Målretting mot laktatdehydrogenase A med katekin resensibiliserer SNU620/5FU gastriske kreftceller til 5-fluorouracil del 2
Mar 23, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
2.5. CA- og 5Fu-sambehandling induserer mitokondriell ROS-avhengig apoptose
Siden LDHA-hemming direkte øker mitokondriell ROS og tap av dets membranpotensial, og deretter induserer apoptose [16,29], ble faktorene relatert til mitokondriell ROS-mediert apoptose undersøkt. CA eller 5FU enkeltbehandling økte litt mitokondrielt ROS-nivå i SNU620/5FU-celler når målt ved flowcytometri ved bruk av MitoSOX. Imidlertid forbedret samtidig behandling med CA og 5FU betydelig mitokondriell ROS-produksjon. Denne økte ROS-produksjonen ble reversert av Mito-TEMPO, en mitokondrie-målrettet antioksidant (figur 5A-C). Veksthemming etter behandling med CA og 5FU ble også gjenvunnet ved Mito-TEMPO-behandling i SNU620/5FU-celler (figur 5D). Videre ble apoptose evaluert via Annexin V-FITC/PI-farging i SNU620/5FU-celler. Samtidig behandling med CA og 5FU økte antallet apoptotiske celler blant SNU620/5FU-celler (Figur 6A, B). Kjernemorfologisk fragmentering vises under apoptose, og det kan observeres ved 4',6-diamidino-2-fenylindol(DAPI)-farging [30,31]. DNA-fragmentering ble funnet å ha økt betydelig i sambehandlingsgruppen, sammenlignet med den i kontrollgruppen (Figur 6C). Til slutt ble biomarkører for apoptose inkludert Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 og PARP undersøkt. Den proapoptotiske kaskaden økte etter samtidig behandling med CA og 5FU i SNU620/5FU-celler (figur 6D). Disse funnene tyder på at samtidig behandling med CA og 5FU induserer apoptose i SNU620/5FU-celler.
Figur 5. Samtidig behandling med katekin(CA) og 5-fluorouracil(5FU) øker produksjonen av mitokondriell ROS:(A)SNU620/5FU-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av CA,5FU (10 μM) og Mito -TEMPO（20 μM） i 48 timer. Cellenes mitokondrielle ROS ble målt via FACS-analyse ved bruk av MitoSOXTM Red;(B) søylediagrammet viser frekvensen av celler som var positive for MitoSOX-farging;(C)fluorescensmikroskopibilder (X100) av SNU620/5FU-celler farget med MitoSOX ble presentert; (D) levedyktigheten til cellene ble målt via MTT-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
Figur 6. Økning av apoptose ved samtidig behandling med katekin(CA) og 5-fluorouracil(5FU); SNU620/5FU-celler ble behandlet med CA （10 uM） og/eller 5FU （10 μM） i 48 timer∶（A） antall apoptotiske celler ble analysert via FACS-analyse ved bruk av PI-Annexin V-farging; (B) prosentandelen av celler i tidlige og sene apoptotiske faser. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SEM.**s<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
3. Diskusjon
I denne studien, for å karakterisere og evaluere kjemoresistens mot 5FU, brukte vi SNU620/5FU-celler, som ble etablert ved langvarig eksponering for 5FU med en seriell økning av medikamentkonsentrasjonen [32]. De parentale SNU620-cellene er rapportert å inneholde en p53-mutant med en homozygot delesjon i ekson 5 [33]. Basert på en DNA-mikroarray er flere gener involvert i kjemoresistens, inkludert tymidylatsyntetase, skadespesifikt DNA-bindende protein 2, clusterin og midkine, forhøyet i SNU620/5FU-celler [32]. Flere tidligere studier har brukt SNU620/5FU-cellelinjen som en modell for å evaluere in vitro-effekten av legemidler mot resistens mot 5FU gjennom antimitose, AMPK-aktivering og cannabinoidreseptorsignalering [34-36]. Imidlertid er de metabolske egenskapene og uttrykksnivåene til metabolismerelaterte gener i SNU620/5FU-cellene og deres roller i kjemoresistens ikke i stor grad undersøkt.
Her demonstrerte vi at SNU620/5FU-celler har avanserte glykolytiske fenotyper, inkludert forhøyet laktatproduksjon og uttrykk for enzymer relatert til omdannelsen av pyruvat til laktat, slik som LDHA. Fosforyleringen av PDHA1, som representerer den reduserte PDH-aktiviteten ved forhøyet PDK2 og PDK3, økte også i SNU620/5FU-resistente celler, sammenlignet med den i SNU620 foreldreceller. OCR ble imidlertid ikke signifikant redusert i resistente celler. En mulig forklaring på dette avviket er næringsplastisiteten til kreftceller for TCA-syklusen, det vil si at aminosyrer eller fettsyreavledet acetyl-CoA, ikke bare glukose-avledet acetyl-CoA, kan levere substrater til TCA-syklusen [37 ].I korrelasjon med dette fremmer 5FU-resistente magekreftceller stamness via mitokondriell fettsyreoksidasjon [38]. I tillegg har 5FU-resistens vært relatert til økt mitokondriell masse og aktivitet, inkludert uttrykk for elektrontransportkjede (ETC) enzymer og oksygenforbruk [39,40]. Derfor fokuserte vi på moduleringen av LDHA for å resensibilisere 5FU-motstanden. Basert på resultatene våre, undertrykte hemmingen av LDHA-aktivitet med oksamat eller CA vellykket veksten av resistente SNU620/5FU-celler og resensibiliserte dem til 5FU-behandling. Disse funnene viste en god korrelasjon med de fra tidligere studier, som rapporterte at genetisk eller farmakologisk hemming av LDHA vellykket reduserte resistens mot kjemoterapi, inkludert 5FU [19,41,42]. Dermed antok vi at inhiberingen av LDHA kan være tilstrekkelig til å undertrykke motstanden mot 5FU i SNU620/5FU-celler.
Cistanche kan forbedre immuniteten
Flere syntetiske molekyler, som oksamat, FX11, PSTMB og GNE-140 har blitt etablert som småmolekylære LDHA-hemmere [11,43]. Blant disse er FX11 rapportert som en sensibilisator for kjemoterapi i resistente tumorceller [44]. Men selv om mange LDHA-hemmere er under gransking for godkjenning som nye kreftmedisiner, har ingen av dem blitt godkjent ennå. Dermed kreves det flere medikamentlignende kandidater for å generere nye LDHA-hemmere [45]. Naturlige forbindelser har blitt sett på som potensielle ressurser for kreftmedisiner, spesielt for å overvinne kjemoresistens som en kombinasjonsterapi [46,47]. Derfor er målretting av kreftmetabolisme, spesielt glukosemetabolisme med planteavledede naturlige produkter en ny forskningstrend for utvikling av nye kreftterapier [48].
Videre har flere rapporter antydet at naturlige produkter, som gossypol, galloflavin, crocetin, maskin A og EGCG, er potente LDHA-hemmere [43,49,50]. Selv om gossypol blant disse har den mest potente hemmende virkningen på LDHA (IC50=9.8 uM), hemmer det også aktiviteten til LDHB, som omdanner laktat til pyruvat [51]. Resultatene våre viste at EGCG, en etablert LDHA-hemmer og en sensibilisator for 5FU-kjemoterapi [22-25], har hemmende effekter på både LDHA- og LDHB-aktiviteter. Blant de naturlige produktavledede LDHA-hemmerne som viser LDHA-spesifikke hemmende aktiviteter, som maskin A(IC50 =84 μM), krocetin (IC50 =54.9 μM) og CA (IC{{13} }.69 μM）【49,50】, CA viste den beste undertrykkende effekten på LDHA-aktivitet med hensyn til ICsn-verdien. Selv om de kjemiske strukturene til CA og EGCG er svært like bortsett fra den ekstra gallussyredelen, var deres hemmende selektiviteter Ikke det samme. Til tross for at CA er den enkleste forbindelsen, sammenlignet med dens derivater, viste den den beste hemmende virkningen på både laktatproduksjon og LDHA-aktivitet. Derfor bør det utføres en omfattende struktur-aktivitetsstudie for å demonstrere CA som en potensiell ny ryggrad for utvikling av spesifikke og potente LDHA-hemmere.
EGCG har vært kjent som en konkurrerende hemmer av NADPH. I tillegg hemmer EGCG NADPH-oksidasetranslokasjon og reproduksjon [52-54]. I henhold til resultatene av molekylær modellering er imidlertid CA og EGCG strukturelt lokalisert på forskjellige steder (figur 3A, B). I tillegg viste de ikke korrelasjonen i spesifisiteten i hemming av LDHA- og LDHB-aktivitet, som bruker NADH og NAD pluss som kofaktor, henholdsvis. Fra disse dataene antok vi at CA ikke har noen direkte korrelasjon med EGCG i mekanismen for å konkurrere med NAD(P)H. Forresten, hemming av LDHA av flere inhibitorer, som FX11, GSK 2837808A, NCI-737 og NCI-006, reduserte NADt-produksjonen og økte NADH-akkumuleringen, og reduserte dermed forholdet mellom NAD pluss /NADH[16,17,55]. Apoptose indusert av p53/NAD-avhengig DNA-skadevei økes også av LDHA-hemming ved bruk av siRNA eller kjemisk inhibitor, NH-2 [56]. GCN2-ATF4-signalveien ble også rapportert som en annen mekanisme som er ansvarlig for apoptotisk celledød indusert av LDHA-hemmeren, GSK 2837808A [17]. Siden NAD/NADH-forholdet spiller en nøkkelrolle i redoks-homeostase og celleproliferasjon [5758], kan CA som en LDHA-hemmer påvirke de 5FU-resistente kreftcellene gjennom modulering av NAD pluss /NADH-forholdet.
CA induserte celledød i både SNU620- og 5FU-resistente SNU620/5FU-celler. Imidlertid var CA-indusert celledød LDHA-avhengig gjennom shRNA-uttømming i SNU620/5FU-celler. I tillegg viste samtidig behandling av CA og 5FU ytterligere antikrefteffekter på 5FU-resistente celler. Som tidligere rapportert [16,59], øker hemming av LDHA ROS og undertrykte følgelig veksten av kreftceller. Når LDHA ble hemmet, ble energimetabolismen omdannet fra glykolyse til TCA-syklusen og mitokondriell oksidativ fosforylering [60]. Dermed lager kreftceller mer ROS-produksjon, noe som resulterer i skade på mitokondriell membran og mitokondrie-indusert apoptose [61,62]. I god overensstemmelse med tidligere studier induserer CA apoptotisk celledød gjennom en mitokondriell ROS-avhengig vei. Økt ROS-forsvarsevne og reduserte apoptotiske signaler er vanlige egenskaper for kjemoresistente kreftceller, spesielt i 5FU-resistente celler 3,63]. Videre fører endringer i kreftmetabolismen, spesielt i glukosemetabolismen, også til resistens mot kjemoterapi gjennom endring av cellulære aktiviteter, slik som avvikende DNA-reparasjon, forbedret autofagi, redusert apoptose, forsvar mot ROS og økt sekresjon av eksosomer [9,64,651 . Målretting av glykolytiske enzymer, inkludert LDHA, med CA kan derfor være en alternativ strategi for å overvinne kjemoresistens, spesielt ved 5FU-resistent magekreft. Vanligvis er raskt delende ondartede svulster svært følsomme for DNA-syntesehemmere inkludert 5FU, sammenlignet med normalt vev. Noen kreftceller kan imidlertid utvikle resistens mot behandlingen gjennom flere mekanismer, som tidligere beskrevet [34-36]. Samtidig behandling av bioaktive forbindelser og konvensjonell kjemoterapi har en høyere effekt, sammenlignet med en enkelt forbindelse, på å bremse utviklingen av resistens |66. Derfor bør de biologiske effektene av spesifikke fytokjemikalier med påvist cytotoksiske effekter administrert med konvensjonell kjemoterapi for å målrette mot et bredere spekter av signalveier i kreftceller, inkludert kreftmetabolisme og mitokondriefunksjoner, være overlegne enkeltforbindelser i kreftbehandling siden de kan forsinke. utvikling av resistens [67]. I denne studien viste kombinasjonen av CA og 5FU en høyere hemming av cellelevedyktighet sammenlignet med en enkelt behandling. Videre demonstrerte vi at hemming av LDHA-aktivitet og påfølgende mitokondriell ROS-mediert apoptose kan være mekanismen som ligger til grunn for den sensibiliserende effekten av CA på 5FU-resistente celler (figur 7).
I tillegg til styrken og spesifisiteten til LDHA-hemming, er CA sikrere enn tidligere etablerte naturlige produktavledede LDH-hemmere. Dessuten er CA en velkjent kjemisk ingrediens i grønn te, og dens sikkerhet og farmakodynamiske egenskaper er bekreftet i tidligere studier [68-70]. En nøyaktig toksisitetsvurdering av samtidig administrering av CA og 5FU er imidlertid ennå ikke utført. I tillegg ble in vivo-effekten av CA i 5FU-resistente kreftceller ikke undersøkt i denne studien. Tidligere studier rapporterer imidlertid om in vivo antikrefteffektiviteten til CA og dets derivater for å overvinne kjemoresistens, inkludert 5FU-resistens i human gastrisk og tykktarmskreft [71-77]. I denne studien fokuserte vi på LDHA-hemmingen som en viktig molekylær mekanisme for CA for å overvinne motstanden mot 5FU. Derfor, for å utvikle CA som en ny adjuvans for kjemoresistente kreftceller, bør in vivo-effektiviteten og sikkerheten til CA- og 5FU-sambehandling evalueres gjennom omfattende dyrestudier, inkludert xenograft-modeller og gode laboratorietoksisitetsvurderinger.
4. Materialer og metoder
4.1. Materialer
Antistoffer mot poly(ADP-ribose)polymerase, caspase-3 og caspase-9 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Antistoffer mot LDHA, glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) og PDHA1 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), og de mot fosfor-PDHA1 og PDK3 ble kjøpt fra Abcam ( Abcam, Cambridge, MA, USA). Videre ble antistoffer mot PDK2 og PDK4 kjøpt fra Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, USA), de mot PDK1 ble hentet fra Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), og de mot B-celle lymfom-2(Bcl-2) og Bcl-2-assosiert X-protein ble kjøpt fra Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). MitoSOX ble kjøpt fra Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kjemikalier og reagenser, inkludert 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid(MTT),4',{{22} }diamidino-2-fenylindol, oksamat, nikotinamidadenindinukleotid, CA og CA-derivater (EC GC, EGC og EGCG) ble kjøpt fra Merck (Merck, Darmstadt, Tyskland). -nikotinamidadenindinukleotid (oksidert form) ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan).
4.2.Cellekultur
Human gastrisk kreft SNU620, SNU620/5FU og AGS, bukspyttkjertelkreft Panic-1 og MIA PaCa-2 og tykktarmskreft LS174T og RKO-celler ble hentet fra Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea ).SNU620-, SNU620/5FU-, AGS- og LS174T-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI-1640) (Welgene, Daegu, Korea), supplert med 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) )(Gibco, New York, NY, USA) og 1 prosent penicillin/streptomycin (Invitrogen), og Panc--1-, MIA PaCa--2- og RKO-cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Welgene) ) som inneholder 10 prosent varmeinaktivert FBS og 1 prosent penicillin/streptomycin. Alle cellene ble dyrket i en fuktet CO, inkubator ved 37 grader og 5 prosent CO2.
4.3. Cellelevedyktighetsanalyse
Cytotoksisitetsnivåene av CA og 5FU i SNU620- og SNU620/5FU-celler ble målt ved hjelp av en MTT-analyse. Celler ble dyrket i 24-brønnplater (2 × 104 celler/brønn) med de angitte konsentrasjonene av CA og 5FU for den angitte dagen. MTT-løsning (2,0 mg/ml) ble deretter tilsatt til hver brønn, etterfulgt av 3-4 timers inkubering ved 37 grader og 5 prosent CO, i en cellekulturinkubator. Kulturmediet ble deretter fjernet, og absorbansen av formazankrystaller ble laget fra levende celler. DMSO ble tilsatt for å løse opp formazankrystallene, og det ble målt ved 540 nm ved bruk av en Spectramax M2 mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
4.4. Ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) og oksygenforbrukshastighet (OCR)
ECAR og OCR, som indikerer de cellulære hastighetene for henholdsvis glykolyse og oksidativ fosforylering, ble overvåket med Seahorse XF-analysatoren (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), som beskrevet tidligere [78,79]. Kort fortalt ble 60,000 SNU620 eller SNU620/5FU celler per brønn sådd i Seahorse XF seks-brønns plater i RPMI medium supplert med 1 prosent penicillin/streptomycin. Etter en 30 minutters inkubering ble mediet fra hver brønn erstattet med 80 ul av det forvarmede serumfrie mediet med 5 mM oksamat, en standard LDH-hemmer [11]. Cellene ble deretter inkubert ved 37 grader C i 24 timer. Etter inkubering ble mediet fra hver brønn erstattet med 180 μL forvarmet XFbase-medium (inneholdt 10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM natriumpyruvat; pH 7,4) for å måle ECAR og OCR. Resultatene ble analysert ved bruk av Wave 2.6.0.31-programvaren (Agilent Technologies).
4.5. Kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR)
Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av RiboEx Total RNA Extraction Kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea), og cDNA ble syntetisert ved bruk av et revers transkriptasesett (Promega, Madison, WI, USA). Ved revers transkripsjon ble 1 ug total RNA brukt , og den totale mengden cDNA syntetisert er 20 μL. Hvert sett ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ PCR ble utført ved bruk av et StepOneTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), med Real HelixgPCR Sett (NanoHelix, Daejeon, Korea), for 40 sykluser bestående av 15 s ved 95 grader Cand 1 min ved 60 grader. Relative mRNA-nivåer ble normalisert til nivåene av 18S ribosomalt RNA, som fungerte som en endogen kontroll. Sekvenser av primerne brukt for qRT-PCR er oppført i tabell 1.
4.6.Wester" blottanalyse
Cellene ble vasket med 1 × PBS, og totale proteiner ble ekstrahert fra celler ved bruk av RIPA-buffer og 1 prosent NP-40-lysebuffer inneholdende proteasehemmer-cocktailtabletter (Roche, Basel, Sveits). Hver proteinkonsentrasjon ble målt ved å bruke Bio-Rad-proteinanalysen. Like mengder protein ble fraksjonert fra hver prøve gjennom 8-15 prosent SDS-PAGE, og deretter ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, München, Tyskland) via elektroforese. Membranene ble blokkert ved romtemperatur (20-25 grader) i 1 time ved bruk av 5 prosent fettfri tørrmelk og inkubert med primære antistoffer ved 4 grader over natten. Deretter ble disse membranene vasket tre ganger med 1 x Tris-bufret saltvann i 10 min. Spesifikke bånd av proteiner ble målt med et kjemiluminescensavbildningssystem (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Uttrykket av proteiner ble justert med GAPDH. 4.7. Laktatproduksjonsanalyse
Laktatproduksjon ble målt i kulturmediene til SNU620-, SNU620/5FU-, AGS-, Panc-1-, MIA PaCa-2-, LS174T- og RKO-celler. Disse cellene ble inkubert i 1d ved 37 grader, og kulturmediet ble deretter erstattet med fenolrødt medium, etterfulgt av inkubering i 1 time ved 37 grader. Mediet til hver celle ble deretter evaluert ved å bruke et kommersielt laktatfluorometrisk analysesett (BioVision, Milpitas, CA, USA).
4.8. LDHA- og LDHB-aktivitetsanalyser
For å påvise LDHA-aktivitet ble de angitte konsentrasjonene av CA inkubert i 20 minutter i en buffer som inneholdt 2 mM pyruvat, 20 μM NADH og 20 mM HEPES-K pluss (pH7.2). For LDHB-aktivitet ble det brukt en buffer inneholdende 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM NAD pluss og 2 M natrium L-laktat. Kort fortalt ble 10 nanogram av hvert av de rensede rekombinante LDHA- og LDHB-proteinene brukt for in vitro LDHA- og LDHB-aktivitetsanalysene. Ett mikrogram totalt protein fra cellelysater ble brukt for intracellulære LDHA- og LDHB-aktivitetsanalyser som en enzymkilde. Fluorescens av NADH ved en eksitasjonsbølgelengde på 340 nm og en emisjonsbølgelengde på 460 nm ble påvist ved bruk av et spektrofluorometer (Spectramax M2; Molecular Devices), som tidligere beskrevet [80]. LDHA-aktivitet ble målt ved den reduserte mengden NADH, mens LDHIB-aktivitet ble evaluert ved å måle mengden NADH konvertert fra NAD pluss.
4.9. Interaksjon mellom protein og små molekyler
Samspillet mellom protein og små molekyler ble spådd ved hjelp av Pyrex-programmet. LDHA (PDB ID:1l10)-molekylene og 2D-strukturene til CA og EGCG oppnådd fra NCBI PubChem-forbindelsesdatabasen ble brukt i Pyrex. IDen til CA var 9064 og den til EGCG var 65064. Den relative fordelingen av overflateladningen ble vist med det sure området i rødt, det basiske området i blått og det nøytrale området i hvitt. Hydrogenbindinger i LDHA-komplekser med henholdsvis CA eller EGCG ble vist som svarte stiplede linjer. Sekvenser ble hentet fra UniProt (https://www.uniprot.org, åpnet 9. november 2020) med tilgangsnummer P00338(LDHA).
4.10. Transfeksjon av kort hårnål-RNA (shRNA)
Den pLKO.1 mock-vektor og shRNA-målrettende LDHA-vektoren ble brukt, som tidligere beskrevet [50]. Celler ble sådd på seks-brønns plater (2 × 10 grader celler/brønn) og inkubert over natten. SNU620/5FU-celler ble transfektert ved bruk av polyetylenimin (PED) (Polyplus-transfeksjon, llkirch, Frankrike), gen og PEI-forholdet er 1:3. Deretter ble transfekterte celler behandlet med 1 ug/ml puromycin i 1 uke. Kontrollcellelinjen ble generert etter infeksjon med et kryptert plasmid.
4.11.LDHA-overuttrykk
Plasmidet pDEST27-LDHA ble konstruert ved subkloning av LDHA cDNA (kjøpt fra Korea Human Gene Bank, Daejeon, Korea) inn i pDEST27(Invitrogen) vektorer. To sett med subklonet for LDHA ble utført. For rekonstruksjon av LDHA ble SNU620/5FU-shLDHA-cellene transfektert med pDEST27-LDHA og tomt pDEST27-plasmid. Kort fortalt ble cellene dyrket opp til 70 prosent konfluens. Deretter ble cellene behandlet med en blanding inkludert 3 ug DNA og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i 48 timer. Etter inkubering ble cellene selektert med 200 ug/ml G418 i 1 uke. Deretter, for å bekrefte effekten av transfeksjon, utførte vi Western blot-analysen.
4.12. Apoptoseanalyse
Apoptotiske celler ble påvist ved bruk av Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble celler sådd i seks-brønns plater (2×10 grader celler/brønn) og behandlet med indikerte konsentrasjoner av CA og 5FU i 2 dager. Etter 2 dagers behandlinger ble cellen vasket med 1 x PBS. Cellene ble suspendert i 500 μL bindingsbuffer og behandlet med 5 μL annexin V-FITC og 5 μL propidiumjodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), etterfulgt av inkubering i 15 minutter ved romtemperatur i mørket. Fluorescensintensiteter ble undersøkt ved å bruke en BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).
4.13. Mitokondriell reaktiv oksygenart (ROS) deteksjonsanalyse
Mitokondriell ROS-produksjon ble oppdaget ved hjelp av en MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Thermo Fisher Scientific). Cellene ble sådd på seks-brønns plater (2× 10 graders celler/brønn) og Mito-TEMPO (20 μM; Sigma-Aldrich） ble forbehandlet i 1 time før medikamentell behandling. Cellene ble resuspendert i 1 mL 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), hvoretter 5 μM MitoSOX ble tilsatt. Cellene ble deretter inkubert i 10 minutter ved 37 grader. Fluorescensintensiteten ble analysert ved å bruke en BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Fluorescensbilde ble oppdaget med fluorescensmikroskop (forstørrelse, 100×) (Axioimager M1 mikroskop, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
4.14.DAPI-farging av kjerne
SNU620/5FU ble sådd i en 24-brønnplate (5 × 104 celler/brønn) og behandlet med de angitte konsentrasjonene av CA og 5FU i 48 timer. Etter vask med 1× PBS ble cellene resuspendert i 1-mL 1× PBS. Cellene ble deretter farget med 4 ug/ml DAPI i 30 minutter ved romtemperatur og undersøkt under et fluorescensmikroskop (forstørrelse, 200×) (Carl Zeiss).
4.15. Statistisk analyse
Resultatene av cellelevedyktighet, laktatproduksjon, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB-aktiviteter, apoptose og mitokondriell ROS ble indikert i forhold til kontrollverdier og uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Forskjeller over gjennomsnittsverdien for hver gruppe ble analysert ved Students t-test, mens forskjeller mellom grupper ble analysert ved enveis variansanalyse med Tukeys post hoc-test ved bruk av GraphPad Prism (Version5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
5. Konklusjoner
Til sammen har resistente magekreft SNU620/5FU-celler glykolytiske fenotyper, inkludert forhøyet laktatproduksjon og høyere LDHA-ekspresjon enn de i foreldrenes SNU620-celler. Begrensning av glykolyse med CA, som en LDHA-spesifikk hemmer, sensibiliserer SNU620/5FU-celler til 5FU. I tillegg økte samtidig behandling med CA og 5FU mitokondriell ROS og apoptotisk celledød i 5FU-resistente celler. Våre funn tyder på at CA kan være en lovende kandidat for utvikling av et hjelpestoff som reduserer resistens mot 5FU-basert kjemoterapi ved å begrense LDHA-aktiviteten.
Tilleggsmateriell: Følgende er tilgjengelig online på https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, figur S1: Effekt av 5FU på levedyktigheten til SNU620/5FU-clll, figur S2: Veksten av SNU620 og SNU620/5FU-celler målt ved celletelling, Figur S3: Laktatproduksjonsnivåer av SNU620 og SNU620/5FU-celler, Figur S4: Uttrykk av PDK-isotyper i SNU620- og SNU620/5FU-celler, Figur S5: Effekt av oksamat på levedyktigheten til SNU620 og SNU620/5FU-celler, Figur S6: Effekter av EGCG på LDHA- og LDHB-aktiviteter, Figur S7: Effekter av katekin (CA) på ekspresjonsnivåene til p-PDHA1-, PDHA1- og PDKs-proteiner, Figur S8:Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) analyse av LDHA og CA, Figur S9: LDHA-ekspresjon i SNU620/5FU-celler transfektert med shLDHA, Figur S10: Måling av glykolytiske fenotyper og cellelevedyktighet i forskjellige kreftceller, Figur S11: Rådata fra Western blot-analyse.
Denne artikkelen er hentet fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
