Tetrahymena Thermophila ble brukt som eksperimentelt materiale

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

I dette eksperimentet ble Tetrahymena thermophila brukt som eksperimentelt materiale. T. thermophila er et frittlevende ciliat som finnes mye i globale akvatiske økosystemer og ligner på metazoanceller i struktur og funksjonell kompleksitetl5. Oppdagelsen av ribozynnel6 og telomerasel7 i Tetrahymena ga et stort løft i forskning på antialdringsmekanismer, som ble belønnet med to Nobelpriser18. På grunn av sin korte vekstsyklus, enkle kultur og klare genetiske bakgrunn, T. termofil kan gi dobbel forskning in vivo og in vitro i ett eksperimentelt design. T. thermophila har vært vellykket brukt i medikamentscreening og farmakologiske mekanismer20. Enda viktigere, informasjon om den molekylære utviklingen av T. thermophila glutationperoksidase-familien har blitt avdekket9-2. Informasjonsprofilen til T.cistanche genghis khanthermophila GPX-gener kan fås fra Tetrahymena Functional Genomics Database(TetraFGD)(http://tfgd.ihb.ac.cn/) og TGD(http://ww. ciliate.org)22.Ti av de tolv antatte GPX har blitt identifisert som fosfolipidhydroperoksidglutationperoksidase (PHGPx) i Tetrahymena-genomets komparative database. PHP, en selenavhengig GPX, kan spesifikt redusere fosfolipidhydroperoksid for å beskytte lecitinliposomer og biofilmer mot oksidativ skade23.PHGPxin T. thermophila har en gjennomsnittlig molekylmasse på omtrent 21,7 kDa22, som er lik molekylmassen (20-22 kDa) av PHGPx-monomerproteinet beskrevet i pattedyr24. Dessuten viste et stort antall rapporter at GPX-uttrykket til Tthermophila var kvantitativt forskjellig og avhengig av stresskilden (oksidant, apoptoseinduser eller metall)2122 og eksponeringstid20-24

Klikk her for å vite mer

Ved å sammenligne effekten av det vandige ekstraktet og hovedmonomerene til G. lucidum på vekstkurven og den maksimale tettheten til T. thermophila, oppnådde denne studien det beste antialdringsekstraktet fra G. lucidum. Antialdringsmekanismen til G. lucidum, spesielt bestemmelsen av virkningstypen til GPX-familien, ble undersøkt på molekylært, cellulært og individuelt nivå. Resultatene av denne studien forventes å bidra til klinisk anvendelse av G. lucidum-produkter.

Materialer og metoder

Ganoderma lucidum vandig ekstrakt og monomerer. Med henvisning til rapporten om Cuong ble 25,20 g tørket G. lucidum (Changbai Mountain Senbao Specialty Store, Jilin) ​​malt og ekstrahert i 1000 ml ddHO. Det vandige ekstraktet ble oppsamlet ved sentrifugering, konsentrert til 100 ml ved vakuumtørking og lagret ved -20 grad inntil bruk.

G. lucidum polysakkarid, Ganoderic Acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol ble kjøpt fra Chengdu Must Biotechnology Co.,Ltd. Disse tre standardene ble oppløst i metanol i henhold til den ensartede utformingen og tilsatt til SPP-medium. Cellekultur og medikamentell behandling. Tetrahymenathermophila (SB210) ble levert av Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, IPR Kina. T. thermophila ble dyrket i en 28 graders inkubator. SPP-mediet inneholdt 2 prosent (vekt/volum) proteosepepton, 0,1 prosent gjærekstrakt (Oxoid), 0,2 prosent glukose og 0,003 prosent sekvestren. I henhold til den ensartede utformingen (tilleggstabeller S1 og S2), G. lucidum vandig ekstrakt,G. lucidum polysakkarid, ganodersyre A, ganoderal A og G. lucidum ergosterol ble tilsatt til kulturmediet. Kontrollgruppen ble erstattet med samme volum dobbeltdestillert vann, med 3 paralelle prøver i hver gruppe. Etter å ha gått inn i den logaritmiske fasen, ble prøver tatt hver 2. time frem til nedgangsfasen. Tettheten til T. thermophila ble talt ved hjelp av blodcelleteller, og forholdet mellom tettheten til T. thermophila og tiden ble tegnet.

Transkripsjonsanalyse. Eksperimentet ble utført med en 24-brønnplate, og hver brønn var bygd opp av 900 μL SPP. I forsøksgruppen ble 100 μL 200 mg/ml G. lucidum vandig ekstrakt tilsatt. Kontrollgruppen ble behandlet med 100 μL ddH O i stedet. Tre parallelle prøver ble satt i hver gruppe.cistanche levetidsforlengelseKontrollgruppen og den eksperimentelle gruppen var begge i logaritmisk fase (20 timer), og nedgangsfasen (27 timer) ble samlet inn for den transkriptomiske analysen. Hver gruppe ble biologisk duplisert, og alle prøver ble utsatt for en heltranskripsjonsmikroarray-analyse (Biomarker Technologies, Beijing, Kina). Genekspresjonsprofilen ble oppdaget av en Affymetrix 3'IVT Expression Array For å redusere effekten av ekspresjonen av verdigener, ble RPKM Større enn eller lik 5 og FC(Fold Change) Større enn eller lik 2 brukt som kriteriene for å screene differensielt uttrykte gener (DEGs) KOBAS ble brukt til å realisere baneanalysen til GeneOntology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Anrikningsveien ble bestemt av den korrigerte P-adj-verdien Mindre enn eller lik 0,05. Transkriptomresultatene ble verifisert ved bruk av kvantitativ revers transkripsjons-PCR(RT-qPCR)(metode se tilleggsfil). Deretter ble protein-protein-interaksjonsnettverket (PPI) etablert basert på STRING-databasen, og det sentrale genet ble screenet ved å bruke CytoHubla for å identifisere den sentrale noden i Cytoscape-programvaren.

Sølvfarging og observasjon av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Fremgangsmåten for sølvfarging var i henhold til Foissners metode26. thermophila ble observert under et oljemikroskop. Ultrastrukturen til T. thermophila ble observert av TEM. Cellene behandlet med G. lucidum vandig ekstrakt og kontrollgruppen ble samlet ved sentrifugering ved 600 xg i 2 minutter. Celler ble prefiksert i 2,5 prosent glutaraldehyd og holdt ved 4 grader i 8 timer. Prøvene ble vasket med PBS (pH 7,5) tre ganger, sentrifugert ved 3000 xg i 5 minutter og deretter fiksert med 1 prosent osmiumtetraoksid (4 timer). Deretter ble dehydrering utført ved bruk av gradient aceton på 15 prosent til 100 prosent. Deretter ble cellene innebygd i Embed 812(TAAB) lavviskositetsharpiks. Etter herding ble ultratynne seksjoner (60-80 nm) kuttet av en ultratynn skjærer. Ultrastrukturen ble observert med transmisjonselektronmikroskop (JEOL JEM-1010, Japan).

Bestemmelse av celleskade. Intracellulær lROS ble påvist av den sensitive fluorescerende sonden 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat(DCFH-DA)27. Aktiviteten til malondialdehyd (MDA) ble bestemt av kommersielle sett levert av Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, Kina). Metoden for å bestemme evnen til å eliminere hydroksylradikaler (·OH) var som beskrevet av Takemura28. Evnen til det vandige ekstraktet fra G. lucidum til å eliminere OH-frie radikaler ble uttrykt som den optiske tettheten til den eksperimentelle gruppen minus den optiske tettheten til kontrollgruppen.

Cistanche kan anti-aldring

PHGPx-aktivitet. Nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH)/NADP*-forhold og glutation/glutationdisulfid (GSH/GSSG)-forhold ble bestemt ved å bruke NADP*/NADPH kvantifiseringssett (S0179, Beyotime),GSH/GSSG-analysesett (S0053, Beyotime). analyser ble utført i henhold til produsentens protokoll.

Resultater

Effektene av G. lucidum vandig ekstrakt og G. lucidum monomerer på veksten av T. ther-mochila. Som tidligere studier7, G. lucidum polysakkarid var hovedkomponenten i G. lucidum vandig ekstrakt i dette eksperimentet i henhold til spektrofotometeridentifikasjon (tilleggsfig. S1). De aktive stoffene i G. lucidum vandig ekstrakt ble også analysert ved GC-MS. Det totale ionediagrammet for det vandige ekstraktet fra G. lucidum viste at ll komponenter eksisterte i det vandige ekstraktet (tilleggsfig. S2). Blant forbindelsene av det vandige ekstraktet G. lucidum (tilleggstabeller S3 og S4), G. lucidum acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol ble valgt i henhold til deres retensjonstid og samsvarsgrad.

For å sammenligne effekten av G. lucidum vandig ekstrakt og disse hovedmonomerene på veksten av T. thermophila, ble det vandige G. lucidum-ekstraktet og G. lucidum monomers-løsningen tilsatt til kulturmediet til T. thermophila. Resultatene ble vist i figur 1. Den maksimale tettheten til kontrollgruppen var 6×104 celler/ml etter 24 timer. Celletettheten til den vandige ekstraktgruppen G. lucidum fra 12 til 20 timer var nesten den samme som for kontrollgruppen, men fra 20 til 25 timer var den signifikant høyere enn celletettheten til kontrollgruppen.cistanche nzSamtidig ble den logaritmiske fasen forlenget med 1 time, maksimal tetthet var 1,15×105 celler/ml. Selv om den maksimale tettheten til G. lucidum-polysakkaridgruppen var høyere enn for kontrollgruppen med 9,7×104 celler/ml, var den lavere enn G.lucidum-vannekstraktgruppen. Den maksimale tettheten av G. lucidum acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol oversteg ikke den for kontrollgruppen, noe som viste at alkoholoppløste stoffer av disse monomerene ikke bidro til veksten av T. thermophila. Det kan konkluderes med at det vandige ekstraktet fra G. lucidum som inneholder en rekke aktive stoffer kan fremme veksten av T. thermophila mer enn dets monomerer.

Antialdringseffekt av G. lucidum vandig ekstrakt. Med økende dyrkingstid var lysintensiteten til ROS i nedgangsfasen (fig. 2b) høyere enn i den logaritmiske fasen (fig. 2a). Etter tilsetning av det vandige G. lucidum-ekstraktet, selv om fluorescensintensiteten til nedgangsfasen (fig. 2d) fortsatt var forbedret sammenlignet med den for den logaritmiske fasen (fig. 2c), var den betydelig lavere enn kontrollgruppen. MDA-innholdet i kontrollgruppen var også høyere i nedgangsfasen enn i den logaritmiske fasen (Fig.2e). I mellomtiden var renseevnen til OH i nedgangsfasen lavere enn i den logaritmiske fasen (fig. 2e). Balansen mellom oksidasjon og reduksjon gikk tapt og kroppen eldes. Etter tilsetning av det vandige G. lucidum-ekstraktet var MDA-innholdet lavere enn det i kontrollgruppen (venstre kolonne i fig. 2e), og mengden OH som ble fjernet av celler i logaritmisk fase og nedgangsfase var høyere enn i kontrollgruppe (høyre kolonne i fig. 2e). Veksten av T[ thermophila kan sammenlignes med aldringsprosessen til flercellede organismer gjennom dens cellulære skade. Etter hvert som ROS og MDA akkumulerte, ble veksten hemmet og tettheten av T. thermophila ble redusert. Tilsetning av G. lucidum vandig ekstrakt kan opprettholde redoksbalansen i T. thermophila og oppnå antialdringseffekter.

Analyse av differensielt uttrykte gener og verifisering ved RT-qPCR. Sammenlignet med kontrollgruppen endret uttrykket av 11 519 gener i den logaritmiske fasen av T. thermophila seg betydelig etter tilsetning av G. lucidum vandig ekstrakt til SPP. Blant dem ble 6201 gener oppregulert og 5318 gener ble nedregulert.cistanche penis størrelseUttrykket av 8772 gener endret seg betydelig i nedgangsfasen, blant annet ble 4721 gener oppregulert og 4051 gener ble nedregulert. I tidligere studier i laboratoriet vårt har

anti-aldringseffekten av G.lucidum på Stylonychia ble reflektert i antioksidantindeksen, så 10 gener (tilleggstabell S5) relatert til antioksidanter ble tilfeldig valgt blant DEG-ene, og nøyaktigheten av RNA-seq-dataene ble verifisert av RT- qPCR. Ekspresjonsmønstrene til disse 10 genene i den logaritmiske fasen og nedgangsfasen var i samsvar med trenden til RNA-seq-dataene (Supplerende Fig. S3). Resultatet indikerte at RNA-seq-dataene var pålitelige og kunne brukes til etterfølgende analyse.

GO-anriking og KEGG-baneanalyser. DEG-ene i den logaritmiske fasen var involvert i 14 biologiske prosesser (BP) med 6 typer molekylære funksjoner (MF) og de eksisterte i alle cellekomponenter (CC) (fig. 3a). DEG-ene i nedgangsfasen var involvert i 12 BP med 4 typer MF og de eksisterte i 12 CC Den mest involverte BP i de to fasene var den metabolske prosessen, MF var bindende og CC var membran. Blant den metabolske prosessen, binding og membran, utgjorde de oppregulerte genene 70 prosent i den logaritmiske fasen (fig. 3b) og 75 prosent i nedgangsfasen (fig. 3c). Disse resultatene viser at det vandige ekstraktet fra G. lucidum kan fremme opprettholdelsen av cellemembranintegriteten i begge faser.

KEGG-baneanrikningsanalyse ble utført for å analysere DEG-ene mellom de to fasene ytterligere. I den logaritmiske fasen var 94 veier konsentrert, hvorav 68 prosent av de totale genene var involvert i metabolisme. I nedgangsfasen ble 91 veier beriket, hvorav metabolismen fortsatt var den største veien, og sto for 68 prosent. De 20 beste veiene i den logaritmiske fasen (fig. 3d) og nedgangsfasen (fig. 3e) ble brukt til å tegne et boblediagram og viste at uavhengig av betydningen eller antallet gener involvert, var effekten av G.cistanche pulverlucidum vandig ekstrakt primært fokusert på glutationmetabolismeveien. I den logaritmiske fasen ble 38 differensielt uttrykte gener beriket i denne veien, som utgjør 45 prosent. I nedgangsfasen ble 43 differensielt uttrykte gener beriket i denne veien, og utgjør 50 prosent.

Protein-protein interaksjon (PPI) nettverk av DEGs. Belysningen av DEG-er i glutationmetabolismeveien og innsikt i deres interaksjoner med andre proteiner vil bidra til å utforske den potensielle reguleringsmekanismen til G. lucidum vandig ekstrakt ytterligere. Både den logaritmiske fasen (fig.4a) og nedgangsfasen (fig.4b) hadde de viktigste effektene på GPX1, GPX2, GPX7 og GPX11. Gjennom spørringen av TetraFGD-databasen tilhørte disse GPX-enzymene PHGPx (tilleggstabell S6). Derfor spiller antioksidantenzymer, spesielt PHGPx, en viktig rolle i å fremme veksten av T. thermophila via indusering av G. lucidum vandig ekstrakt.

GPS-aktivitet og funksjonsverifisering. Aktiviteten til PHGPx refererer til hastigheten for NADPH-absorpsjonsreduksjon2". NADPH/NADP*-verdien i nedgangsfasen til kontrollgruppen var lavere enn den i den logaritmiske fasen (fig. 5a). Resultatet antydet at aktiviteten til PHGPx redusert med økningen i dyrkingstiden. Etter tilsetning av G. lucidum vandig ekstrakt, var NADPH/NADP pluss-verdien i nedgangsfasen fortsatt lavere enn i den logaritmiske fasen, men høyere enn begge fasene i kontrollgruppen. Dette resultatet indikerte at det vandige ekstraktet fra G.lucidum kunne fremme aktiviteten til PHGPx.

PHP kan spesifikt katalysere reduksjonen av fosfolipidhydroperoksid ved redusert glutation (GSH), for å omdanne giftig lipidperoksid (PL-PUFA-OOH) til ikke-toksiske flerumettede fettsyrer (PL-PUFA-OH) effektivt30. Endringen av GSH/GSSH-forholdet kan gjenspeile endringen av PL-PUFA-OOH og PL-PUFA-OH På grunn av reduksjonen i PHGPx-aktivitet (fig. 5a), ble forholdet mellom GSH/GSSH i kontrollgruppen også redusert med økningen av kulturtiden (fig. 5b). Etter tilsetning av G. lucidum vandig ekstrakt ble imidlertid forholdet mellom GSH/GSSH økt i logaritmisk fase og nedgangsfase. Den intracellulære toksiske PL-PUFA-OOH i forsøksgruppen ble transformert til ikke-toksisk PL-PUFA-OH, som var mer enn kontrollgruppen. Observasjon av mikroskopisk morfologi og ultrastruktur. Den beskyttende effekten av G. Luci-dum vandig ekstrakt på membranen ble visualisert ved ammoniakksølvfarging og TEM. Ved å sammenligne den logaritmiske fasen til kontrollgruppen (fig. 6a) og nedgangsfasen til kontrollgruppen (fig. 6c), ble det funnet at cellemorfologien til T. thermophila ble alvorlig deformert med utvidelsen av dyrkingstiden, og kjernen var uskarp, noe som indikerer at cellene så ut til å være i en aldrende tilstand. I G. lucidum vandig ekstraktgruppe var imidlertid morfologien og integriteten til cellene godt beskyttet i den logaritmiske fasen (fig. 6e) og nedgangsfasen (fig. 6g). Ultrastrukturelle endringer i cellene ble observert ved TEM. Ryggen og konturen til mitokondrie var uskarpe i nedgangsfasen (fig. 6d) sammenlignet med den logaritmiske fasen (fig. 6b) i kontrollgruppen. Mitokondrieforfall økte med utvidelsen av kulturtiden. Tilsetningen av G. lucidum vandig ekstrakt forbedret morfologien til mitokondriene i logaritmisk fase (fig. 6f) og nedgangsfase (fig. 6h). G. lucidum vandig ekstrakt garanterte funksjonen til mitokondrier, som er nært knyttet til integriteten til membranen. Det skal bemerkes at i den logaritmiske fasen viste mitokondriene i forsøksgruppen morfologiske endringer (fig. 6f, h), men integriteten til membranen ble ikke påvirket.

Diskusjon

Anvendelsen av G.lucidum-ekstrakter har en lang historie både innen tradisjonell kinesisk medisin og Øst-Asia. Et stort antall studier har vist deres effekt. Tidligere rapporter fant at G. lucidum vandig ekstrakt inneholdt ikke bare G. lucidum polysakkarider, men også Glucidum triterpenoider. I følge tidligere rapporter er Ganoderma-syre, Ganoderma-aldehyd og Ganoderma ergosterol hovedingrediensene i G. lucidum triterpene 3. De virker med forskjellige reparasjonsfunksjoner for celle(tabell 1). Ganoderma lucidum vandig ekstrakt inneholder en rekke aktive stoffer, som integrerer funksjonene til de andre fire aktive stoffene, som ikke bare kan motstå oksidasjon, men også opprettholde membranintegriteten. I denne studien,

vekstfremmende av G. lucidum vandige ekstrakt på T. thermophila bekreftet dette inklusjonsforholdet. Gjennom analyse av G. lucidum vandig ekstrakt ved total-ion-strømningskromatografi (Supplerende Fig. S2), kunne man finne at oppløsningstiden for ulike aktive stoffer var forskjellig. Så det vandige ekstraktet fra G. lucidum blir et komplekst organisk løsningsmiddel med forlengelse av koketiden. Vi tror at de aktive stoffene i det vandige ekstraktet G.lucidum kan virke til forskjellige tider, noe som resulterer i en synergi. Dette bør være en videre utredning i fremtiden.

Analysen av T. thermophila transkriptom utforsket effekten av G. lucidum vandig ekstrakt på genuttrykk under vekst. Etter behandling med G. lucidum vandig ekstrakt, viste PHGPx en nøkkelinnflytelse i celletetthet og generasjonstid. Dette resultatet bekreftet at det vandige G.lucidum-ekstraktet virket på den selenavhengige typen GPX-familie. PHP er et multifunksjonelt selenoprotein som er vidt distribuert i kroppen som ikke bare kan delta i antioksidantreaksjoner, men også direkte redusere lipidene i membranen for å beskytte integriteten til membransystemet40. Sammenlignet med andre GPX-er har PHGPx et mindre volum og større hydrofobitet. Mange rapporter har vist at PHGPx-overuttrykk i celler kan motstå cellerespons på endogen (f.eks. aldring) fl og eksogene (f.eks. miljømessige) peroksidasjonsskader 2-45.PHP er det eneste enzymet som direkte kan redusere PL-PUFA- OOH av membranen inn i de tilsvarende hydroksylforbindelsene, og muliggjør dermed terminering av peroksidasjon og beskytter den biologiske membranen mot peroksidasjonsskader4647. Økningen i innholdet av PL-PUFA-OOH var årsaken til skaden på cellemembranen i kontrollgruppen under nedgangsfasen, som ble en ond sirkel og akselererte cellealdring. I denne studien ble innholdet av ROS og MDA (Fig.2) av T.thermophila i kontrollgruppen økte med økningen i dyrkingstid. Membranen viste seg å være alvorlig deformasjon i nedgangsfasen gjennom den morfologiske observasjonen. Når G. lucidun vandig ekstrakt ble tilsatt, ble imidlertid ekspresjonen av PHGPx oppregulert. Dermed ble PL-PUFA-OOH på membranen transformert til ikke-toksisk PL-PUFA-OH, og stabiliteten til membranstrukturen er forbedret både i logaritmisk fase og nedgangsfase. I henhold til observasjonen av membranen ved ammoniakksølvfarging og TEM, kunne det konkluderes med at det vandige ekstraktet fra G. lucidum penetrerte cellemembranen under vekstprosessen. Denne reparasjonseffekten på cellemembranen kan få de aktive stoffene i det vandige ekstraktet fra G. lucidum til å gå inn i cytoplasmaet og beskytte membranstrukturen til kjernen og mitokondriene for å fremme metabolismen av T. thermophila og oppnå antialdringseffekter. Som resultatene av lKEGG-berikelsen viser, er et stort antall differensielle gener konsentrert i de metabolske veiene. Disse resultatene indikerte at det vandige ekstraktet fra G. lucidum var gunstig for metabolismen av glutation og eliminering av giftige peroksider produsert av cellealdring.

Generelt fremmet det vandige ekstraktet fra G. lucidum ekspresjonen av det selenavhengige enzymet PHGPx i GPX-familien. Forbedringen av PHGPx-aktivitet kunne ikke bare redusere den oksidative stressresponsen in vivo, men også spesifikt og effektivt redusere lipidavsetningen til den biologiske membranen og opprettholde integriteten til membranen (fig. 7). Følgelig kommer de aktive stoffene i det vandige ekstraktet fra G. lucidum inn i cellene gjennom den intakte membranen og fremmer deres metabolisme. Dette skapte en god syklus for å oppnå effekten av anti-aldring.

Denne artikkelen er hentet fra Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z