Konstruksjonen av rekombinant Lactobacillus Casei-vaksine av PEDV og dens immunrespons i mus

Abstrakt

Bakgrunn: Porcin epidemisk diaré (PED) er en smittsom tarmsykdom forårsaket av svinepidemidiaréviruset (PEDV) preget av oppkast, diaré, anoreksi og dehydrering, som har forårsaket enorme økonomiske tap rundt om i verden. For tiden er vaksineimmunitet fortsatt den mest effektive metoden for å kontrollere spredningen av PED-er. I denne studien har vi konstruert en ny rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS-stamme som uttrykker PEDVS-proteinet til PEDV og OMP16-proteinet fra Brucella abortus-stammen. For å vite immunogenisiteten til den rekombinante L. casei-OMP16-PEDVS-kandidatvaksinen, ble den sammenlignet med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS og BL21-PEDVS rekombinant protein.

Resultater: Resultatene viste at vi kunne oppdage høyere nivåer av IgG, nøytraliserende antistoff, IL-4, IL-10 og INF- i serum og IgA i avføring av L. casei-OMP16- PEDVS-immuniserte mus, som indikerte at L. casei-OMP16-PEDVS-kandidatvaksine kunne indusere høyere nivåer av humoral immunitet, cellulær immunitet og slimhinneimmunitet.

Konklusjon: Derfor er L. casei-OMP16-PEDVS en lovende vaksinekandidat for profylakse av PEDV-infeksjon.

Nøkkelord: PEDV, Lactobacillus casei-vaksine, PEDV S-protein, OMP16, Immunresponser

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Introduksjon

Porcin epidemisk diaré (PED) er forårsaket av svinepidemi diarévirus (PEDV) med symptomer som diaré, oppkast, anoreksi, dehydrering og vekttap hos smågriser [1, 2]. Griser i alle aldre kan bli smittet med forskjellige symptomer og dødeligheten hos smågriser er opptil 100 % [3], noe som har ført til store økonomiske tap over hele verden. For å kontrollere spredningen av PEDV, er de fleste typer vaksiner konstruert, slik som aluminiumhydroksid-adjuvant inaktivert vaksine, bivalent inaktiv stemt overførbart gastroenterittvirus (TGEV), og PEDV-vaksine, og svekket PEDV-vaksine [4]. Selv om disse vaksinene spiller en viktig rolle i å kontrollere PED-er, har de alle sine defekter. Inaktiverte vaksiner kan ikke aktivere cellulære immunresponser, svekket vaksine er ikke særlig trygg, og de kan ikke indusere tilstrekkelig produksjon av virusspesifikke IgA-antistoffer av slimhinneimmunresponser. Derfor er det nødvendig og presserende å utvikle en ny vaksine for å kontrollere PED.

Lactobacillus casei anses ofte for å være et slags trygt vektorsystem for målrettet levering av antigener ved oral immunisering, med gunstige effekter på helsen til mennesker og dyr [5]. I mellomtiden kan det brukes som et leveringssystem for å regulere T-hjelpercelleresponsen og stimulere utskillelsen av spesifikke IgAer for slimhinneimmunitet [6]. På den annen side er den rekombinante Lactobacillus casei-vaksinen lettere å administrere, mindre sjanse for overfølsomhetsreaksjon og er mer kostnadseffektiv sammenlignet med tradisjonelle vaksiner. Basert på rapportene har rekombinante Lactobacillus casei-vaksiner blitt brukt i forebygging og kontroll av humant papillomavirus, Streptococcus pneumoni og Escherichia coli [7–9]. Det er også noen lignende forsøk på å designe PED-vaksiner. Forskerne fant at en rekombinant Lactococcus lactis-stamme som uttrykker et variant av svinepidemi-diarévirus S1-genet kunne indusere høye nivåer av IL-4 og IFN- i immuniserte mus [10]. Lactobacillus casei-basert anti-PEDV-vaksine som uttrykker mikrofold cellemålrettet peptid Co1 smeltet sammen med COE-antigenet til PEDV kan også indusere en effektiv immunrespons [11]. For å forbedre effektiviteten til PEDV-vaksinen. I denne studien konstruerer vi en ny Lactobacillus casei rekombinant vaksine av PED, som kan stimulere sterkere slimhinner, humorale og cellulære immunresponser mot PEDV-infeksjon via oral administrering. PEDV, et medlem av coronaviridae-familien, består av fire strukturelle proteiner som inneholder 150–220 kDa glykosylert spike (S) protein, 20–30 kDa membran (M) protein, 7 kDa konvolutt (E) protein, 58 kDa nukleokapsid (N) protein [12]. Der kan S-proteinet deles inn i S1 (1–735 aminosyre) og S2 (736-siste aminosyre) domener [13], og S1-proteinet inkluderer den reseptorbindende regionen og de viktigste nøytraliserende epitopene [ 14]. Vaksineadjuvans fungerer som en immunmodulator og kan indusere og forsterke immunresponser mot samtidig leverte antigener. OMP16-protein fra Brucella abortus-stammen ble bekreftet for å aktivere dendrittiske celler in vivo, indusere en th1-immunrespons, og var en lovende selvadjuvant vaksine [15–17]. Derfor ble OMP16-proteinet satt inn i Lacto bacillus case rekombinant vaksine i vår studie. Så langt er det rapportert få studier om Lactobacillus casei rekombinante vaksinen av PEDV. Derfor har denne studien som mål å konstruere en ny Lactobacillus casei-kandidat oral vaksine, som kan gi bedre humoral immunitet, cellulær immunitet og slimhinneimmunitet for å forhindre spredning av PED.

Kinesisk urt cistanche plante-Antitumor

Materialer og metoder

Bakteriestammer, virus, kulturbetingelser, plasmider og primere

Cistanche pulver

Bakteriestammene, plasmidene og primerne som ble brukt i denne studien er oppført i tabell 1. Standard referansestammen av Lactobacillus casei ATCC 393 ble dyrket i de Man Rogosa og Sharpe (MRS) buljong ved 37 grader [18]. BL21 (DE3) og DH5 ble dyrket i Luria-Bertani (LB) medium ved 37 grader [19]. De rekombinante Lactobacil lus casei-, BL21 (DE3)- og DH5-stammene ble dyrket i det tilsvarende mediet med henholdsvis riktig antibiotika. Brucella abortus ble dyrket i Tryptic Soy Broth (TSB) eller Tryptic Soy Agar (TSA) medium (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) ved 37 grader. Vero-cellene infisert med PEDV-stammer ble dyrket i DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) supplert med 10 ug/mL trypsin (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. pVE5523- og pET28a (+)-plasmidene var ekspresjonsvektorer av henholdsvis Lactobacillus casei og Escherichia coli.

Tabell 1 Kjennetegn på bakteriestammer, plasmider og primere brukt i denne studien

Konstruksjonen av rekombinante Lactobacillus casei og BL21 stammer

De rekombinante ekspresjonsplasmidene ble konstruert basert på plasmidene og primerne i tabell 1. Først ble delsekvensen til PEDV S-genet (493–708 aminosyrer), delsekvensen til PEDV S'-genet (493–708 aminosyrer), og den delvise sekvensen til Brucella abortus OMP16-genet (26–168 aminosyrer) ble amplifisert ved å bruke henholdsvis primerparene PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 og OMP16-F/R. Deretter ble overlappingsutvidelsesmetoden brukt i OMP16- og PEDVS-fragmenter for å konstruere et nytt fragment OMP16-PEDVS med linkerpolypeptid (GGGGSGGGGGGGGGGS) fast i midten. Deretter ble fragmentene PEDVS satt inn i pET28a-plasmidet med EcoRI/Xbal-restriksjonsenzymer for å generere rekombinant plasmid pET28a-PEDVS, og de nye fragmentene OMP16-PEDVS ble satt inn i pET28a og pVE5523/XbaI EcoVRI og pVE5523/XbaI EcoVRI og restriksjonsenzymer for å generere henholdsvis rekombinant plasmid pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS. De rekombinante plasmidene (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS) ble transformert til BL21 (DE3) eller Lactobacillus casei ATCC393 ved transformasjon eller elektroporering det rapporterte papiret [21].

Analyse av proteinuttrykk ved Western blot

Proteinekspresjonen til BL21-pET28a-PEDVS-, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS- og L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS-stammer var oppdaget basert på den rapporterte metoden med noen modifikasjoner [21–23]. De rekombinante stammene BL21-pET28a-PEDVS og BL21-pET28a OMP16-PEDVS ble dyrket i LB-buljong og IPTG ble brukt til å høste til pET28a-PEDVS og pET28a-OMP{{22} } PEDVS-proteiner. Blankvektoren ble brukt som en negativ kontroll. Etter cellelyse og sentrifugering ble supernatanten og sedimentet samlet. Deretter ble målproteinene renset ved å bruke nikkelaffinitetskromatografikolonnen basert på forrige studie [24]. I mellomtiden ble den kulturelle supernatanten til den rekombinante L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-stammen også høstet ved sentrifugering ved 9000×g i 10 minutter ved 4 grader. Deretter ble prøvene med natriumdodecylsulfat (SDS) belastningsbuffer kokt i 10 minutter. Proteinene ble separert med 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til PVDF-membraner (Millipore, Mississauga, ON, Canada). Membraner ble blokkert med 5 % skummet melk i 2 timer ved 37 grader og deretter inkubert med murint monoklonalt antistoff av S-protein over natten ved 4 grader og HRP-konjugert geit-anti-mus IgG (ABclonal, Wuhan, Kina) i 2 timer kl. 37 grader. Proteinbåndene ble visualisert ved bruk av Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Vaksinasjon og prøvetaking

Immunogenisiteten til rekombinant Lactobacillus casei-vaksine ble evaluert ved bruk av seks uker gamle hunnspesifikke patogenfrie (SPF) BALB/c-mus [10, 18], som ble kjøpt fra Shandong Agricultural University dyresenter. Totalt 50 mus ble tilfeldig delt inn i 5 grupper med 10 mus i hver gruppe. Musene ble immunisert med henholdsvis rekombinant Lactobacillus casei-vaksine og renset protein (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freunds komplette adjuvans. Immuniseringsprotokollen ble utført basert på tabell 2 og en boosterimmunisering ble gitt etter 13 dager. For den serologiske studien ble serum samlet 0, 14 og 28 dager etter immunisering (dpi) via halevenestansing og lagret ved -20 grader frem til bruk. Avføring ble samlet 1 dag før vaksinasjon og hver boostingstid. For IgA-deteksjon ble avføring fortynnet (w/v) med 0,05 M natrium EDTA ved 1:4-forhold like etter oppsamling og inkubert i 14 timer ved 4 grader etter riktig blanding. Supernatanten ble samlet ved 12,000×g sentrifugering og oppbevart ved -20 grader frem til bruk. Ved 28. dpi; tre mus fra hver gruppe ble avlivet og tarmen ble behandlet for IgA-deteksjon ifølge forfatteren beskrevet tidligere [10, 18, 23].

Bestemmelsesanalyse av antistoffnivåer

Nivåene av IgG i sera og IgA i feces ble målt med ELISA-metodene med noen modifikasjoner [18, 23]. Metodene var som følger: Polystyren-mikrotiterplater ble belagt over natten ved 4 grader med 100 μL 10 ug/mL PEDVS-protein, OMP16-PEDVS-protein eller 100 μL rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS-stamme . Etter blokkering med 5 % skummet melk ble de innsamlede prøvene seriefortynnet i PBS, tilsatt i tre eksemplarer og inkubert ved 37 grader i 1 time. Deretter ble et HRP-konjugert geit-anti-muse-IgG- eller IgA-antistoff (Invi trogen, USA) tilsatt til hver brønn (1:5000) og inkubert i 1 time ved 37 grader. Polystyren-mikrotiterplatene ble vasket 5 ganger i løpet av hvert trinn. Til slutt ble 100 μL TMB-substrat (tetrametylbenzidin og H2O2) tilsatt til hver brønn og 50 μL stoppløsning ble tilsatt etter 10 minutter. OD-verdiene ved 630 nm ble målt ved bruk av en multimodus plateleser (EnVision).

Virusnøytraliseringsanalyser

De nøytraliserende antistofftitrene til PEDV i sera ble undersøkt i henhold til metodene med noen modifikasjoner [25, 26]. Kort fortalt ble det murine serumet varmeinaktivert (56 grader i 30 minutter) og deretter seriemessig to ganger fortynnet i 96-brønns plater (Corning, USA) med triplikater av hver prøve. Deretter ble et likt volum på 200 TCID50 / 50 μL PEDV-stammer tilsatt til 96-brønners plater og inkubert i 1 time ved 37 grader. Blandingen ble tilsatt nye 96-brønners plater belagt med Vero celle monolag og inkubert i 1 time ved 37 grader. Cellene ble deretter vasket og inkubert i vedlikeholdsmediet ved 37 grader i 5 % CO2. Etter 2 dager ble den cytopatiske effekten (CPE) observert ved bruk av et invertert mikroskop, og den nøytrale størrelseskonsentrasjonen ble definert som den laveste konsentrasjonen av antistoffer i serumet.

Tabell 2 Immunprotokollen til BALB/c-mus

Cytokin påvisning

For å påvise sekresjonen av cytokiner ble supernatanter hentet fra laboratoriemusene (0, 14 og 28 dager). Nivåer av utskilt IL-4, IL-10 og IFN- ble bestemt ved bruk av kommersielle ELISA-sett (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) i henhold til produsentens anbefalinger. Cytokin ble kvantifisert fra de forskjellige standardkurvene fremstilt fra standardreagenser levert av settene henholdsvis, og verdien for optisk tetthet (OD) ble detektert ved 450 nm fra hver plate ved bruk av en multimodus plateleser (EnVision) [23, 27].

Statistisk analyse

Alle data ble hentet fra minst tre uavhengige eksperimenter, og resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Den statistiske analysen ble utført ved å bruke to-halede t-tester og enveisanalyse i Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., USA). Den signifikante forskjellen ble definert som ∗ p < 0.05, og de ulike gradene av signifikant forskjell ble betegnet som ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ og p < 0,001, henholdsvis.

Resultater

Verifikasjonen av rekombinante Lactobacillus casei og BL21 stammer

For å verifisere de konstruerte rekombinante plasmidene ble de rekombinante ekspresjonsplasmidene pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS spaltet ved bruk av NcoI/XhoI-restriksjonsenzymer, og enzymfordøyelsesresultater ble vist i fig. 1. Størrelsene på målbåndene i elektroforetogrammer var de samme som de forventede resultatene og sekvenseringsresultater indikerte at de rekombinante ekspresjonsplasmidene ikke viste noen mutasjon. Disse resultatene indikerte vellykket konstruksjon av pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS rekombinante plasmider. Resultatene av western blot viste at de rekombinante proteinene pET28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS ble uttrykt i supernatanten av BL21-pET28a OMP16-PEDVS og BL21- pET28a-PEDVS-stammer, henholdsvis. pVE5523-OMP16-PEDVS-proteinet ble også verifisert i den kulturelle supernatanten til L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS-stammen. De spesifikke båndene fra fig. 2 viste at de rekombinante proteinene pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS alle ble høstet vellykket (fig. 2).

Fig. 1 Enzymfordøyelsesresultatene av rekombinante plasmider. A: Enzymfordøyelsesresultatene til pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmidet. M: D8000 DNA-stigemarkør; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmid. B: Enzymfordøyelsesresultatene til pet28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS plasmid. M: D8000 DNA-stigemarkør; 1: pet28a-OMP16-PEDVS-plasmid; 2: pET28a-PEDVS-plasmid

IgG-antistoffnivåene i serumet til mus immunisert med kandidatvaksiner

For å evaluere den spesifikke immunogenisiteten til genererte vaksinekandidater, ble BALB/c-mus valgt og delt inn i 5 grupper. Deretter ble nivåene av IgG i serumet og IgA i avføringen målt med kommersielle ELISA-sett. Resultatene viste at det ikke var noen vesentlige forskjeller i IgG-nivåer blant de vaksinerte gruppene, og nesten ingen IgG-antistoff ble funnet i alle mus før immunisering. Imidlertid ble det senere funnet betydelige forskjeller etter den første vaksinasjonen, og IgG-antistoffnivået i serum etter 28 dager var høyere enn etter 14 dager. Blant 5 gruppemus viste musene immunisert med L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F lignende og høyeste immunogenisitet. Derfor kan L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F produsere den høyeste immunogenisiteten, etterfulgt av BL21-OMP16- PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 3).

cistanche supplement fordeler-øke immunitet

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IgA-antistoffnivåene i avføring fra mus immunisert med kandidatvaksiner

For å evaluere den spesifikke immunogenisiteten til genererte vaksinekandidater, ble nivåene av IgA-antistoffer i avføringen til mus også evaluert. Resultatene viste at det ikke fantes noe spesielt anti-PEDVS IgA-antistoff før immunisering. Men store mengder IgA-antistoff i avføring av L. casei-OMP16-PEDVS-immuniserte mus BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS og BL21-PEDVS gruppemus 14 dager etter immunisering. 28 dager etter immunisering nådde IgA-antistoffnivåene av L. casei-OMP16-PEDVS-immuniserte mus sitt høyeste maksimum. I mellomtiden ga ikke IgA-antistoffnivåene i de tre andre gruppene en åpenbar økning. Derfor kan kandidatvaksinen L. casei OMP16-PEDVS stimulere høyere nivåer av antistoff i immuniserte mus sammenlignet med BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS- og BL21- PEDVS-immuniserte mus (fig. 4).

Fig. 2 Verifikasjonen av rekombinante ekspresjonsproteiner. M: proteinmarkør; 1: den sekretoriske proteinformen rekombinant L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-stamme; 2: det rensede proteinet fra BL21- pET28a-OMP16-PEDVS-stamme; 3: det rensede proteinet fra BL21-pET28a-PEDVS-stammen

Nøytraliserende antistoffnivåer av serum i immuniserte mus

For å evaluere den beskyttende effekten av kandidatvaksiner av L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , og BL21-PEDVS i mus, ble de nøytraliserende antistoffnivåene målt. Resultatene viste at det ikke ble påvist noe nøytraliserende antistoff før immunisering. Nøytraliserende antistoff ble påvist 14 dager etter immunisering og økte 14 dager etter boosterimmunisering. Antistoffresponsen hos mus som mottok L. casei-OMP16-PEDVS hadde en sterkere anti-PEDV-nøytraliserende aktivitet enn hos mus som ble administrert oralt med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Derfor kan kandidatvaksinen L. casei OMP16-PEDVS stimulere det høyeste nøytraliserende antistoffnivået, etterfulgt av BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 5).

Cytokinnivåer

For å sammenligne det cellulære immunresponsnivået til L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, og BL21-PEDVS-immuniserte mus, henholdsvis IL- 4, IL-10 og IFN- ble bestemt. Resultatene viste at nivåene av cytokinene IL-4, IL-10 og IFN- i sera fra mus alle var svært lave og hadde ingen signifikant forskjell før immunisering. Mens lignende endringer ble observert i resultatene av IL-4, IL-10 og IFN-. 14 dager etter immunisering var nivået av IL-4, IL-10 og IFN- i L. casei-OMP16-PEDVS im-immuniserte mus høyere enn BL21- OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS immuniserte mus. 14 dager etter boosterimmuniseringen ble det påvist et høyere IL-4-, IL-10- og IFN-nivå i L. casei-OMP16- PEDVS-immuniserte mus sammenlignet med det hos andre tre grupper. Derfor kan kandidatvaksinen L. casei-OMP16-PEDVS stimulere de høyeste IL-4-, IL-10- og IFN-nivåene, etterfulgt av BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 6).

Fig. 3 IgG-antistoffnivåene av kandidatvaksiner i serumet til immuniserte mus. Serum ble samlet på dagene 0, 14 og 28 dager før eller etter immunisering undersøkt via kommersielle ELISA-sett, og målt ved en absorbans på 450 nm. Søyler representerer gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. * p < 0.05, ** p < 0,01 og **** p < 0,0001 representerer henholdsvis økende grader av signifikante forskjeller, og ns betyr ingen signifikant forskjell

Diskusjon

Et storstilt utbrudd av PED forårsaket av PEDV-varianter skjedde i oktober 2010, som har resultert i enorme økonomiske tap i Kina og over hele verden [1]. Imidlertid er tradisjonelle vaksiner alle designet basert på den klassiske stammen CV777 som ikke kan gi tilstrekkelig beskyttelse til PEDV-varianten [4]. For å kontrollere spredningen av PEDV og redusere økonomiske tap, er det også utviklet nye vaksiner av PEDV-varianter. For tiden er den PEDV-inaktiverte vaksinen og den svekkede vaksinen av PEDV-variantstammer alle godkjent av den kinesiske regjeringen, og alle har lovende utsikter til å kontrollere PED. Men defekter finnes også i de to typene nye vaksiner. PEDV infiserer svin gjennom fordøyelseskanalen og har tarmvevstropisme. Derfor er slimhinneimmunitet mer effektiv enn systemisk immunitet for å hindre PEDV-inntrengning i tarmepitelceller, og vaksiner må gi slimhinnebeskyttelse effektivt i tarmkanalen. Så i denne studien konstruerer vi en ny type vaksine som kan stimulere sterkere anti-PEDV-spesifikke IgG- og IgA-antistoffer. Lactobacillus casei har potensielle immunmodulerende egenskaper som en vaksineleveringsvehikel, og ekspresjonen av bioaktive forbindelser på celleveggen til denne bakterien kan stimulere passende immunresponser [28, 29]. Det er mye brukt for å uttrykke flere heterol ogøse antigener av humant papillomavirus, Streptococcus pneumonia og Escherichia coli som vaksiner i dyremodeller, som alle viste utmerket immunogenisitet [7-9]. Sammenlignet med den inaktiverte vaksinen og den svekkede vaksinen, kan Lactobacillus casei vektorvaksinen også stimulere høyere IgA-nivåer og cellulær immunrespons. Studier har vist at IgAs første forsvarslinje i tarmen ville være bedre enn IgG for å beskytte smågriser mot PEDV-infeksjon [10, 30]. Derfor er det lovende å utvikle en slags Lactobacillus casei vektorvaksine av PED. Basert på rapportene, kan S-proteinet til PEDV deles inn i S1 (1–735 aminosyre) og S2 (736-siste aminosyre) domener [13], og S1-protein inkluderer den reseptorbindende regionen og hovednøytraliserende epitoper [14]. Den kjernenøytraliserende epitopen (COE) kan indusere sterke nøytraliserende antistoffer mot PEDV [31, 32]. Kombinert med antigenisitetsanalysen ble en delsekvens av S1-genet (1477–2124 bp) valgt for å konstruere det rekombinante plasmidet. Det valgte lille fragmentet ble bevist å ikke bare ha god immungenisitet, men også bidra til det utskilte uttrykket av Lactobacillus casei. På den annen side fant Pasquevich at Brucella abortus ytre membranprotein 16 kunne aktivere dendrittiske celler in vivo, induserer en th1-immunrespons og var en lovende selvadjuvant vaksine mot systemisk og oral ervervet brucellose [15]. Lignende forskning som ulipidert ytre membranprotein omp16 fra Brucella spp. som en nasal adjuvans kunne indusere en th1-immunrespons og modulere den th2-allergiske responsen på kumelkproteiner, ble også bevist [16]. Derfor ble en delvis sekvens av omp16-genet valgt for å konstruere rekombinant plasmid for å forbedre immunfunksjonen i vår studie. For å vite om den nye Lactobacillus casei anbefalte vaksinen kunne indusere humorale immunresponser, ble IgG-, IgA- og nøytraliserende antistoffnivåer målt. IgG-antistoffnivået til L. casei-OMP16- PEDVS rekombinant vaksineimmuniserte mus hadde ingen signifikant forskjell med BL21-OMP16-PEDVS-F rekombinant vaksineimmuniserte mus. Imidlertid var nivåene av IgA og nøytraliserende antistoffer høyere enn i BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S og BL{{47 }}PEDVS rekombinante vaksine-imiserte mus. Resultatene viste at L. casei-OMP16-PEDVS kunne indusere sterkere humorale immunresponser, spesielt IgA-antistoffnivåer. Studier har vist at IgA er den første forsvarslinjen i tarmen og vil være bedre enn IgG når det gjelder å beskytte smågriser mot PEDV-infeksjon [30]. Forskningen bekreftet også resultatet at L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaksine kunne gi bedre immunologisk beskyttelse til PEDV. For å utforske typen immunrespons indusert av rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS, ble nivåene av IL-4, IL-10 og IFN- påvist for å evaluere aktiviteten til T lymfocytter. Basert på rapporten, spiller IFN- en viktig rolle i den cellulære immunresponsen forårsaket når patogener invaderer kroppen, IL-4 spiller en viktig rolle i den humorale immunresponsen og fremmer immuntoleranse og slimhinneimmunitet [33], IL -10 spiller viktige roller i kampen mot mikrobiell slimhinneinfeksjon og opprettholdelse av slimhinnebarriereintegritet i tarmen [34]. I mellomtiden viste resultatene av cytokindeteksjon at musene immunisert med L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaksine kunne indusere sterkere ekspresjon av IL-4, IL-10 og IFN-, som støttet resultatene om at L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaksine kunne indusere henholdsvis sterkere humoral immunrespons, IgA-antistoffnivå og cellulær immunrespons.

Fig. 5 Nøytraliserende antistoffnivåer av kandidatvaksiner i serumet til immuniserte mus. Serum ble samlet på dagene 0, 14 og 28 dager før eller etter immunisering og undersøkt via nøytraliseringstest. Søyler representerer gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. * p < 0.05, ** p < 0.01 og **** p < 0.0001 representerer henholdsvis økende grader av signifikante forskjeller, og ns betyr ingen signifikant forskjell

Fig. 6 Påvisning av cytokinnivåer fra serum fra immuniserte mus. Serum ble samlet på dagene 0, 14 og 28 dager før eller etter immunisering og undersøkt via kommersielle ELISA-sett. Absorbansverdien ble målt ved en absorbans på 450 nm for henholdsvis IL-4 (a), IL-10 (b) og IFN- (c). Søyler representerer gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. * p < {{10}}.05, ** p < 0.01 og **** p < 0.0001 representerer henholdsvis økende grad av signifikante forskjeller

Konklusjon

Oppsummert, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL{{7 }}PEDVS-kandidatvaksiner ble konstruert i denne studien. I mellomtiden ble den humorale immunresponsen og cellulære immunresponsnivåene til disse kandidatvaksinene hos mus evaluert. Resultatene viste at musene immunisert med L. casei-OMP16-PEDVS kunne produsere høyere nivåer av IgG, IgA, nøytraliserende antistoff, IL-4, IL- 10 og INF- sammenlignet med musene immunisert med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Derfor kan den rekombinante L. casei OMP16-PEDVS-kandidatvaksinen etablere grunnlaget for utviklingen av en sikker, effektiv og praktisk rekombinant slimhinnevaksine for profylakse av PEDV-infeksjon.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Referanser

1. Wang D, Fang L, S X. Porcin epidemisk diaré i Kina. Virus Res. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. En immunhistokjemisk undersøkelse av svinepidemidiaré. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Utbruddet av svinepidemidiaré hos diende smågriser, Kina. Emerg Infect Dis. 2012; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Utvikling av en bi-kombinert svekket vaksine mot overførbart gastroenterittvirus og svinepidemidiarévirus. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Potensialet til Lactobacillus som bærer for oral immunisering: utvikling og foreløpig karakterisering av vektorsystemer for målrettet levering av antigener. J Biotechnol. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Bioteknologi: De immunmodulerende effektene av melkesyrebakterier for å forbedre immunfunksjoner og fordeler. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. Oral immunisering med en Lactobacillus casei-vaksine som uttrykker humant papillomavirus (HPV) type 16 E7 er en effektiv strategi for å indusere mukosale cytotoksiske lymfocytter mot HPV16 E7. Vaksine. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. Nasal immunisering av mus med Lactobacillus casei som uttrykker pneumokokkoverflateprotein A: induksjon av antistoffer, komplementavsetning og delvis beskyttelse mot Streptococcus pneumoniae-utfordring. Mikrober infiserer. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. Immunisering med rekombinante Lactobacillus casei-stammer som produserer K99 og K88 fimbrial protein beskytter mus mot enterotoksigen Escherichia coli. Vaksine. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. Konstruksjon av en rekombinant lactococcus lactis-stamme som uttrykker en variant av svinepidemi diarévirus S1-gen og dets immunogenisitetsanalyse i mus. Viral Immunol. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Oral immunisering med en Lactobacillus casei-basert anti-porcin epidemisk diarévirus (PEDV) vaksine som uttrykker mikrofold cellemålrettende peptid Co1 fusjonert med COE-antigenet til PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Sekvensanalyse av porcin epidemisk diarévirusgenom mellom nukleokapsid- og spikeproteingenene avslører en polymorf ORF. Virologi. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Heterogenitet i piggproteingener av svinepidemidiarévirus isolert i Korea. Virus Res. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. Spikeproteinregionen (aa 636789) av det svinepidemidiaréviruset er avgjørende for induksjon av nøytraliserende antistoffer. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. Proteindelen til Brucella abortus ytre membranprotein 16 er et nytt bakteriepatogen-assosiert molekylært mønster som aktiverer dendrittiske celler in vivo, induserer en Th1-immunrespons og er en lovende selvadjuvanserende vaksine mot systemisk og oral ervervet brucellose. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. Ulikvidert ytre membranprotein Omp16 (U-Omp16) fra Brucella spp. som nasal adjuvans induserer en Th1-immunrespons og modulerer den Th2-allergiske responsen på kumelkproteiner. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Immunitet: Immunisering med rekombinant Brucella-art ytre membranprotein Omp16 eller Omp19 i adjuvans induserer spesifikke CD4+ og CD8+ T-celler samt systemisk og oral beskyttelse mot Brucella abortus-infeksjon. Infisere Immun. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. Oral rekombinant Lactobacillus-vaksine rettet mot intestinale mikrofoldceller og dendrittiske celler for å levere den kjernenøytraliserende epitopen til svinepidemi-diarévirus. Mikrobcellefabrikker. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Heterologt uttrykk og biokjemisk karakterisering av assimilerende nitrat- og nitrittreduktase avslører tilpasning og potensial for Bacillus megaterium NCT-2 i sekundær saliniseringsjord. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 undertrykker veksten av svinepidemi-diarévirus in vitro via direkte binding til viruset. Virus. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Bioteknologi: karakterisering av pMC11, et plasmid med doble replikasjonsorigo isolert fra Lactobacillus casei MCJ og konstruksjon av skyttelvektorer med hvert replikon. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. Oral levering av probiotika som uttrykker dendritisk cellemålrettet peptid smeltet sammen med porcin epidemisk diarévirus COE-antigen: en lovende vaksinestrategi mot PEDV. Virus. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. Konstruksjonen av rekombinant Lactobacillus casei som uttrykker BVDV E2-protein og dets immunrespons hos mus. J Biotechnol. 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Utstyr B. Optimalisering av ekspresjon og rensing av rekombinant S1-domene av porcin epidemisk diarévirus spike (PEDV-S1) protein i Escherichia coli. Bioteknologi Bioteknologiutstyr. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Cellebindingsdomener til piggproteinet fra svinepidemien diarévirus er nøkkelmål for nøytraliserende antistoffer. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. Oral administrering av belagte PEDV-lastede mikrosfærer fremkalte PEDV-spesifikk immunitet hos avvente smågriser. Vaksine. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Effekter av svinepidemi-diarévirus på monocyttavledede dendritiske celler fra svin og dendritiske tarmceller. Vet Microbiol. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Immunmodulerende og antiinflammatorisk aktivitet indusert ved oral administrering av en probiotisk stamme av lactobacillus casei. Betennelse. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Beskyttelse mot tetanustoksin etter intragastrisk administrering av to rekombinante melkesyrebakterier: virkningen av stammens levedyktighet og in vivo persistens. Vaksine. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Oral effekt av Vero-celle-attenuert svinepidemi-diarévirus DR13-stamme. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. S1-domene av svinepidemien diarévirus spike protein som et vaksineantigen. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. Celler: Identifikasjon av epitopområdet som er i stand til å indusere nøytraliserende antistoffer mot det svinepidemidiarévirus. Mol Cell. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. Differensielle bidrag fra B7–1 og B7–2 til utviklingen av murin eksperimentell allergisk konjunktivitt. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 undertrykker infeksjonen av porcine enteriske koronavirus og rotavirus ved å aktivere STAT3-signalveien. Antivir Res. 2017;142:68–75.