Antialdringspotensialet til Neohesperidin og dets synergistiske effekter del 2
May 27, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
2.4. In vitro antioksidantaktivitet av Neohesperidin var relativt svak
Mange metoder er tilgjengelige for å måle antioksidantkapasiteten in vitro, og de fleste forskere bruker en eller flere analyser siden hver metode måler forskjellige antioksidantegenskaper til forbindelsen [32]. I denne studien brukte vi tre metoder for å bestemme antioksidantkapasitet inkludert DPPH-, ABTS- og FRAP-analyser. Antioksidantpotens sammensatt indeks (APCI) ble definert for å beskrive og evaluere den totale in vitro antioksidantkapasiteten til de testede forbindelsene og deres kombinasjoner. De lineære regresjonsligningene for de tre analysene er oppført i tabell 1. Og alle relaterte data ble presentert i tabell 2. I mellomtiden ble APCI plottet i figur 4B. Fra disse resultatene kunne vi se at neohesperidin hadde relativt svak in vitro antioksidantkapasitet; dette antydet at CLS-forlengelsesfunksjonen til neohesperidin ikke var avhengig av dets in vitro antioksidantaktivitet. Imidlertid, med relativt høy in vitro antioksidantaktivitet, utvidet CD BCD CLS av gjær BY4742. Totalt sett kan vi ikke forutsi en forbindelses CLS-utvidende kapasitet bare basert på dens antioksidantaktivitet.
A: naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin, the concentration of A, B, Cand Dis luM. APCI=>(hver prøveverdi/den største prøveverdien i den metoden)/antall metoder. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM(n {{0}}) og sammenlignet med enveis ANOVAs Sidaks multiple sammenligningstest ved p < 0,05="" av="" graphpad="" prism="" 7.00.="" ulike="" bokstaver="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" etter="" data="" indikerer="" verdier="" i="" samme="" kolonne="" med="" signifikante="">
2.5. Neohesperidin kunne ikke bremse variasjonen av ekstracellulær forsuring av gjær BY4742
Viktige parametere inkluderer sammensetningen av vekstmediet samt pH-verdien. Sammensetningen av vekstmediet og pH-verdien har vist seg å ha stor innvirkning på CLS av S.cerevisiae[33]. Effektene av pH på CLS av spirende gjær ble undersøkt av tidligere studier, og resultatene peker på en mekanisme for eddiksyretoksisitet relatert til induksjon av vekstsignalveier og oksidativt stress i gjær [34]. For å vite effekten av de fire flavonoidforbindelsene på variasjonen av ekstracellulær forsuring av gjærkulturer, oppdaget vi pH-verdiene hvert femte minutt ved hjelp av et pH-meter.Cistanche Extract Anti RadiationI figur 5, bremset 10uM naringin åpenbart variasjonen av ekstracellulær forsuring av spirende gjær BY4742 ved forskjellige aldringstilstander, mens de tre andre flavonoidforbindelsene ikke påvirket den signifikant ved samme konsentrasjon sammenlignet med kontrollgrupper.
Figur 5. Variasjon av kulturmediene etter den spirende gjæren BY4742 behandlet med de fire flavonoidforbindelsene ved 10 μM. Eksperimentet ble utført i det minste i tre eksemplarer. ∶ Naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin.
3. Diskusjon
Tidligere studier hadde rapportert at neohesperidin viste forskjellige antialdringsassosierte funksjoner, som den nevrobeskyttende effekten [15], ROS-fjernende og antiinflammatoriske aktiviteter [35], demping av reduksjonen i mitokondriell membranpotensial og økningen av caspase{ {5}} aktivitet fremkalt av H2O2 [16], og cellulær apoptose-induserende aktivitet [21]. Alle disse funksjonene la et godt grunnlag for resultatet at neohesperidin økte CLS for spirende gjær BY4742 her. Det er overraskende at neohesperidin utvidet CLS signifikant bare ved den laveste konsentrasjonen som ble testet. Rapporten til Craker, et al. viste også en lavere konsentrasjon av auxin (10-6 IAA) fremmer protonekstrudering. Protonekstrudering under høy konsentrasjon av auxin (10-4 IAA) hemmes av auxin-indusert etylen [36].cistanche herbaDen ROS-fjernende aktiviteten til neohesperidin ble bekreftet i vår forskning. In vitro antioksidantkapasiteten til neohesperidin var relativt svak, noe som forklarte hvorfor CLS-ekstensjonsfunksjonen til neohesperidin ikke var avhengig av dets in vitro antioksidantaktivitet. Imidlertid hadde kombinasjonene CD og BCD høy in vitro antioksidantaktivitet og økte CLS av gjær (Figur 3B). Den svake korrelasjonen mellom ROS og antioksidantaktivitet kan være forårsaket av metoden vi brukte for å analysere antioksidantaktiviteten. Antioksidantaktivitetsmetoden forsøkte å reagere med en dobbeltbinding ved C2-C3 og/eller en hydroksylgruppe ved C3 på C-ringen til flayonoid. I Areias et al. resultatene tydet sterkt på at den høyere antioksidantaktiviteten til flavonoidene ikke er korrelert med tilstedeværelsen av en dobbeltbinding ved C 2-C3 og/eller en hydroksylgruppe ved C 3 på C-ringen, men snarere kan avhenge av kapasitet til å hemme produksjonen av reaktive oksygenarter til å samhandle hydrofobt med membraner [37]. Samtidig har et stort antall studier vist at enkelte antioksidanter har som funksjon å forlenge levetiden, men deres spesifikke virkningsmekanismer er komplekse. Bare noen antioksidanter har vist seg å ha anti-aldringseffekter relatert til direkte frie radikaler og ROS-clearance. Men de livsforlengende effektene av andre antioksidanter på modellorganismer var ikke begrenset til direkte antioksidantfunksjon, men inkluderer også regulering av stressrelatert genuttrykk og induksjon av toksiske stimulerende effekter [38]. Derfor er det umulig å forutsi evnen til et stoff til å utvide CLS av gjær basert på dets antioksidantaktivitet. Selv om vi ikke testet resultatet i andre stammer, ga det informasjon for andre forskere og forskere for å validere resultatet i andre stammer og modellorganismer.
Cistanche kan anti-aldring
Mange cellulære prosesser og ytre faktorer påvirker gjærens kronologiske levetid negativt, inkludert middels forsuring og oksidativt stress [39]. En av de tidlige endringene som skjer i gjærceller dyrket i medier som inneholder 2 prosent glukose (dekstrose) er produksjonen av eddiksyre og surgjøring av mediet, som har vist seg å påvirke kronologisk aldring [38]. Bufring av mediet til pH 6-7 forhindrer surgjøring og øker den kronologiske levetiden [10,39-41]. I tillegg kan eddiksyre brukes av Saccharomyces cerevisiae for vekst og metabolisme til tross for dens potensielle toksisitet [42]. 10 uM neohesperidin, hesperidin og hesperetin opprettholdt variasjonstrenden for ekstracellulære pH-verdier sammenlignet med kontroll (figur 5). Imidlertid bremset 10 uM naringin tydelig variasjonen av ekstracellulær forsuring (figur 5). Ved denne konsentrasjonen ble CLS av gjær BY4742 behandlet med neohesperidin, hesperidin og hesperetin var nesten det samme som kontrollgruppen.
Økt ROS-rensing har markerte effekter på CLS i gjær, men årsaken er fortsatt et uløst problem [33]. Aldring og relaterte sykdommer er konsekvensen av frie radikaler-mediert skade på cellulære makromolekyler og deres manglende evne til å motvirke endogene antioksidantforsvarsmekanismer [43]. Data har imidlertid indikert at ROS også kan spille en positiv rolle i å indusere stressresponsgener (hormesis) [43-46].
Nyere funn tyder dessuten på at også typen ROS og tidspunktet de oppstår er viktige for levetidsforlengelse hos S.cerevisiae [47-49], noe som illustrerer den komplekse rollen til ROS i gjæraldring. Graziano et al. [47] rapporterte at neohesperidin reduserte ROS-generering i humane keratinocytter.cistanche penisvekstNohara, et al. nylig avslørt at nobiletin (en av flavonoidene i sitrus) styrker mitokondriell respirasjon i skjelettmuskulaturen for å fremme sunn aldring mot metabolske utfordringer. ROS-produksjonen ble signifikant undertrykt av nobiletinbehandling på en doseavhengig måte [50]. Figurene 3B og 4A viste at D og CD økte CLS av gjær BY4742 og reduserte det intracellulære ROS-innholdet. Men for ABD og BCD forlenget de CLS mens de økte den intracellulære ROS. Dette resultatet stemte overens med Wus 51]. Så det var ingen sikker positiv eller negativ sammenheng mellom ROS-rensende aktiviteter av forbindelsene og deres effekter på levetid, og dette var også i tråd med den intrikate rollen til ROS i gjæraldring.
I figur 3A var ikke overlevelsesratene for gjær BY4742 under behandling av forskjellige forbindelser og deres kombinasjoner fra dag 2 til dag 20 gradvis avtagende. De presenterer doble topper. Dette kan også finnes i resultatet av Wu et al. (2014). De første dagene var overlevelsestallene relativt høye. Dette kan forklares med nok næringsstoffer og lavt overlevelsestrykk i løpet av denne tiden. Ettersom tiden gikk, dukket dalpunkter opp i svært kort tid ettersom ernæringen ble mindre. Så dukket toppene opp igjen. Dette fenomenet kan tilskrive suksessen til metabolismen av et annet næringsstoff som lindret overlevelsespresset.
Stille al. [36] rapporterte at antioksidantaktiviteten til kombinasjonen antioksidantblanding/forbindelse var mer effektiv enn en enkelt forbindelse. I vårt eksperiment hadde kombinasjonene AB, AC, CD, ABC og BCD en sterkere antioksidantkapasitet enn noe enkelt stoff som tilsvarer dem.cistanche salsa fordelerBasert på våre observasjoner kan det konkluderes med at flavonoidene som er tilstede i en blanding kan interagere, og deres interaksjoner kan påvirke den totale antioksidantkapasiteten til en løsning (Figur 4B). Selv om vi demonstrerte at de fire flavonoidinteraksjonene utløser synergistiske eller antagonistiske effekter for antioksidantkraften, er det andre flavonoidkombinasjoner som krever en mer detaljert studie for bedre å forstå mekanismene involvert i disse interaksjonene. Lutchman et al. [52] hadde rapportert om planteekstrakter som økte gjærens CLS. Og autofagi fremmet av redusert TORC1-signalering er kritisk viktig for en lang CLS [10]. Ved å referere til disse studiene kan vi utforske hvordan forbindelsene utfører sin effekt i fremtidige studier.
4. Materialer og metoder
4.1. Materialer
Villtypestammen S. cerevisiae BY4742(ATCC⑧,201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0) ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Kulturen til gjærreferansestammen ble delt opp i 10 uL og lagret ved -80 grad. Alle L-aminosyrer, gjærnitrogenbase uten aminosyrer (YNB), ammoniumsulfat, pepton, agar og gjærekstrakt, H2DCFDA, 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ),2, 2'-og-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre)(ABTS),1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl(DPPH), dimetylsulfoksid(DMSO), neohesperidin , naringin, hesperidin og hesperetin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Shanghai, Kina). YPDBroth, YPD og andre kjemikalier var fra Solebo Biotech Co., Ltd. (Beijing, Kina). 96-brønnpolystyrenmikroplatene med flat bunn ble kjøpt fra Corning incorporated (Kennebunk, ME, USA).
4.2. Levetid og gjærcelle Grozoth-analyse
Bestemmelsen av kronologisk levetid (CLS) for gjær ble utført i henhold til metoden til Wu et al. [25] med en moderat modifikasjon som følger. Kort fortalt ble gjærcellene tilberedt ved å overføre en strøket stamme fra frosne stamper til YPD-agar(0,5 prosent gjærekstrakt/1 prosent pepton/2 prosent dekstrose/1,4 prosent agar)-plater. Etter inkubering av cellene ved 30 grader i 2 dager, ble en enkelt koloni plukket og inokulert i et 1,{{10}}mL YPD flytende medium (1 prosent gjærekstrakt/2 prosent pepton) /2 prosent dekstrose) i et 10-mL sterilisert sentrifugerør (rundbunn) og dyrket ved 30 grader i 2 dager i en flat inkubator kl. 200. YPD-kulturen på 2-dagen ble fortynnet med autoklavert 18 Qm Milli-Q-kvalitetsvann (1:10) og lagret i kjøleskap ved 4 grader i 2 dager. Etter 2-dagers inkubering ved 4 grader ble 5 μL (≈1×10* celler) av den fortynnede kulturen overført til 993 mikroliter syntetisk definert (SD) medium (tilleggstabell S1, [51]) og opprettholdt ved 30 grader, 200 rpm for hele eksperimentet. Forbindelser i DMSO med flere konsentrasjoner (2,0 μL) ble tilsatt ved den første inokuleringen (0 timer). Hvert eksperiment ble utført minst i tre eksemplarer. Cellekulturer ble inkubert ved 30 grader uten å erstatte aldringsmediet gjennom hele forsøket. Etter 2 dagers dyrking i et aldringsmedium nådde cellene den stasjonære fasen og det første alderspunktet ble deretter tatt. Påfølgende alderspoeng ble tatt hver 2-4 dag. For hvert alderspunkt ble 5,0 μL av den blandede kulturen pipettert inn i hver brønn på en 96-brønn flatbunnet mikroplate. Nittifem mikroliter YPD-medium ble deretter tilsatt til hver brønn. Cellepopulasjonen ble overvåket med en mikroplateleser (Varioskan Flash; Thermo Scientific, Waltham MA, USA) ved å registrere OD660 hvert 10. minutt i 24 timer.
Overlevelsesraten ble beregnet som følger[25]. Der tOD=0.3,2day er tiden da OD-verdien for dag 2 alderspunkt når 0.3 i utvekstkurvene. Det første alderspunktet (dag 2) er definert til å være 100 prosent levedyktighet, og den relative overlevelsesprosenten for hvert påfølgende alderspunkt kan beregnes som følger:
Overlevelsesintegralet (Sl) for hver brønn er definert som arealet under overlevelseskurven (AUC) og kan estimeres med formelen:
hvor dag er alderspunktet, for eksempel dager 2,4,6,8,10,12,14,16,18og20.
4.3. Intracellulære ROS-rensingsevneanalyser
For å kvantifisere nivået av intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) til gjærceller dyrket i et standard SD-medium med/uten de fire forbindelsene, ble metoden beskrevet i Wu et al. [51] hadde blitt referert. Nemlig 2 μL ROS-probe H2DCFDA fra en fersk 5-mM stamløsning i DMSO ble tilsatt i en 1,0 mL gjæraldringskultur (på dag 2) ved 3{{10 }} grad i 1 time. Kulturen ble deretter vasket to ganger i sterilt destillert vann og suspendert i 1,0 ml 50 mM Tris/Cl-buffer (pH 7,5). Tjue mikroliter kloroform og 10 μL 0,1 prosent (w/o) natriumdodecylsulfat (SDS) ble tilsatt, og cellene ble inkubert ved 200 rpm i 30 minutter for å la fargestoffet diffundere. Kulturen ble sentrifugert ved 5000 rpm i 5 minutter, og fluorescensen til supernatanten ble målt ved bruk av en mikroplateleser med eksitasjon ved 480 nm og emisjon ved 520 nm.
4.4.Antioksidantaktivitetsanalyser
I denne studien ble DPPH-, FRAP- og ABTSassays brukt for in vitro antioksidantkapasitetsevaluering. DPPH-analysen ble utført i henhold til metoden beskrevet av Barreca et al. [53]. En alikvot av hver prøve (0,5 mL) ble blandet med 75 uM (3,5 mL) DPPHin-metanol til et sluttvolum på 4,0 mL Etter å ha reagert i 30 min. uten lys ble absorpsjonen av blandingen detektert ved en bølgelengde på 517 nm. Inhiberingsprosenten av radikalfjernende aktivitet var DPPH-verdien. FRAP-analysen ble utført i henhold til Hunger et al. [54] med noen modifikasjoner. En 0,2 mL alikvot av prøven ble blandet med 3,8 mL FRAP-reagens (0,3 mol/L acetatbuffer (pH3,6), 10 mmol/L TPTZ løsning, og 20 mmol/L jern(III)klorid (FeCl3) ble blandet (10:1:1, volumforhold)). Etter 30 minutter ble absorbansen detektert ved en bølgelengde på 593 nm. Og ABTS-analysen fulgte metoden til Mnb et al. [55] med få modifikasjoner. ABTS-radikalkationen (ABTS· pluss) ble generert ved en reaksjon av 176 μL kaliumpersulfatløsning (140 mM) og 10 mL vandig ABTS-løsning (7 mM) under tilstanden uten lys i 12-16 timer. Deretter ble den fortynnet med metanol til en absorpsjonsverdi på 0,7±0,02 enheter ved 734 nm. 0,1 mL prøve ble tilsatt til et 4,9 mL ABTS-reagens.cistanche tubulosa dosering redditAbsorbansen ble målt ved en bølgelengde på 734 nm etter 10 min reaksjon. Alle absorbansverdier ble bestemt ved å bruke UV-VIS spektrofotometer (PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, Waltham, MA, USA) Antioksidantverdier ble beregnet ved standardkurvemetoden og uttrykt som Trolox-ekvivalenter (TE mg/g DW).
4.5. Ekstracellulær pH-deteksjon
Dyrkningsprosessen av gjær i det tidlige stadiet var nesten den samme som metoden beskrevet i delen av "Lifespan and yeast cell growth assay". Den spesifikke operasjonen var som følger. Gjærcellene ble fremstilt ved å overføre gjærstammen fra frosne lager til YPD-agarplater. Etter inkubering av cellene ved 30 grader i 2 dager, ble en enkelt koloni plukket og inokulert i et 1.0-mL YPD flytende medium i et 10-mL sterilisert sentrifugerør og dyrket kl. 30 grader i 2 dager i en flat inkubator kl. 200. YPD-kulturen på 2-dager ble fortynnet med autoklavert 18 mΩ Milli-Qgrade-vann (1∶10) og lagret i kjøleskap ved 4 grader i 2 dager. Etter 2-dagers inkubering ved 4 grader ble 10 μL (~2×104 celler) av den fortynnede kulturen overført til 1986 μL SD-medium og holdt ved 30 grader, 200 rpm i 2/10/20 dager. Ulike forbindelser i DMSO (4,0 μL) ble tilsatt til mediet til en sluttkonsentrasjon på 10 μM ved første inokulering (0 timer). Deretter ble 1 ml av 2/10/20-dagers SD-kultur tilsatt til 19 ml ferskt YPD flytende medium. pH ble testet hvert femte minutt ved hjelp av et pH-meter mens gjæren ble dyrket ved 30 grader C i en shaker ved 200 rpm for hele deteksjonen. Hvert eksperiment ble utført minst i tre eksemplarer.
4.6.Dataanalyse
Rådataene fra mikroplateleseren ble eksportert til Microsoft Excel 2007 (Redmond, WA, USA). Fra vekstkurvene kan gjærens levedyktighet fås ifølge en tidligere rapport [25]. Overlevelsesintegralen [56] for hver aldringskultur ble definert som arealet under overlevelseskurvene [25,57]. Dataene ble analysert ved enveis variansanalyse (enveis ANOVA) og ble uttrykt som gjennomsnittsverdier ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Betydningen av forskjell(* s<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">
5. Konklusjoner
Som konklusjon viste neohesperidin, med en relativt høy kapasitet for å fjerne intracellulær ROS, stort potensiale for å utvide CLS av spirende gjær BY4742 individuelt eller synergistisk med hesperetin. Dette kan føre til nye valg for behandling av aldringsproblemer siden det var et begrenset forhold mellom CLS-utvidelsen av gjær og de testede indeksene (f.eks. ROS-rensende evne, in vitro antioksidantaktivitet og den ekstracellulære pH). Ytterligere studier for å oppdage de molekylære mekanismene til dette fenomenet vil være ekstremt fordelaktige for å forhindre aldring. På grunn av dette bør viktigheten av å velge den beste kombinasjonen av flavonoider tas i betraktning når du designer nye kosttilskudd eller funksjonell mat.
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2019, 24, 4093; doi:10.3390/molecules24224093 www.mdpi.com/journal/molecules