2.1. Mus Renal Cortex Gb3 uttrykk

Ettersom de proksimale tubulære cellene viste histologiske skader fra Stx2-fornærmelse, testet vi Stx2-reseptor globotriaosylceramid (Gb3) uttrykk i murin nyrecortex sammen med en proksimal tubulær markør aquaporin -1 (AQP1). Som vist i figur 2, viste AQP1-positive celler Gb3-positivitet for det meste på den luminale siden av cellene (cellene er merket med lukkede pilspisser, mens lumina er merket med stjerner). Vi observerte også at AQP1 negative rørformede Gb3-flekker antagelig samler kanalceller (Figur 2 åpen pilspiss) som rapportert [28]. Intensiteten til Gb3-farging var sterkere i AQP1 (−)-cellene, men antallet av denne typen tubuli var mindre sammenlignet med Gb3/AQP1 dobbeltpositive proksimale tubuli i cortex. CD31-positive endotelceller er Gb3-negative i musenyren. En isotypetilpasset antistoffkontroll for Gb3 (rotte-IgM) ble brukt som en negativ kontroll. Rotte IgM reagerte ikke med musenyrevev (figur S1)

2.2.2. Human Renal Cortex Gb3-uttrykk

I humant nyrevev var Gb3 også positiv i AQP1-positive proksimale tubuli (Figur 3, lukkede pilspisser). Lokaliseringen av Gb3 i de proksimale tubulære cellene var sterkere på den luminale siden. Vi observerte også AQP1(−)Gb3(+)-celler (figur 3, åpne pilspisser) slik vi gjorde i murint vev. Humane endotelceller uttrykker Gb3 (CD31/Gb3 dobbelt positiv, figur 3, stjerne). Isotypekontrollseksjoner med rotte-IgM viste ingen positiv reaksjon i humant nyrevev (figur S2).

2.3. Mikroarray-analyse

Siden både muse- og humane proksimale tubulære epitelceller er Gb3-positive, tyder det på at denne celletypen påvirkes direkte av Stx2. For å bestemme Stx2-påvirkede gener i både murine og humane proksimale tubulære celler, ekstraherte vi totalt RNA fra nyrene til Stx2-injiserte mus og Stx2-behandlede humane primære RPTECer og analyserte genuttrykk ved mikroarray

2.3.1. Differensielt uttrykte gener i både musenyre og RPTEC

Differensielt uttrykte gener (DEG), som er felles for både musenyrer og RPTEC ble valgt. Grunnlaget for å velge vanlige DEG-er er at (1) gener med log2-fold endring (mot 0 h) mer enn 1 eller mindre enn -1 i både musenyre og RPTEC-mikroarray minst i én- tidspunkt og (2) distribusjon av log2-fold endring av et gen passer til kubiske kurver i stedet for kvadratiske kurver for bedre å imøtekomme genuttrykkstopper midt i tidsforløpet i nyremikroarrayen. Med de to kriteriene ovenfor valgte vi 58 vanlige gener mellom den Stx2-behandlede musenyren og human RPTEC (Figur 4A). Ekspresjonsmønstre for disse 58 genene i musenyren er vist i et varmekart (Figur 4B). De fleste gener ble oppregulert senere timer etter Stx2-injeksjon; noen gener hadde imidlertid tidligere uttrykksmønstre. Gener som hadde mer enn 1 i logg2-foldendring ble oppført for hvert tidspunkt (tabell 1).

Figur 4. Mikroarray-analyse. (A) Blant gener analysert med mikroarray, ble 147 gener (grønn sirkel) og 4013 gener (rød sirkel) fra henholdsvis Stx2-behandlet musenyre og RPTEC oppdaget å ha log{ {4}}fold endring mindre enn -1 eller mer enn 1. Gener som ble endret ved Stx2-behandling mot 0 timer i begge mikroarrays (vanlige differensielt uttrykte gener/DEGs) var totalt 58 (rødt og grønt overlappende område). (B) Varmekartet til de vanlige 58 genene er vist i tidslinjen for prøvetaking av musenyre. Z er lik 0 angir et gjennomsnitt av log2-fold endringsverdier for et gen og gjenspeiler en trend for genuttrykk. Dermed representerer en grønnaktig farge en lavere verdi enn gjennomsnittet av et bestemt gen på rad, mens en rødlig farge representerer en endring over gjennomsnittet. Logg2-folddata for de 58 genene fra det PBS-injiserte 72 timers datasettet sammenlignet med 0 timer er presentert som tabell S3 for referanse. (C) Metascape GO-anrikingslinjen vises. X-aksen viser −log10 p-verdier av berikede GO-termer på tvers av 58 vanlige DEG-er at et høyere antall av den berikede GO-termen er mer sannsynlig relevant for systemet. De 20 beste berikede GO-begrepene vises. (D) STRING-analyse av 58 vanlige DEG-er er vist i de seks mest tilkoblede/relaterte klynger. Sfæriske farger betegner gener som tilhører samme klynge. Forholdet mellom handlinger mellom gener vises på farge- og endeformkodet måte. ENSG00000279576 er nå kodet som ENSP00000485396, som angir den menneskelige ID-en til genet MALAT1.

For å analysere funksjonaliteten til vanlige DEG-er brukte vi Metascape-plattformen. Den tildeler Gene Ontology (GO) termer, som består av molekylær funksjon, cellulær komponent og biologisk prosess, til utvalgte gener. Vi deponerte de vanlige 58 DEG-ene til Metascape og oppnådde topp 20 GO-termer som disse DEG-ene tilhører (Figur 4C). GO-termer er oppført med tilsvarende gener i tabell S1. For å se en genliste innenfor hver GO-term vist i figur 4C, se Tabell S2 Metascape-anriking. GO-termer assosiert med celledød, betennelse og signalkaskader ble rangert blant de 20 beste som forventet; døgnrytme vakte imidlertid oppmerksomhet som et nytt GO-begrep. Kjente forbindelser av vanlige gener ble vist med STRING-analyse (figur 4D). I denne analysen ble gener gruppert i seks forskjellige grupper som ble gjort rede for en sterk assosiasjon av binding, påvirkninger (katalyse, aktivering eller inhibering), samt samuttrykk av gener.

2.3.2. Trend for genuttrykk

Spor av flere genuttrykk er vist i grafer med x-aksen for tiden (h) etter Stx2-injeksjon og y-aksen for log2-fold endring mot 0 h (Figur 5). Dermed betyr y-akseverdien 1 en 2-fold endring vs. 0 h-uttrykk.

Figur 5. Differensielt uttrykte gener med museprøvetakingstidslinje. (A) PDK4 og CEBPB mRNA-ekspresjonsmønstre er vist. (B) umiddelbart-tidlige gener. (C) Matricellulære proteiner CYR61 (CCN1) og CTGF (CCN2) uttrykk. (D) UPR-relaterte gener DDIT3 (CHOP, GADD153), DDIT3-bindingspartner CEBPB og negativ tilbakemeldingsfaktor PPP1R15A (GADD34) er vist. (E) Transkripsjonsfaktorer DDIT3 (CHOP, GADD153) og ATF3 og GDF15, som er transkripsjonelt regulert av disse faktorene, er vist. (F) UPR- og RSR-assosierte gener er vist. (G) EDN1 i forhold til UPR-gener er plottet. (H) Tidlige topper av EDN1 og EGR1 og den følgende toppen av PER1 er vist med en senere gradvis økning i alle tre gener. (I) Gener fra figur 4D lilla klynge er døgnrytmerelaterte gener. (J) Cirkadiske kjernegener PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 og Clock er vist. (K) PER1 og døgnregulerte nyregener er vist. (L) Inflammatoriske gener med NF-kB pathway-relaterte gener er vist. For å se individuelle log2-datapunkter, se tilleggsfigur S4. Figur S5, som viser gjennomsnittlig log2 med standardavviksstolper, er presentert som en referanse.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYRESINFEKSJON